全 文 ：收稿日期:2007-04-28;修回日期:2007-06-28
基金项目:国家自然科学基金(30000032;30270331)
作者简介:孔杨(1980-),男 , 陕西西安人 , 硕士研究生
通讯作者:鲍锦库.E-mail:baojinku@yahoo.com.cn
文章编号:　0490-6756(2008)06-1513-06
温度 、酸碱度和变性剂对黄花石蒜凝集素
活性和构象的影响
孔　杨1 , 彭　沥2 , 陈　胜1 , 田　勤1 , 鲍锦库1
(1.四川大学生命科学学院 , 成都 610064;2.成都军区联勤部门诊部 , 成都)
摘　要:采用荧光光谱研究了不同温度 、pH 和变性剂对黄花石蒜凝集素(Lycoris aurea agglu-
tinin ,简称 LAA)凝血活性和分子构象的变化关系 ,结果表明:LAA 具有较强的温度和酸碱度
的耐受性 ,经过 3种变性剂的处理都能使 LAA 分子构象发生不同程度的变化并导致活性的丧
失 ,浓度为6 mol/L 的盐酸胍和脲 ,20 mmol/ L 的SDS可以使 LAA完全丧失凝血活性 ,荧光光
谱的变化表明了这种变性过程具有阶段性.
关键词:黄花石蒜凝集素(LAA);温度;pH 值;变性剂;荧光光谱
中图分类号:Q51　　　文献标识码:A
The effect of temperatures , pH and denaturants on the conformation and
biological activity of Lycoris aurea agglutinin
KONG Yang1 , PENG Li 2 , CHEN Sheng1 , TIAN Qin 1 , BAO J in-Ku1
(1.College of Life Sciences , Sichuan University , Chengdu 610064 , China;
2.Clinic of Joint Logistics Department , The Chengdu M ilitary A rea , Chengdu)
Abstract:Fluorescence spectra(FR)was used to elucidate the relat ionship betw een the activity and molecular
conformation of Lycoris aurea agglutinin (LAA)under different Temperature , pH value and denaturation.
The results show ed that LAA was stable in various temperature and pH between pH 4 ～ 12 and below 80 ℃.
The conformation changes of LAA in the presence of dif ferent concentration GuHCl , urea and SDS were in-
vestigated by measurements of fluorescence spect ra(FR), and compared with the activity changes.The results
also revealed that there were two steps during the denaturat ion.
Key words:Lycoris aurea agg lutinin(LAA), temperature , pH value , denaturation , fluorescence spectra
1　引　言
凝集素是一类结构各异的非免疫源性的专一
性糖结合蛋白质或糖蛋白.它们在自然界广泛存
在 ,几乎所有生物体中都发现有凝集素存在[ 1] .单
子叶植物甘露糖结合凝集素已经在不同领域引起
了越来越多的关注 ,尤其是近来其抗病毒活性 、抗
虫特性和免疫缺陷病毒方面的研究 ,使得单子叶甘
露糖结合凝集素的研究意义更加突出[ 2 , 3] .
黄花石蒜凝集素(Lycoris aurea aggultin)是从
单子叶植物黄花石蒜的球茎中分离得到的一种甘
露糖结合凝集素[ 4] ,本文研究不同温度 、酸碱度和
不同变性剂的条件对凝集素活性的影响 ,并结合荧
光光谱研究其构象的变化 ,以揭示其构象和活性变
2008年 12月 　
第 45卷第 6期　
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
　 Dec.2008
Vol.45　No.6
化的关系.
2　材料与方法
2.1　材　料
黄花石蒜球茎采于四川青城山;新鲜兔血细胞
购自市场 ,先用生理盐溶液离心 3 次 ,再用相同溶
液配成 2%的血球悬液备用.丙烯酰胺和甲叉双丙
烯酰胺分别为 Sigma和 Fluka公司产品;十二烷基
磺酸钠(SDS)为 Merk 产品 ,盐酸胍(GnHCl)购自
上海化学试剂厂;其它试剂均为国产分析纯 ,所用
溶液均以双蒸水配制.
2.2　方　法
2.2.1　黄花石蒜凝集素的纯化　黄花石蒜凝集素
按照文献[ 4]的方法纯化 ,用聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)进行纯度检测为单一蛋白带.
2.2.2　血凝活力的检测　按照文献[ 5] 方法进行
测定.在“V”型血凝板中每孔加 25 μL 生理盐水 ,
取25μL 凝集素溶液与等量的生理盐水作倍比稀
释 ,然后加 25 μL 2 %的兔红细胞 ,振荡后室温放
置2 h ,肉眼或显微镜观察结果.人的 A 、B 、AB 、O
型和鸡血细胞凝集作用测定方法与文献[ 6]相同.
2.2.3　荧光光谱的测定　考文献[ 7]的方法测定.
2.2.4　不同温度处理的 LAA的凝血活性和荧光
光谱的测定 　凝集素以生理盐水配制成 0.1×
10-3 g/mL ,在 20 ℃、40 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和
100 ℃处理 20 min后 ,冷却至室温 ,进行凝血活性
和荧光光谱的测定.
2.2.5　不同 pH 处理的 LAA 的凝血活性和荧光
光谱的测定　纯化的凝集素用不同 pH 的缓冲液
(pH 2.0的 KCl-HCl缓冲液 , pH 4.0和 6.0的柠
檬酸-柠檬酸钠缓冲液 , pH 10.0 的 NaHCO3 　
Na2CO3缓冲液和 pH 12的 KCl-NaOH 缓冲液)配
制成 0.1×10-3 g/mL ,放置过夜 ,进行凝血活性和
荧光光谱的测定.
2.2.6　不同变性剂处理的 LAA 凝血活性和荧光
光谱的测定　
(1)盐酸胍对 LAA 凝血活性和荧光光谱的影
响:生理盐水配制 0 ,0.5 mol/L ,1 , 3 mol/ L ,6 mol/
L盐酸胍溶液各 3 mL , 0.24 mg 凝集素样品溶于
其中 ,室温放置 2 h后 ,进行凝血活性和荧光光谱
的测定.
(2)不同浓度脲对 LAA凝血活性和荧光光谱
的影响:生理盐水配制0 mol/L , 2 mol/L ,4 mol/L ,
5 mol/L ,6 mol/L ,8 mol/L 脲各 3 mL ,0.24 mg 凝
集素样品溶于其中 ,室温放置 2 h 后 ,进行凝血活
性和荧光光谱的测定.
(3)不同浓度 SDS对 LAA凝血活性和荧光光
谱的影响:0.1 mol/L pH 9.0甘氨酸-氢氧化钠
缓冲液配制 0 , 1 mmol ,5 mmol , 10 mmol , 20 mmol
SDS 溶液 3 mL ,0.24 mg 凝集素样品溶于其中 ,室
温放置 5 min后测定凝血活性和荧光光谱.
3　结果与分析
3.1　LAA对血细胞凝集作用
凝血活性与血型专一性的测定结果表明 , LAA
只凝集兔红细胞 ,而对鸡血 ,人 A 、B 、O 和 AB型血
均不发生凝集反应;当凝集素浓度为 1.95×10-6
g/mL 时 ,即可使兔血球发生凝集反应.
3.2　天然态 LAA的内源荧光光谱
图 1　天然态 LAA 的内源荧光光谱
Fig.1　Intrinsic fluo rescence spectra of native LAA
曲线 1是以发射光谱中的 λmax(337.2 nm)为发射波长得到
LAA 的激发光谱 , λmax为 278 nm ;曲线 2是在 280 nm 波长激
发得到的 LAA 荧光发射光谱;曲线 3是以 295 nm 为激发波
长时的荧光发射光谱
图 1中表明 , LAA的荧光发射光谱有一个峰 ,
波长位于 337.2 nm处;295 nm处激发的荧光发射
峰远远小于 280 nm ,由于 295 nm 仅激发色氨酸
(Trp),用既能激发 Trp 又能激发酪氨酸(Ty r)的
280 nm 波长的激发光时 ,其最大荧光发射峰也在
337.2 nm 处 , LAA 的荧光发射光谱中观察不到
Tyr 残基的荧光 ,表明 Tyr 残基的荧光基本上通过
能量转移到 Trp上 ,表现为荧光强度增加[ 8] .和游
离色氨酸最大荧光发射峰位 348 nm 相比 ,295 nm
处的荧光最大发射峰为 337.2 nm ,蓝移了 10.8
nm ,说明 Trp周围的极性较弱 ,并未完全暴露于周
围溶剂中 ,而是屏蔽在一定的构象中 ,处于疏水的
微环境或 Trp的吲哚环有特殊的构象[ 9] .
1514 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
3.3　温度对 LAA凝血活性和荧光光谱的影响
不同温度下 LAA对兔血红细胞的凝集活性见
表 1.从表 1看出 ,随着温度的升高 , LAA的凝血活
性不断减弱 ,但是 100 ℃处理 20 min , LAA仍保留
60%的活性.说明 LAA 是一种对热比较稳定的凝
集素.温度对 LAA 的荧光光谱影响如图 2 , 经
40 ℃和 60 ℃处理的样品最大发射波长 λmax保持
不变 ,荧光强度增强 ,但其凝血活性无明显变化 ,说
明 LAA在这时的结构变化对凝血活性无影响.80
℃处理后 ,荧光强度明显增加 ,活性也下降 , λmax发
生了红移 ,表明这时 LAA 的结构发生了很大的变
化 ,Trp残基开始从相对疏水的环境中暴露出来 ,
活性中心也遭到一定程度的破坏.当温度到 100 ℃
时 ,荧光光谱强度又升高 ,活性进一步下降 ,表明这
时 LAA分子结构更松散 ,将发光基团暴露在溶液
中 ,但活性中心的破坏程度更严重.
图 2　不同温度下 LAA 的荧光光谱
Fig.2　The effect of temperature on the fluo rescence in-
tensify of LAA(excited at 295 nm)
1.100 ℃;2.80 ℃;60 ℃;
4.40 ℃;5.20 ℃
表 1　温度对 LAA 凝血活性的影响
Tab.1　Effect of temperature on hemagg lutination of LAA
温度
(℃)
LAA concentrat ion(×10-6 g/mL)
100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.1
25 + + + + + + + - - - -
40 + + + + + + + - - - -
60 + + + + + + + - - - -
80 + + + + + - - - - - -
90 + + + + + - - - - - -
100 + + + + - - - - - - -
“ +” 表示凝血(hemagglutination);“ -” 表示不凝血(no hemagglutination)
3.4　pH值 LAA凝血活性和荧光光谱的影响
pH对 LAA 凝血活性的影响见表 2 , 可以看
出 ,pH 在 6 ～ 10 之间 ,凝血活性没有变化;在 pH
分别为 4 ,12 h其凝血活性下降少许 ,表明 LAA具
有较强的耐酸碱性 ,且对碱耐受性强于对酸的耐受
性.不同 pH 下的荧光见图 3:从整个图谱来看 ,
LAA荧光光谱受 PH 影响不大 , λmax几乎没有改
变 ,只是不同的 pH 测得的荧光强度不同.中性条
件下荧光强度最大 ,当向酸碱两极变化时 LAA 荧
光强度逐渐降低 ,pH 为 12 h 达到最低 ,推测此时
LAA分子处于碱性环境中 ,其分子表面电荷发生
改变导致构象出现较大变化 ,但是活性变化不是很
明显 ,表明 LAA分子的构象虽然发生了一定变化
但并未对活性中心造成明显破坏.
表 2　pH 对 LAA凝血活性的影响
Tab.2　Effect of pH on hemagglutination of LAA
pH
LAA concentrat ion(×10-6 g/mL)
100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.1
2 H H H - - - - - - - -
4 + + + + + + - - - - -
6 + + + + + + + - - - -
7 + + + + + + + - - - -
9 + + + + + + + - - - -
12 + + + + + + - - - - -
“ +” 表示凝血(hemagglutination);“ -” 表示不凝血(no hemagglutination);“H” 表示溶血(Hemolysis)
1515第 6期 孔杨等:温度 、酸碱度和变性剂对黄花石蒜凝集素活性和构象的影响 　
图 3　不同 pH 下 LAA 荧光光谱
F ig.3　The fluorescence spectra of LAA at different pH
1.pH 2;2.pH 4;3.pH 6;4.pH 7;5.pH 9;6.pH 12
3.5　变性剂对 LAA凝血活性和荧光光谱的影响
3.5.1　脲对 LAA 凝血活性和荧光光谱的影响　
不同浓度盐酸胍处理 LAA 的活性变化见表 3 ,荧
光光谱见图 4.脲使得 LAA 的内源荧光光谱呈现
两个阶段的变化.首先是在低浓度的脲中(0 ～ 4
mol/L), LAA的荧光强度增加但峰位不变;高浓度
脲(5 ～ 8 mol/L)时荧光强度又开始下降且峰位蓝
移 ,当脲浓度为 5 mol/L 时荧光强度开始下降但峰
位仍不变 ,脲浓度再增加至 6 mol/L 时荧光强度变
化不大 , 但是峰位产生了蓝移;当脲浓度高达 8
mol/L 时荧光强度继续降低峰位明显蓝移.凝血活
性的变化与荧光光谱的阶段变化是相对应的 ,第一
个阶段脲对活性完全没有什么影响 ,在脲浓度为 5
mol/L 时活性也仅下降 16%,但是到 6 mol/L 时活
性完全丧失.
图 4　不同浓度脲对 LAA荧光光谱的影响
Fig.4　Effect of Urea concentration on the
fluo rescence spectra of LAA
Conc.of Urea:1.0 mol/ L;2.2 mol/ L;
3.4 mol/ L;4.5 mol/ L;5.6 mol/ L;6.8 mol/ L
表 3　不同浓度脲对 LAA活性的影响
Tab.3　Effect of urea concentration on hemagglutination of LAA
浓度
(mol/ L)
LAA concentrat ion(×10-6 g/mL)
80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.62 0.31 0.16 0.08
0 + + + + + + - - - - -
2 + + + + + + - - - - -
4 + + + + + + - - - - -
5 + + + + + - - - - - -
6 - - - - - - - - - - -
8 - - - - - - - - - - -
“ +”表示凝血(hemagglut ination);“ -”表示不凝血(no hemagglutination)
3.5.2　盐酸胍对 LAA 凝血活性和荧光光谱的影
响　图 5是不同浓度盐酸胍对 LAA荧光光谱的影
响 ,从图中可以看出 ,当盐酸胍浓度小于 3 mol/ L
时 ,LAA荧光最大发射波长随盐酸胍浓度的增大
而逐渐增大 , 3 mol/ L 时达到最大 ,其后随盐酸胍
浓度的逐渐增大反而逐渐减小.而 LAA 荧光强度
在盐酸胍浓度为 0 ～ 0.5 h逐渐增大 ,而后随盐酸
胍浓度的增大逐渐减小 , 8 mol/ L 时达到最小.可
以发现 ,LAA 的最大发射峰及荧光强度随盐酸胍
浓度的变化趋势是非常相似的.表 4可以看出 ,胍
浓度为 3 mol/L 时 ,凝血活力下降 50%,当浓度增
大到 6 mol/L 时凝血活性完全丧失.当盐酸胍浓度
逐渐增大时 ,变性蛋白相对于天然蛋白来说 ,其疏
水性氨基酸 Trp从蛋白质分子内部疏水区逐渐暴
露 ,其荧光强度逐渐增大.随着浓度的不断增大 ,
LAA 肽链进一步伸展 ,共轭残基之间的距离增大 ,
从而降低了共轭残基间共轭能量传递 ,使得荧光强
度降低 ,发射波长蓝移[ 10] .
1516 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
表 4　不同浓度盐酸胍对 LAA凝血活性的影响
Tab.4　Effect o f GuHCl concentra tion on hemagglutination of LAA
浓度
(mol/ L)
LAA concentrat ion(×10-6 g/mL)
80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.62 0.31 0.16 0.08
0 + + + + + + - - - - -
0.5 + + + + + - - - - - -
1 + + + + + - - - - - -
3 + + + - - - - - - - -
6 H H H - - - - - - - -
8 H H - - - - - - - - -
“ +” 表示凝血(hemagglutination);“ -” 表示不凝血(no hemagglutination);“H” 表示溶血(Hemolysis)
表 5　不同浓度 SDS 对 LAA 凝血活性的影响＊
Tab.5　Effect of SDS concentration on hemagglutination of LAA
浓度
(mmol/ L)
LAA concentration(×10-6 g/mL)
80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.62 0.31 0.16 0.08
0 + + + + + + - - - - -
1 + + + + + - - - - - -
5 + + + + + - - - - - -
10 + + - - - - - - - - -
20 H H H- - - - - - -
“ +” 表示凝血(hemagglutination);“ -” 表示不凝血(no hemagglutination);“H” 表示溶血(Hemolysis)
图 5　盐酸胍对 LAA 荧光光谱的影响
Fig.5　Effect of GuHCl concentration on the
fluorescence spectra of LAA
Conc.of GuHCl:1.0 mol/ L;2.0.5 mol/ L;3.1 mol/ L;
4.3 mol/ L;5.6 mol/ L;6.8 mol/ L
图 6　不同浓度 SDS 对 LAA荧光光谱的影响
Fig.6　Effect of SDS concentration on the
fluorescence spectra of LAA
1.SDS 0 mmol;2.SDS 1 mmol;3.SDS 5 mmol;
4.SDS 10 mmol;5.SDS 20 mmol
3.5.3　SDS对 LAA 性质的凝血活性和荧光光谱
的影响　图 6是不同浓度 SDS 对 LAA 荧光光谱
的影响.从图中可以看出 ,当加入 1 mmol SDS 时 ,
LAA荧光发射强度增加 ,但最大发射波长不变;
SDS浓度逐渐增加时 , 荧光强度又开始下降 , 5
mmol时几乎回到原来的水平 , 20 mmol时达到最
低.凝血活性的变化(见表 5)表明 , 10 mmol SDS
使 LAA丧失绝大部分活性 ,20 mmol SDS 使 LAA
完全丧失凝血活性.可能是较高浓度的 SDS 使得
疏水基团间的结合导致芳香氨基酸侧链处于局部
疏水环境的结果[ 11] .凝血活性中心完全被破坏 ,使
得活性完全丧失.
4　讨　论
以上实验表明 ,天然 LAA最大荧光发射峰在
337.2 nm 处 ,比游离 Trp的最大荧光发射峰 348
1517第 6期 孔杨等:温度 、酸碱度和变性剂对黄花石蒜凝集素活性和构象的影响 　
nm 蓝移了 10.2 nm ,说明 Trp周围的极性较弱 ,至
少有部分 Trp残基位于蛋白质表面的疏水区.稳定
性表明 , LAA 是一种对酸 、碱较为稳定的凝集素.
从 LAA荧光光谱受温度 、pH 影响不大也可以得出
同样的结论.这和其它许多凝集素相似.不同浓度
的变性剂作用下 , LAA 荧光光谱的变化反映出
LAA在变性过程中与酪氨酸和色氨酸有关的构象
的变化.这种变化和其它甘露糖结合凝集素中所发
生的变化一致 ,反映出这一家族中相类似的结构特
征.变性实验的结果发现 ,不同浓度的变性剂处理
都能使分子构象发生不同程度的变化并导致活性
的丧失.变性过程分两个阶段进行:低浓度变性剂
引起局部构象的变化 ,达到一定浓度后才发生分子
结构较大的变化 ,凝血活性中心构象改变从而凝血
活性丧失.天然态构象中疏水性氨基酸暴露最少 ,
蛋白分子处于最紧密的构象状态.当加入低浓度的
变性剂以后 ,此时蛋白的分子构象状态与天然态及
加入高浓度变性剂的状态都不同 ,处于一种中间体
状态 ,明显表现为其荧光发射光谱的发射波长最
大 ,荧光强度也最高.
目前国际上公认的第一个被发现的单子叶甘
露糖结合凝集素是雪花莲凝集素(GNA)[ 12] .之后 ,
在单子叶家族石蒜科 、凤梨科 、葱科 、天南星科 、兰
科和百合科中都发现了相似的蛋白质 ,这些凝集素
在生化和医药方面的应用引起了人们广泛的关注 ,
近年来对其抗病毒 ,抗肿瘤的研究成为热点.我们
希望通过荧光光谱的方法研究温度 、酸碱度和变性
剂对 LAA构象与活性的影响以探求黄花石蒜凝集
素结构与活性的关系 ,为今后进一步研究凝集素在
分子间识别过程中的作用积累了理论数据.同时 ,
研究中发现 LAA良好的生物稳定性也为其广泛研
究应用提供了有力条件.
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[责任编辑:白林含]
1518 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷