全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2008, 20:207-211
文章编号:1001-6880(2008)02-0207-05
　
　
　收稿日期:2007-11-12　　　接受日期:2007-12-28
　基金项目:国家自然科学基金项目(No.30270331, 39770178, 30000032,
30670469)
＊通讯作者 Tel:86-28-85411914;E-mail:jinkubao@yahoo.com
犁头尖凝集素色氨酸(Trp)所处微环境及构象的研究
钟绍东 ,刘艳红 ,徐小超 ,鲍锦库＊
四川大学生命科学学院 ,成都 610064
摘　要:本文通过荧光淬灭的方法对犁头尖凝集素(TDL)的内源荧光进行了淬灭研究。研究结果表明:丙烯酰
胺与 TDL分子中 Trp残基的可接近程度达到 100%, 而 KI和 CsCl与 Trp残基的可接近程度分别为 83.3%和
50%, 说明 TDL中大部分 Trp残基位于分子表面或近表面区域 , 且位于表面的 Trp残基所处微环境中带正电荷
基团约为带负电荷基团的一倍。荧光淬灭数据分析表明这三种淬灭剂对 TDL的荧光淬灭作用均属动态淬灭机
制。此外 , 本文还研究了变性剂对 TDL凝血活性与荧光光谱的影响 ,研究表明同浓度的盐酸胍对 TDL变性作用
明显强于脲 , TDL活性的丧失主要是由于其活性中心被变性剂破坏而造成。
关键词:凝集素;TDL;凝集活性;微环境;荧光淬灭;荧光光谱
中图分类号:Q-33 文献标识码:A
StudyonMicro-enviormentandConformationof
TyphoniumDivaricatum(L.)DecneLectin(TDL)
ZHONGShao-dong, LIUYan-hong, XUXiao-chao, BAOJin-ku＊
CollegeofLifeScience, SichuanUniversity, Chengdu610064 , China
Abstract:Inthepresentstudy, threedifferentquencherswerechosentoresearchthemicro-environmentoftryptophan
residuesinTyphoniumdivaricatum(L.)Decnelectin(TDL).Fluorescencequenchingresultsshowedthattheaccessi-
bilitytotryptophanresiduesofTDLforacrylamide, KIandCsClwere100%, 83.3% and50%, respectively.Thesere-
sultssuggestedthatmostofthetryptophanresiduesinTDLwerelocatedonthesurfaceornearthesurfaceofthemole-
cule.Inaddition, theratiobetweenthepositivechargedresiduesandnegativechargedresiduesaroundsurface-located
tryptophanresidueswasabout2.Stern-Volmeranalysisofthequenchingdataindicatedthatalthethreefluorescence
quenchingmechanismsweredynamicquenchingprocesses.HemagglutinatingactivityandfluorescencespectraofTDLaf-
terdenaturingwithGuHClandureasuggestedthatthedenaturingefectbyGuHClwasmuchmorepowerfulthanurea.
ThelossofthehemagglutinatingactivityafterdenaturationwasresultedfromthedestroyoftheactivecentreofTDL.
Keywords:lectin;TDL;hemagglutinatingactivity;micro-environment;fluorescencequenching;fluorescencespectrum
　　凝集素是一类含有单个或多个非催化性的 ,可
与单糖或多糖可逆结合的蛋白质或糖蛋白 ,它们在
自然界普遍存在 ,从大型的动植物到微小的细菌 、病
毒 、支原体 、衣原体中 ,都有凝集素存在 ,在生物体内
执行着多种重要的生理功能 ,在细胞的识别与结合
中介导一系列事件的发生 。并被广泛应用于分离纯
化 、确定糖复合体 、细胞分裂 、鉴定微生物 、骨髓移
植 、肿瘤诊断 、治疗及预防等[ 1] 。
犁头尖属天南星科植物 ,我们从犁头尖球茎中
纯化到一种甘露糖结合凝集素(TDL), TDL是由两
个不同亚基组成的四聚体蛋白 ,其表观分子量为 46
kDa,研究发现 TDL对部分肿瘤细胞和 HSV病毒表
现出特异的抑制作用 [ 2] 。此外利用生物信息学的
方法 ,对 TDL的二级和三级结构进行了预测 ,为了
进一步研究其微环境与构象的关系 ,本文利用荧光
淬灭法对部分荧光生色基团的分布和所处的微环境
进行了探讨 ,以期为犁头尖甘露糖结合凝集素生物
学活性和构象的关系研究打下基础。
1　材料与方法
1.1　材料
丙烯酰胺(华美生物工程公司);碘化钾(宜兴
市第二化学试剂厂);氯化铯(上海试剂一厂);所
有化学试剂均为国产分析纯 ,所用溶液均以双蒸水
DOI :10.16333/j.1001-6880.2008.02.001
配制。犁头尖凝集素按文献[ 2]方法纯化。
1.2　方法
1.2.1　蛋白浓度测定
采用 Lowry法 ,用 Folin-酚试剂测定 ,以牛血清
白蛋白为对照[ 3] 。
1.2.2　内源荧光光谱测定
荧光光谱的测定在日立 850型荧光光度计上进
行 ,样品测量温度为 25 ℃,测定的激发和发射光谱
带宽为 5 nm。 TDL浓度为 0.1 mg/mL。测量时分
别以 280与 295 nm为激发光 ,测得荧光发射光谱 ,
再以发射光谱的最大波长 345nm为发射波长 ,测得
激发光谱。
1.2.3　不同浓度盐酸胍和脲对 TDL凝血活性及荧
光光谱的影响
用生理盐水配制浓度为 1、2、3、4、5和 6 mol/L
盐酸胍和脲溶液各 100mL,向溶液中加入 TDL样品
使其终浓度为 0.1 mg/mL,室温放置 2 h测定其凝
集活性和荧光光谱。
1.2.4　TDL荧光淬灭研究
1.2.4.1　丙烯酰胺对 TDL的荧光淬灭作用
丙烯酰胺对 TDL荧光的淬灭参照 LehrerSS和
EftinkMR等的方法 [ 4, 5] ,用 pH7.2的 0.02 mol/L
的 PBS缓冲液将丙烯酰胺分别配成 0.1、0.2、0.3、
0.4和 0.5 mol/L五种不同的浓度。向溶液中加入
TDL样品使其终浓度为 0.1 mg/mL,淬灭结束后进
行荧光光谱的测定 。由于丙烯酰胺在 292 nm处的
光吸收会引起蛋白质荧光强度的变化 ,所以要对结
果进行矫正 。采用 Shyamali等 [ 6] 修改过的 M.R.
Eftink方程 ,即:
Icor=Iobs×[antilg(0.5A292)] ×[ antilg(0.5A332)]
式中 , Icor为校正后的 332 nm处的荧光强度 ,
Iobs为从荧光光谱上观察到的 332 nm处的荧光强
度 , A292和 A332分别是丙烯酰胺于 292 nm和 332 nm
处的光吸收值。
1.2.4.2　KI对 TDL的荧光淬灭作用
参照 LehrerSS和 EftinkMR等的方法[ 4, 5] , KI
溶液由 0.02mol/L, pH7.4 PBS缓冲液配制成 0.1、
0.2、0.3、0.4和 0.5 mol/L五种不同浓度(内含 2
mMNa2S2O3作还原剂 ,以防止 I2生成)。
向五种溶液中加入 TDL样品使其终浓度为 0.1
mg/mL,然后进行荧光光谱的测定 。
1.2.4.3　CsCl对 TDL的荧光淬灭作用
将 CsCl用生理盐水分别配制成 0.1、0.2、0.3、
0.4和 0.5 mol/L五种浓度 ,向溶液中加入 TDL使
其终浓度为 0.1 mg/mL,进行荧光光谱的测定。
1.2.5　荧光淬灭分析
在荧光淬灭研究中 ,对于单个的荧光基团或均
一的溶液系统来说 ,淬灭结果用 Stern-Volmer公式
(1)和公式(2)[ 5]分析:
F0 /F=1+KQ[ Q] (KQ为淬灭常数)(1)
式中 , F0为加入淬灭剂前的荧光强度 , F为加
入淬灭剂后的荧光强度 , [ Q]为加入淬灭剂的浓度 ,
KQ为不同淬灭剂的淬灭常数 ,数值等于 50%荧光
强度被淬灭时淬灭剂的浓度 。公式(2)可以由公式
(1)推出
F0 /ΔF=fm-1 +(fm×K)-1 ×[ Q] -1(2)
式中 , K为可被淬灭剂所接近的发色基团的
Stern-Volme常数 , ΔF即(F0 -F)表示加入淬灭剂前
后荧光强度的变化值 , fm为可被荧光淬灭剂所接近
的发色基团占总的荧光发色基团的百分比。分别以
F0 /F对 [ Q] , F0 /ΔF对 [ Q] -1作图 ,从图中计算出相
应的 1 /Ksv和 fm。
2　结果和讨论
2.1　TDL内源荧光光谱分析
图 1　天然态 TDL的内源荧光光谱
Fig.1　IntrinsicfluorescencespectraofnativeTDL
　　曲线 1:280nm处的发射光谱;曲线 2:295nm处的发
射光谱;曲线 3:345nm处的激发光谱)
1.fluorescenceemissionspectrumat280 nm;2.fluores-
cenceemissionspectrumat295nm;3.fluorescenceexcitation
spectrumat345nm
　　如图 1所示 ,曲线 1, 2是分别以 280 nm和 295
nm为激发波长得到的 TDL荧光发射光谱 ,峰值都
在 345 nm处 。曲线 3为以发射光谱中的 λmax(345
nm)为发射光谱得到的 TDL的激发光谱 λmax=282
nm。从图中可以看出 , 295 nm处激发的荧光发射峰
位(曲线 2)远远小于 280 nm的发射峰位(曲线 1)。
由于 295nm仅激发色氨酸(Trp),而 280 nm激发的
发射光谱由色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)两种生色
208 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
基团共同贡献 ,但是在光谱中并没有 Tyr残基产生
的荧光峰 ,说明 TDL的内源荧光发生了从 Tyr到
Trp的能量转移 [ 7] ,和游离色氨酸最大荧光发射峰
位 348nm相比 , 280 nm和 295 nm处的荧光最大发
射峰为 345nm,蓝移了 3 nm,说明 Trp周围的极性
相对较强 ,几乎全部暴露于周围溶剂中 ,这与荧光淬
灭的结果是一致的。
2.2　变性剂对 TDL凝血活性和荧光光谱的影响
盐酸胍对 TDL凝血活性的影响如图 2A所示 ,
从图中可知 ,随着盐酸胍浓度的增加 , TDL凝血活性
逐步下降 ,当盐酸胍浓度为 6 mol/L时 , TDL凝血活
性完全丧失 。盐酸胍对 TDL荧光光谱也有明显的
影响 ,如图 3A所示 ,当盐酸胍浓度小于 2mol/L时 ,
TDL荧光光谱不变 ,只是在 1 mol/L盐酸胍时 TDL
的荧光强度有部分降低 ,当盐酸胍浓度大于 2 mol/L
时 , TDL最大荧光发射峰蓝移 ,表明在较高浓度盐酸
胍的作用下 TDL结构发生了明显的变化 ,活性遭到
中心破坏 , Trp所处微环境的疏水性增加。盐酸胍
是一种最常用的蛋白变性剂 ,主要通过破坏蛋白质
分子内的氢键而使蛋白质从有序结构转变为无序结
构 ,发生去折叠过程。
不同浓度的脲对 TDL凝血活性的影响如图 2B
所示 ,从图上可知:当脲浓度为 1和 2mol/L时 , TDL
凝血活性为原来的 80%,当脲浓度为 3 ～ 5 mol/L
时 ,凝血活性保留 60%,当脲浓度达到 6 mol/L,凝
血活性仅保留 20%。由此说明随着变性剂浓度的
增加活性中心被逐渐破坏 ,活性逐步下降。图 3B
是经不同浓度脲处理后 TDL荧光光谱的变化 ,从图
中可知 ,经脲处理后 TDL荧光光谱呈两个阶段的变
化:首先当脲浓度为 0 ～ 5mol/L时 , TDL荧光强度
图 2　变性剂对 TDL凝血活性的影响
Fig.2　Efectofdenaturantsonthehemegglutinatingactivityof
TDL
A.盐酸胍对 TDL凝血活性的影响;B.脲对 TDL凝血活性的影响
A.EfectofGuHClonthehemagglutinatingactivityofTDL;B.Efectof
ureaonhemagglutinatingactivityofTDL
图 3　变性剂对 TDL荧光光谱的影响(295 nm激发)
Fig.3　EfectofdenaturantsonfluorescencespectraofTDL
(excitatedat295 nm)
A.盐酸胍对 TDL荧光光谱的影响 EffectofGuHClonthefluores-
cencespectraofTDL(1 ～ 7:control、 1.0、 2.0、 3.0、4.0、 5.0、 6mol/
L);B.脲对 TDL荧光光谱的影响 Efectofureaonthefluorescence
spectraofTDL(1～ 7:control、 1.0、 2.0、3.0、4.0、 5.0、6mol/L)
随脲浓度的增加而增加;当脲浓度为 6 mol/L时荧
光强度开始迅速下降 ,但峰位始终未发生变化 ,说明
高浓度的脲导致 TDL蛋白构象发生了较大变化 ,但
Trp周围的微环境并未受到明显的影响。
2.3　TDL荧光淬灭研究
一些特殊的物质能使产生荧光的物质的荧光强
度减弱甚至不产生荧光 ,这就是荧光淬灭现象。通
过对荧光淬灭的研究 ,能够获得物质中发荧光基团
所处的微环境的有用信息 。因此 ,荧光淬灭的方法
可以用于研究蛋白质分子中 Trp残基所处的微环
境。
荧光淬灭研究表明 ,随着淬灭剂丙烯酰胺 、碘化
钾和氯化铯浓度的升高 , TDL的荧光最大发射峰位
和峰的形状基本不变 ,荧光强度均逐渐下降(图 4)。
以 F0 /F对 [ Q]作图均得到一条向上直线(图 3),表
明有多个 Trp残基对 TDL荧光有贡献 ,并且两者呈
线性关系 ,遵从 Stern-Volmer公式(1)[ 4, 8] ;F0 /F=1
+KQ[ Q] 。因此说明丙烯酰胺 、KI和 CsCl对 TDL
分子中 Trp残基的荧光淬灭均属于完全动态淬灭
(扩散控制机制)。
根据 Stern-Volmer公式:F0 /F =1 +KQ[ Q]
(1)和 Stern-Volmer修正公式:F0 /ΔF=fm-1 +(fm×
K)-1 ×[ Q] -1(2)对荧光淬灭数据进行分析 ,分析结
果如图 5、图 6。从图上可知 ,丙烯酰胺对 TDL进行
淬灭时 , KQ(Stern-Volmer直线斜率)为 31.8 (图
5A), fm(modifiedStern-Volmer直线截距)为 1.0
(图 6A);KI对 TDL进行淬灭时 , KQ为 2.83(图
5B), fm为 0.833(图 6B);同样由图 5C和图 6C可
计算出 TDL被氯化铯淬灭时 , KQ为 0.88, fm为
209Vol.20 钟绍东等:犁头尖凝集素色氨酸(Trp)所处微环境及构象的研究
0.5。以上结果表明荧光淬灭剂丙烯酰胺 、KI和
CsCl对 TDL荧光基团 Trp的可接近程度分别为
100%, 83.3%和 50%。即 3种荧光淬灭剂中丙烯
酰胺对 TDL的淬灭作用最强 , KI次之 , CsCl的淬灭
作用最弱。由此说明 TDL中绝大部分的 Trp分子
位于分子表面或近表面 ,在自然条件下其所发荧光
容易被离子型淬灭剂淬灭。此外 ,与 KI相比 CsCl
对 TDL的淬灭作用几乎低 1倍 ,说明 TDL中大部分
Trp被带正电荷的基团包围 ,导致带正电荷的 Cs+不
能接近。
　　荧光淬灭方法广泛应用于蛋白质的溶液构象研
究 。Trp残基的荧光光谱对微环境的变化很敏感 ,
因此荧光淬灭对研究蛋白质中 Trp的局部构象特别
有效。三种淬灭剂对 TDL内源荧光的淬灭作用中
丙烯酰胺最强 , KI和 CsCl次之。丙烯酰胺是一种
非常有效的 、不带电荷的中性淬灭剂 ,它可以进入蛋
白质的疏水内核[ 9] ,既可淬灭分子表面的荧光基团
的荧光 ,也能淬灭埋在分子内部的荧光基团的荧光。
从本文中丙烯酰胺能淬灭 TDL中 Trp残基 100%的
荧光 。而 KI和 CsCl只能淬灭 83.3%和 50%Trp
残基的荧光。由于 KI和 CsCl分别是带电荷的离子
型淬灭剂 ,在通常情况下小分子和大分子的相互作
210 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
用主要通过氢键 、范德华力 、静电作用和疏水相互作
用 。因此 ,可能是 Trp残基周围存在带相同电荷的
极性区 ,排斥了 I-和 Cs+的接近或被包埋的 Trp残
基所处的疏水穴使 I-和 Cs+不能进入 [ 10] 。因而 KI
和 CsCl只能淬灭位于分子表面或接近于分子表面
的 Trp残基的荧光 。由此可见 TDL中 Trp残基大部
分是位于分子表面或近表面 ,仅小部分埋藏于分子
内部疏水性环境中的 ,而且 Trp残基周围正电荷的
分布比例约为负电荷的一倍[ 11] 。
参考文献
1　WrightaLM, ReynoldsCD, RizkalahbPJ, etal.Structureof
thenative(unlighted)mannose-specificbulblectinfrom
Scillacampanulata(bluebel)at1.7Aresolution.Acta
Cryst, 1999, 55:1264-1272.
2　LuoYT, XuXC, LiuJW, etal.Anovelmannose-bindingtu-
berlectinfromTyphoniumDivaricatum(L.)Decne(family
Araceae)withantiviralactivityagainstHSV-IIandanti-pro-
liferativeeffectonhumancancercellines.JBiochemMol
Biol, 2007, 40:358-367.
3　LowryOH, RosebroughNJ, FanAC, etal.Proteinmeasure-
mentwiththeFolinphenolreagent.JBiolChem, 1951, 193:
265-275.
4　LehrerSS, LeavisPC.Solutequenchingofproteinfluores-
cence.MethodsEnzymol, 1978, 49:222-236.
5　LehrerSS, EftinkMR, GhironCA.Fluorescencequenching
studieswithproteins.AnalChem, 1981, 114:199-227.
6　ShyamaliSS.Fluoorescencestudiesofnativeandmodified
neuophysisins:effectofpeptidesandpH.Biochem, 1979, 18:
10-26.
7　RoopaK, MustiJS.Steady-stateandtime-resolvedfluores-
cencestudiesonTrichosanthescucumerinaseedLectin.J
PhotochemPhotobiolB:Biol, 2003, 69:193-201.
8　QuaySC, HeropoulosA, CommesK, etal.Probingtherenin
activesitebycolisionalquenchingofendogenousfluores-
cence.JBiolChem, 1985, 260:50-55.
9　GaoS, AnJ, WuCF, etal.Efectofaminoacidresidueand
oligosaccharidechainchemicalmodificationsonspectraland
hemagglutinatingactivityofMilettiadielsianaHarms.ex
Diels.Lectin.ActaBiochBiophySin, 2005, 37:47-54.
10 SnehaSK, MustiJS.Fluorescencequenching, time-resolved
fluorescenceandchemicalmodificationstudiesonthetrypto-
phanresiduesofsnakegourd(Trichosanthesanguina)seed-
lectin.JPhotochem.PhotobiolB:Biol, 1999, 50:108-119.
11 SultanNAM, SwamyMJ.Fluorescencequenchingandtime-
resolvedfluorescencestudiesonTrichosanthesdioicaseed
lectin.JPhotochemPhotobiolB:Biol, 2005, 80:93-100.
211Vol.20 钟绍东等:犁头尖凝集素色氨酸(Trp)所处微环境及构象的研究