全 文 ：收稿日期:2007-03-30;修回日期:2007-06-17
基金项目:国家自然科学基金(30000032 , 30270331)
作者简介:赖媛媛(1982-),女,四川成都 ,硕士研究生 ,主要研究领域为糖结合蛋白.E-mail:laiyy22222@126.com
通讯作者:鲍锦库.E-mail :baojinku@yahoo.com.cn
文章编号:　0490-6756(2008)04-0979-06
一支箭凝集素构象与生物学活性的关系研究
赖媛媛 , 吴传芳 , 王　维 , 刘艳红 , 刘　震 , 鲍锦库
(四川大学生命科学学院 , 成都 610064)
摘　要:采用荧光光谱研究了一支箭凝集素(OPA)在不同温度 , pH 值以及不同淬灭剂作用
时 ,其活性和分子构象变化的关系 ,结果表明:OPA 具有较强的温度和酸碱度的耐受性 ,分子
构象也无较大变化 ,但在 pH 12时 ,其分子构象发生较大变化 ,活性也基本丧失.荧光淬灭剂丙
烯酰胺和琥珀酰亚胺对 OPA 中 Trp淬灭程度达 100%, KI 淬灭约 62.5%的 Trp荧光.表明
OPA发射荧光的氨基酸残基大部分位于分子表面 ,少部分位于分子内部疏水环境中 ,且发荧
光氨基酸所处微环境带电荷.
关键词:一支箭凝集素;荧光光谱;温度;pH 值;荧光淬灭
中图分类号:Q51　　　文献标识码:A
Study on the relationship between the conformation and biological
activity of Ophioglossum pedunculosum Desv agglutinin
LAI Y uan-Y uan , WU Chuan-Fang , WANG Wei , LIU Yan-Hong , LIU Zheng , BAO Jin-K u
(College of Life Sciences , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:Fluorescence spect ra w as used to elucidate the relationship betw een the activity and molecular con-
formation of Ophioglossum Pedunculosum agg lutinin(OPA)under dif ferent temperature , pH Value and
quencher.The results show ed that OPA was stable up to 60 ℃ and exhibit maximum activity betw een pH 4
and 8.Fluorescence quenching study of OPA by acrylamide , KI and Succinimide suggested that they can
quench 100%, 62.5% and 100%of the int rinsic f luorescence of tryptophan in OPA respectively , which indi-
cated that acrylamide is the most efficient quencher and nearly all the tryptophan residues of OPA were located
on the surface of the molecule.
Key words:Ophioglossum Pedunculosum agglutinin , f luo rescence spect ra , temperature , pH Value , fluores-
cence quenching
1　引　言
凝集素(Lectin)是自然界中广泛存在的一类
非酶 、非免疫来源的 、具有糖结合专一性并能使糖
复合物沉淀的蛋白或糖蛋白[ 1] .在自然界普遍存
在 ,从大型的动植物到微小的细菌 、病毒 、支原体 、
衣原体中都有凝集素存在.近年来发现 ,有些凝集
素具有与腺嘌呤和腺嘌呤相关的植物激素结合位
点 ,这些凝集素可能与一些植物激素发挥生理作用
有关[ 2] .
凝集素广泛的生物学活性主要归因于其特异
的糖结合活性 ,而特殊的氨基酸对它保持这种结合
活性是必须的;故确定这些特异的氨基酸是研究凝
集素结构与功能关系的基础 ,而化学修饰可以鉴别
2008年 8月 　
第 45卷第 4期　
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
　 Aug.2008
Vol.45　No.4
哪些氨基酸位于功能区[ 3] ,从而提供凝集素一级
结构和生物学活性的相关性.借助光谱学仪器分析
可以研究不同条件下蛋白质结构的变化 ,再配合活
性的检测是研究蛋白质结构与功能关系的有效手
段.荧光光谱可用于对蛋白质分子中特殊荧光基团
(如 Trp残基)所处的微环境进行研究 ,荧光淬灭方
法也广泛应用于蛋白质溶液构象的研究[ 4-6] .
一支箭是蕨类(Pteridophy ta)真蕨亚门(Filico-
phy tina)厚囊蕨纲(Eusporangiopsida)瓶尔小草目
(Ophioglossales)瓶尔小草科(Opllioglossaceae)瓶
尔小草属(Ophioglossum)植物 Ophioglossum pe-
dunculosum Desv 的带根全草.植株高 10 ～ 30 cm.
根肉质.根状茎短而直立.叶单生 ,卵形或狭卵形 ,
两侧细脉与中脉平行.孢子叶穗自总柄顶端生出 ,
高出营养叶 ,狭条形 ,顶端有小突起.分布于东北 、
陕西 、长江中下游 、广西 、台湾及西南等地.生于林
下或草地.全草入药 ,能清热解毒 ,治蛇咬伤 、疔疮 、
肿毒等.一支箭凝集素(OPA)是从一支箭种子中分
离出的一种蛋白质.本文通过从一支箭中分离纯化
得到 OPA ,荧光光谱等手段对 OPA 的结构 、性质
及生物学活性的关系进行了初步研究.
2　材料与方法
2.1　材　料
一支箭购于四川省成都市彭县白鹿乡.新鲜兔
血采于郭家桥市场 ,经生理盐水离心(4500 r/min ,
5 min)洗涤三次 ,用生理盐水配制成 2%血球悬液
备用.
2.2　方　法
2.2.1　一支箭凝集素的分离纯化　取一支箭根部
用匀浆机捣碎 ,用生理盐水在 4 ℃浸取过夜 ,用纱
布过滤 ,再离心(4 ℃,4000 r/min , 25 min),收集上
清液 ,弃去沉淀 ,加入固体硫酸铵至 80%饱和度 ,
放置 4 ℃过夜.将悬浊液离心(10000 r/min , 15
min),收集沉淀 ,溶于灭菌水中 ,经流水透析和高
水透 析 除 盐.所得 凝 集 素粗 品 经 pH 8.0
0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液平衡透析后 , 用于
DEAE-Sepharose 柱 ,经相同缓冲溶液洗涤 ,用 0 ～
0.5 mol/L NaCl的 Tris-HCl溶液进行离子线性梯
度洗脱 ,经紫外和凝血活性检测后 ,收集活性部分 ,
冷冻干燥.
取上述冻干品溶于 pH 7.0的 PBS 缓冲液 ,用
S-100进行分子筛纯化 ,经紫外和凝血活性检测 ,
收集活性峰 ,透析除盐冻干即得一支箭凝集素纯
品 ,并参照Laemmli[ 7 ]的方法用聚丙烯酰胺凝胶电
泳(SDS-PAGE)进行纯度检测.
2.2.2　内源荧光光谱的测定　荧光光谱在荧光分
光光度计((Model 4500 , Hitachi L td., Tokyo ,
Japan)上进行 ,样品测定温度为 25 ℃.测定的激
发和发射光谱带宽均为 5 nm.测定时以 281.6
nm 、295 nm 为激发光 ,测得荧光发射光谱;再以发
射光谱的最大波长 328 nm 为发射波长 , 测得激发
光谱.
2.2.3　不同温度处理的 OPA 的荧光光谱的测定
　将样品以生理盐水配制成 0.1×10-3 g/mL ,分
别在 20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、
80 ℃、90 ℃、和 100 ℃处理20 min后 ,冷却至室温
后测定荧光光谱.
2.2.4　不同 pH 值处理的 OPA 的荧光光谱的测
定　取冻干品以生理盐水配制 ,用 pH 2.0的 KCl-
HCl缓冲液 、 pH 4.0和 5.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓
冲液 、pH 9.0的 NaHCO3-Na2CO3 缓冲液和 pH 12
的 KCl-NaOH 缓冲液(缓冲液浓度为 0.1 mol/L)
等配制 0.1×10-3 g/mL 的溶液 ,放置过夜 ,测定
荧光色谱.
2.2.5　不同 pH 值及温度处理后 OPA 凝集活性
的测定　在“V”型微量血清稀释板上 , 用 25 μL
OPA(待测液 1×10-3 g/mL)与等量生理盐水溶
液进行系列倍比稀释后 ,加入 25μL 已制备好的兔
红细胞悬液 ,振荡后于 25 ℃下放置 2 h ,显微镜下
检查凝集活性.
2.2.6　碘化钾对 OPA的淬灭作用　按照P .Pad-
ma[ 8]等的方法 ,K I溶液由 pH 7.4 ,20 mmol/L 的
PBS 缓冲液配制成 0 mol/ L 、0.1 mol/L 、0.2 mol/
L 、0.3 mol/L 、0.4 mol/L 和 0.5 mol/L 五种浓度
(内含 2 mmol/L Na2S2O3 作还原剂 ,以防止 I2 的
生成).分别向其中加入 OPA使其终浓度为 0.1×
10-3 g/mL ,进行荧光光谱的测定.
2.2.7　丙烯酰胺对 OPA 的淬灭作用　以丙烯酰
胺为淬灭剂时 ,按照孙建忠等的方法[ 9] ,在 pH 7.2
的 Tris-HCl缓冲液中将丙烯酰胺配制成 0 mol/ L 、
0.1 mol/L 、0.2 mol/L 、0.3 mol/L 、0.4 mol/L 和
0.5 mol/ L 的溶液.向溶液中加入 OPA 使其终浓
度为 0.1×10-3 g/mL ,进行荧光光谱的测定.采用
Shyamali等[ 10]修改过的 Eftink方程进行校正.
2.2.8　琥珀酰亚胺对 OPA 的淬灭作用　在 pH
7.2的 PBS 缓冲液中将琥珀酰亚胺配制成 0 mol/
L 、0.1 mol/ L 、0.2 mol/L 、0.3 mol/L 、0.4 mol/ L 、
980 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
0.5 mol/L 的溶液.向溶液中加入 OPA 使其终浓
度为 0.1×10-3 g/mL ,进行荧光光谱的测定.
2.2.9　荧光淬灭分析　淬灭结果用 Stern-Volmer
公式(1)和修正公式(2)[ 11]分析:
F 0/ Fc =1+Ksv [ Q ]
F 0/ΔF = f a-1 +(f a ×Ka)-1 ×[ Q ]-1
F 0和 Fc分别为加入淬灭剂前后样品的荧光强度 ,
[ Q] 为淬灭剂浓度.直观地看 ,1/ Ksv 为不同淬灭
剂的淬灭常数 ,数值等于 50%荧光强度被淬灭时
淬灭剂的浓度.Ka 为可被淬灭剂所接近的发色基
团的 Stern-Volmer常数 , ΔF(F 0 -Fc)表示加入淬
灭剂前后荧光强度的变化值 , f a 为可被荧光淬灭
剂所接近的发色基团占总的荧光发色基团的百分
比.然后分别以 F0/ Fc对[ Q] , F 0/ΔF 对[Q ]-1作
图 ,从图中可以计算出相应的 1/Ksv 和 f a.
3　结果和讨论
一支箭粗品经匀浆 、浸取 、硫酸铵分级沉淀 、阴
离子交换柱(DEAE-Sepharose)和 Sephacryl S-100
分子筛层析得到经过 SDS-PAGE 检测为单一条带
的一支箭凝集素纯品.其表观分子量为 19.1 kD ,
亚基分子量为 19.1 kD ,表明 OPA 是由一个分子
量约为 19.1 kD的亚基组成的蛋白.(图 1)
图 1　SDS-PAGE电泳图谱
Fig.1　SDS-PAGE of OPA under denaturing conditions
1.protein marks;2.OPA af ter S ephacryl S-100
不同温度下 OPA对兔血红细胞的凝集活性见
图 2.从图 2看出 ,随着温度的升高 ,OPA的凝血活
性不断减弱 ,但是 100 ℃处理 20 min ,OPA仍保留
20%的活性.温度对其荧光光谱的影响如图 3(以
295 nm 为激发波长).通常升高温度可引起蛋白质
内源荧光强度的下降 ,这是一种荧光淬灭现象.从
图中可以看出 ,当温度升高到 40 ℃和 60 ℃时 ,荧
图 2　温度对一支箭凝集素凝血活性的影响
Fig.2　The effect of temperature on hemafflutina ting
activity of OPA
图 3　不同温度下一支箭凝集素的荧光光谱
Fig.3　The effect of temperature on the fluorescence
intensify of OPA
1.T=20 ℃;2.T =40 ℃;3.T=60 ℃;
4.T=80 ℃;5 .T=90 ℃;6.T=100 ℃
Excitation wavelength w as at 295 nm
光强度增大 ,但其凝血活性无明显变化 ,表明凝集
素的分子构象发生了一定的变化 ,这时的构象变化
开始对发光基团有部分影响 ,可能引起包括凝血活
性中心的色氨酸进一步伸展到溶液中 ,因此荧光强
度升高.40 ℃时凝血活性没有变化 ,说明活性基团
没有被破坏或屏蔽 ,因此结构变化对凝血活性无影
响.90 ℃处理后 ,荧光强度减小 ,活性也下降 ,表明
这时 OPA 的构象发生了较大的变化 ,也说明活性
基团微环境被破坏 ,使生色基团的微环境极性增
加.当温度达到100 ℃时 ,荧光光谱强度又下降 ,活
性也进一步下降 ,表明这明 OPA分子结构更松散 ,
将发光基团暴露在溶液中 ,但活性中心的破坏程度
更严重.在荧光光谱的测定过程中 ,系自然降温后
测定的 ,所以这并不能完全代表实验特定温度时的
荧光图谱 ,此过程中会有结构恢复的可能 ,但是从
981第 4期 赖媛媛等:一支箭凝集素构象与生物学活性的关系研究 　
图中仍可看出 OPA 变性过程的阶段性.
图 4　pH 值对一支箭凝集素凝血活性的影响
F ig.4　The effect of pH on the hemagg lutinating
activity of OPA
图 5　一支箭凝集素在不同 pH 条件下的荧光光谱
Fig.5　The effect of pH on the fluorescence
intensity o f OPA
f rom 1 to 6:pH 2.0 , pH 4.0 , pH 6.0 , pH 8.0 , pH 9.0 ,
pH 12, Excitat ion w avelength w as at 295 nm
不同 pH 条件下OPA对兔红细胞的凝集活性
见图 4 ,可以看出 , pH在 4 ～ 8之间 ,凝血活性没有
变化;pH 为 2时仍有 50%的活性 ,而 pH 为 12时
仅有 5%的活性保留 ,表明 OPA 具有较强的耐酸
碱性 ,且对酸耐受性强于对碱的耐受性.不同 pH
下的荧光见图 5:从整个图谱来看 , λmax几乎没有改
变 ,只是不同的 pH 测得的荧光强度不同.中性条
件下荧光强度最大 ,当向酸碱两极变化时 OPA荧
光强度逐渐降低 , pH 为 8 时荧光强度最高 ,而 pH
为 2时达最低 ,推测此时 OPA 分子处于酸性环境
中 ,其分子表面电荷发生改变导致构象出现较大变
化 ,活性变化也较明显 ,表明 OPA分子的构象变化
对活性中心造成了明显破坏.同时发现 ,当 pH 为
12时 ,在 354 nm 出现一个新的发射峰 ,推测是结
构的变化引起与发光残基相互作用的结果.
荧光淬灭研究表明 ,随着淬灭剂丙烯酰胺 、碘
化钾 、琥珀酰亚胺浓度的升高 , OPA 凝集素的荧
光最大发射峰位和峰的形状基本不变 ,荧光发射峰
和激发峰的强度都逐次下降(图 6 ,图 7 ,图 8).以
F 0/ Fc 对[Q ]作图(F 0 和 Fc 分别为加入淬灭剂前
后样品的荧光强度 , [ Q] 为淬灭剂浓度)结果均得
一条向上直线(图 9 ,图10 ,图 11),表明有多个 Trp
残基对黄精凝集素 Ⅱ荧光有贡献 ,并且两者呈线性
关系 ,遵从 Stern-Volmer 公式(1)[ 8 ] :F 0/ Fc =1+
Ksv [ Q] .因此 , 琥珀酰亚胺 、KI 和丙烯酰胺对一
支箭凝集素分子中 Ty r和 Trp 残基的荧光淬灭均
是完全动态淬灭过程(扩散控制机制).
图 6　丙烯酰胺对一支箭凝集素的荧光淬灭图谱
Fig.6　Quenching of OPA intrinsic fluorescencespectra
by acrylamide
Concent ration of acrylamide f rom top to bot tom:0 , 0.1 , 0.2 ,
0.3, 0.4 , 0.5 mol/ L , Exci tation w avelength w as at 295 nm
图 7　KI 对一支箭凝集素的内源荧光淬灭图谱
Fig.7　Quenching of OPA intrinsic fluorescence
spectra by KI
Concent ration of KI f rom top to bottom:0 , 0.1 , 0.2 , 0.3 ,
0.4 , 0.5 mol/ L , Excitat ion w avelength w as at 295 nm
982 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
图 8　琥珀酰亚胺对一支箭凝集素的
荧光淬灭图谱
F ig.8　Quenching of OPA intrinsic luo rescence
spectra by Succinimide
Concent ration of CsCl f rom top to bottom:0 , 0.1 , 0.2 , 0.3 ,
0.4 , 0.5 mol/ L , Exci tation w avelength w as at 295 nm
　　根据 Stern2Volmer 公式:F 0/F =1 +Ksv
[ Q] (1)和公式:F 0/ ΔF =f m -1 +(fm ×K)-1
×[ Q ] -1(2),其中 K 为可被淬灭剂所接近的发色
基团 Stern　Volmer 常数 , ΔF 表示加入淬灭剂前
后荧光强度的变化值 , f a 为可被荧光淬灭剂所接
近的发色基团占总的荧光发色基团的百分比.以
F 0/ΔF 对 1/ [Q ]作图 ,从图 9-B中可知 1/ fm =1 ,
所以 fm =1.图 10-B 可知碘化钾对一支箭凝集素
的荧光淬灭在 295 nm 激发时 , 1/ fm =1.6 , fm =
0.625 ,同样从图 11-B可计算出琥珀酰亚胺一支箭
凝集素的荧光淬灭在 295 nm 激发时 , 1/ fm =1 ,
fm =1.也就是说 ,3种荧光淬灭剂对一支箭凝集素
的主要荧光基团 Trp 的接近程度分别为 100%,
62.5%,100%.即 3种荧光淬灭剂中丙烯酰胺和
琥珀酰亚胺对一支箭凝集素的淬灭作用最强 ,碘化
钾最弱.
图 9　丙烯酰胺对一支箭凝集素的内源荧光淬灭作用的 Stern-Volmer 曲线图
Fig.9　Construction of the quenching o f intrinsic fluo rescence spectra by acrylamide
(a)The plot of F 0/ F vs.[ Q] , (b)T he plot of F 0/(F 0-F)vs.1/[ Q]
图 10　KI对一支箭凝集素的内源荧光淬灭作用的 Stern-Volmer 曲线图
Fig.10　Construction o f the quenching of intrinsic fluorescence spectra by KI
(a)The plot of F0/ F vs.[ Q] ;(b)The plot of F 0/(F0-F)vs.1/[ Q]
983第 4期 赖媛媛等:一支箭凝集素构象与生物学活性的关系研究 　
图 11　琥珀酰亚胺对一支箭凝集素的内源荧光的淬灭作用的 Stern-Volmer 曲线图
Fig.11　Construction of the quenching o f intrinsic fluo rescence spectra by Succinimide
(a)The plot of F 0/ F vs.[ Q] ;(b)The plot of F0/(F0-F)vs.1/[ Q]
　　荧光淬灭反应是研究蛋白质和其它生物体系
中荧光基团(即 Trp残基)位置的重要手段.淬灭剂
与激发的吲哚环通过物理接触从而降低发光基团
的荧光强度 ,所以荧光淬灭的难易取决于荧光基团
对淬灭剂“暴露”程度[ 12] .Acr 是一种极性非电荷
的淬灭剂 ,它是通过碰撞过程淬灭吲哚衍生物的荧
光 ,无论 Trp残基位于蛋白质的表面还是非极性的
内部 ,Acr作为探针均能淬灭与其发生碰撞的被激
发的 Trp残基[ 13 , 14] .离子型淬灭剂 I-不能进入蛋
白质分子内部 ,只能淬灭蛋白质分子表面或接近分
子表面且为极性环境中的 Trp残基的荧光[ 15] .KI
对一支箭凝集素的淬灭程度是 62.5%, I-不能很
好地淬灭蛋白质的荧光时 ,其原因可能是部分位于
蛋白质分子表面的 Trp 残基周围存在带电荷区 ,
排斥了 I-的接近;丙烯酰胺和琥珀酰亚胺是非常
高效的不带电荷的淬灭剂 ,它能有效淬灭蛋白质分
子表面和浅表面的 Trp残基的荧光.从淬灭的结果
可以看出 ,OPA 的 Trp残基基本位于蛋白质分子
表面 ,而且多数是位于表面的疏水区.此外 ,琥珀酰
亚胺的 Stern-Volmer 曲线表现出阶段性 , 暗示
OPA分子中可能有两组 Trp残基在可接近程度和
微环境方面具有显著的差异.
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[责任编辑:白林含]
984 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷