全 文 ：收稿日期:2005-10-30
基金项目:国家自然科学基金(No.30000032;No.30270331)
作者简介:(1967-)四川仁寿人 , 讲师 ,硕士研究生.
＊通讯作者.E-mail:jinkubao@sina.com;Tel:028-85410672
文章编号:　0490-6756(2006)03-0692-05
荧光淬灭作用研究黄精凝集素 Ⅱ
微环境与构象的关系
刘 超1 、2 ,徐小超1 ,吕鸿周1 ,李 建1 ,孔杨1 ,刘金枝1 ,鲍锦库1 , ＊
(1.四川大学生命科学学院 ,成都 610064;2.乐山师范学院化学与生命科学系 ,四川乐山 614004)
摘要:淬灭剂CsCl、KI 、丙烯酰胺对黄精凝集素 Ⅱ(Polygonatum cyrtonema Hua.Lect inⅡ , PCL
Ⅱ)内源荧光淬灭研究表明它们对凝集素分子的淬灭属动态淬灭机制.综合 3 种淬灭剂对黄
精凝集素 Ⅱ的淬灭效果 ,黄精凝集素Ⅱ中 Tyr 和 Trp对中性淬灭剂丙烯酰胺的可接近程度分
别达到 88.5%和 74.07%,而对阴离子淬灭剂 KI 为 55.5%和 66.7%,对阳离子淬灭剂 CsCl
均只有 25%.表明黄精凝集素 Ⅱ发射荧光的氨基酸残基大部分是位于分子表面疏水袋中 ,少
部分埋藏于分子内部疏水环境中 ,且所有发荧光氨基酸所处微环境带正电荷的比例比带负电
荷的比例大近一倍.
关键词:黄精凝集素 Ⅱ;荧光光谱;荧光淬灭;微环境
中图分类号:Q513+.2　　　　　　　文献标识码:A
凝集素是一类非免疫来源 、能可逆凝集细胞和沉淀含糖大分子的蛋白质或糖蛋白[ 1] ,从细菌到高等
的脊椎动物体内都广泛分布.在细胞内 、细胞间和生物体之间凝集素作为识别分子具有十分重要的生物
学作用而被广泛用于生物学 、医学和临床研究等领域[ 2] .
凝集素的凝集细胞特性主要归因于其特异的糖结合专一性 ,而凝集素的构象和特殊氨基酸组成的糖
识别结构域对保持这种结合活性是必需的.凝集素具有一个或多个功能结构域[ 3] ,荧光和荧光淬灭研究
可以确定荧光基团的分布状况及微环境的变化 ,从而提供凝集素一级结构和生物学活性的相关性.Trp
等荧光生色基团的荧光对微环境的变化较为敏感 ,因此荧光淬灭对研究蛋白质中 Trp 的局部构象特别有
效[4] .
黄精凝集素 Ⅱ(Polygonatum cyrtonema Hua.Lectin Ⅱ ,简称 PCL Ⅱ)是从我国传统中草药囊丝黄精
(Polygonatum cy rtonema Hua.)根状茎中分离的一种糖结合蛋白 ,能结合甘露糖 、唾液酸和甲状腺球蛋
白 ,并能凝集兔血红细胞和促进淋巴细胞有丝分裂[ 5] .黄精凝集素分子含有的 3个 Trp既不参与凝血活
性也不参与促淋巴细胞有丝分裂活性中心 ,但对凝集素的构象影响较大[ 6] .我们用荧光淬灭法进一步研
究了荧光发射基团的分布和微环境变化 ,以揭示荧光生色基团微环境的变化与构象的关系 ,为黄精凝集素
Ⅱ结构与功能关系研究提供理论依据.
1　材料与方法
1.1　材料
丙烯酰胺(acrylamide):华美生物工程公司(光谱纯);氯化铯(Caesium chloride):上海试剂一厂;碘化
2006年 6月
第 43卷第 3期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edi tion)
Jun.2006
Vol.43　No.3
钾:宜兴市第二化学试剂厂;其它试剂均为国产分析纯 ,所用溶液均以双蒸水配制.黄精凝集素 Ⅱ按文[ 5]
方法纯化.
1.2　方法
1.2.1　内源荧光光谱的测定　荧光光谱在荧光分光光度计(Model 4500 , Hitachi Ltd., Tokyo , Japan)上
进行 ,样品测定温度为 25℃.测定的激发和发射光谱带宽均为 5nm.测定时以 281.6nm 、295nm 为激发
光 ,测得荧光发射光谱;再以发射光谱的最大波长 323nm 为发射波长 ,测得激发光谱.
1.2.2　黄精凝集素 Ⅱ的荧光淬灭研究　黄精凝集素 Ⅱ内源荧光的淬灭研究参照 Sushama等[ 7]的方法用
KI、CsCl和丙烯酰胺进行.KI 溶液由 pH 7.4 , 20mmol/L 的 PBS 缓冲液配制成 0.0mol/L , 0.1mol/ L ,
0.2mol/ L ,0.3mol/L ,0.4mol/L 和 0.5mol/L 五种浓度(含 2mmol/L Na2S2O3防止 I3-的生成).向五种溶
液中加入黄精凝集素 Ⅱ使其终浓度为 0.1×10-3g/mL ,进行荧光光谱测定.
将CsCl用生理盐水分别配制成 0.0mol/ L ,0.1mol/L , 0.2mol/ L ,0.3mol/L ,0.4mol/L 和 0.5mol/L 五
种浓度 ,向溶液中加入凝集素使其终浓度为 0.1×10-3g/mL ,进行荧光光谱测定.
以丙烯酰胺为淬灭剂时 ,在 pH 7.2 Tris-HCl 缓冲液中将丙烯酰胺配制成 0.0mol/L , 0.2mol/ L ,
0.4mol/ L ,0.6mol/ L ,0.8mol/L 和 1.0mol/L 的溶液.向溶液中分别加入黄精凝集素 Ⅱ使其终浓度为
0.1×10-3g/mL ,进行荧光光谱的测定.由于丙烯酰胺在 295nm 处的光吸收会引起蛋白质荧光强度的变
化 ,所以要对结果进行校正.采用修正过的 Eftink 方程进行校正[ 8] ,即:Icorr=Iobs ×[ log-1(0.5A295)]
[ log-1(0.5A323)] ,其中 Iobs , I corr分别为校正前后 323nm 相对荧光强度 , A295和A 323为丙烯酰胺于 295nm
和 323nm 处的光吸收值.
1.2.3　荧光淬灭分析　淬灭结果用S tern-Volmer公式(1)和修正公式(2)[ 8]分析:
(1)　F 0/ Fc =1+K sv[ Q] 　　　　　(2)　F 0/ ΔF =f a-1+(f a×K a)-1×[ Q ] -1
F 0和 F c分别为加入淬灭剂前后样品的荧光强度 , [ Q ]为淬灭剂浓度.直观地看 ,1/K sv为不同淬灭剂
的淬灭常数 ,数值等于 50%荧光强度被淬灭时淬灭剂的浓度.K a为可被淬灭剂所接近的发色基团的
S tern-Volmer常数 , ΔF(F 0-Fc)表示加入淬灭剂前后荧光强度的变化值 , f a为可被荧光淬灭剂所接近的
发色基团占总的荧光发色基团的百分比.然后分别以 F 0/F c对[ Q] , F 0/ΔF 对[ Q ] -1作图 ,从图中可以计
算出相应的 1/ K sv和 f a.
2　结果和讨论
一些特殊的物质能使产荧光物质的荧光强度减弱甚至不产生荧光 ,这就是荧光淬灭现象.通过对荧
光的淬灭研究 ,能够获得物质中发荧光基团所处的微环境的有用信息.因此 ,荧光淬灭的方法可以用于研
究蛋白质分子中 Trp残基的分布和所处的微环境.
蛋白质的荧光基团为 Phe 、Ty r和 Trp ,三种自由氨基酸的相对荧光强度分别为 0.5 ,9 , 100 ,荧光峰位
(λmax)分别是 282nm 、303nm 和 348nm 波长.因此 ,蛋白质的内源性荧光主要是由 Trp和 Ty r残基发射
的.对于大多数的蛋白质分子 ,由于从 Ty r残基到 Trp残基之间发生了能量转移 ,从而导致 Ty r残基的荧
光熄灭和 Trp残基的荧光强度的增加.因此蛋白质的荧光峰实际上就是 Trp的荧光峰[ 9] .处于蛋白质表
面的 T rp残基具有 350 ～ 353nm 的最大荧光发射峰 ,包埋于蛋白质分子内部的 Trp的荧光光谱在 326 ～
342nm之间有最大发射峰 ,处于非极性环境中的 Trp 残基最大发射峰为 310 ～ 324nm 之间[ 10] .并且 Trp
的荧光对其所处的微环境的性质非常敏感 ,所以多被用来研究蛋白质结构与功能的关系.
天然黄精凝集Ⅱ在 281.6nm和 295nm激发时 ,呈现 323nm 的最大发射光谱(图 1B ,图 2 ,图 3B 、C ,图
4),这一结果表明黄精凝集素 Ⅱ分子的荧光来自色氨酸残基的贡献 ,即黄精凝集素Ⅱ分子内 Ty r与 Trp之
间发生了能量转移[ 9] .在 295nm 激发时 ,与自由 Trp相比最大发射峰由 348nm 蓝移 25nm 至 323nm ,表
明 Trp部分包埋于凝集素的内部疏水区或主要位于非极性环境中[ 11] .
693第 3期 刘超等:荧光淬灭作用研究黄精凝集素 Ⅱ微环境与构象的关系
荧光淬灭作用后 ,检测血细胞凝集活性发现三种淬灭剂对黄精凝集素 Ⅱ的凝集活性均无影响 ,表明凝
集素的荧光基团 Trp和 Tyr并不是凝集活性中心的必需氨基酸.这一结果与文献[ 6]报道一致.
图 1　CsCl对黄精凝集素Ⅱ内源荧光的淬灭作用
Fig.1　Quenching of P.cy tonema Hua.Lection Ⅱ
　　　intrinsic fluorescence spectra by CsCl
　　Excitation spect ra and emission w avelength at
　　323nm(A)and 281.6nm(B)
图 2　CsCl对黄精凝集素Ⅱ内源荧光的淬灭作用
Fig.2　Quenching of P.cy rtonema Hua.Lectin Ⅱ
　　　intrinsic fluo rescence spectra by CsCl
　　　Emission wavelength at 295 nm
　　黄精凝集素 Ⅱ内源荧光淬灭研究表明 ,随着淬灭剂 CsCl 、KI 、丙烯酰胺浓度的升高 ,黄精凝集素 Ⅱ最
大发射峰位和峰的形状基本不变 ,荧光发射峰和激发峰的强度都逐次下降(图 1 、2 、3 、4).以 F 0/ Fc对[ Q]
作图(F 0和 Fc分别为加入淬灭剂前后样品的荧光强度 ,[ Q]为淬灭剂浓度)结果均得一条向上直线(图 5),
表明有多个 Trp残基对黄精凝集素 Ⅱ荧光有贡献 ,并且两者呈线性关系 ,遵从 Stern-Volmer 公式(1)[ 8] :
F 0/ Fc=1+K sv[Q ] .因此 ,CsCl、KI和丙烯酰胺对黄精凝集素 Ⅱ分子中 Tyr 和 Trp残基的荧光淬灭均是
完全动态淬灭过程(扩散控制机制).
图 3　KI 对黄精凝集素Ⅱ荧光淬灭图谱
Fig.3　Quenching of P.cyrtonema Hua.Lectin
Ⅱ intrinsic fluorescence spectra by KI.
Excitation spect ra:emission w avelength at 323nm (A);
Emission spect ra:excitat ion w avelength at 281.6nm (B)
and 295 nm (C).
图 4　丙稀酰胺对黄精凝集素Ⅱ 荧光淬灭图谱
Fig.4　Quenching of P.cyrtonema Hua.Lectin Ⅱ
intrinsic fluorescence spectra by acry lamide.
Emission spect ra excitat ion wavelength at 295nm.
　　根据图 5A 和 Stern-Volmer 公式:F0/F c=1+K sv[ Q ]和推导公式:F 0/ΔF =f a-1+(f a ×K a)-1 ×
[ Q] -1(其中 K a为可被淬灭剂所接近的发色基团的 Stern-Volmer常数 , ΔF 表示加入淬灭剂前后荧光强度
的变化值 , f a为可被荧光淬灭剂所接近的发色基团占总的荧光发色基团的百分比)得出 ,阳离子淬灭剂
694 四川大学学报(自然科学版) 第 43卷
CsCl对黄精凝集素 Ⅱ内源荧光淬灭 ,在 281.6nm 和 295nm 激发时 1/K sv分别为 2.51和 2.68 ,即 50%Ty r
荧光强度被淬灭时 CsCl的浓度为 2.51mol/L , 50%Trp荧光强度被淬灭时所需 CsCl浓度为 2.68mol/ L.
同样计算出阳离子淬灭剂 CsCl对黄精凝集素 Ⅱ中 Ty r和 Trp的可接近程度均为 25%.
图 5　CsCl、KI 、丙稀酰胺对黄精凝集素Ⅱ内源荧光的淬灭作用的 Stern-Vo lmer曲线图
Fig.5　Plo ts of F0/ Fc against [ Q] of the quenching of intrinsic fluorescence of P.cyrtonema Hua.lectin Ⅱ by
CsCl 、KI and acrylamide.
Excited at 281.6nm and 295nm , A:CsC l(B):KI(C):acrylamide.
根据图 5B 和公式(1)、(2)得出阴离子淬灭剂 KI 对黄精凝集素 Ⅱ内源荧光淬灭 ,在 281.6nm 和
295nm激发时 ,1/K sv分别为 1.096和 2.222 ,即 50%Ty r 荧光强度被淬灭时 KI 的浓度为 1.096mol/ L ,
50%Trp荧光强度被淬灭时所需 KI 浓度为 2.222mol/L .同样计算出阴离子淬灭剂 KI对黄精凝集素 Ⅱ
Tyr和 Trp的可接近程度分别达到为 55.5%和 66.7%.
根据图 5C和公式(1)、(2)计算出中性淬灭剂丙烯酰胺对黄精凝集素 Ⅱ内源荧光淬灭 ,在 281.6nm 和
295nm激发时的 1/K sv分别为 0.444 和 0.71 , 即 50%Ty r 荧光强度被淬灭时丙烯酰胺的浓度为
0.444mol/L ,50%Trp荧光强度被淬灭时所需丙烯酰胺浓度为 0.71mol/L .可以得出中性淬灭剂丙烯酰胺
对黄精凝集素Ⅱ中 Ty r和 Trp的可接近程度分别达到 88.5%和 74.07%.
三种淬灭剂对黄精凝集素 Ⅱ内源荧光的淬灭作用丙烯酰胺最强 , CsCl最弱.KI 和 CsCl不及丙烯酰
胺淬灭作用强 ,一方面是因为丙烯酰胺是一种非常有效的 、不带电荷的极性淬灭剂 ,它可以进入蛋白质的
疏水内核[ 12] ,既可淬灭分子表面的荧光基团的荧光 ,也能淬灭埋在分子内部的荧光基团的荧光.带电荷
淬灭剂 KI和 CsCl并不能进入蛋白质分子内部疏水环境 ,因此只能淬灭位于分子表面或接近于分子表面
的极性环境中的 Trp 荧光.另一方面 ,在通常情况下小分子和大分子的相互作用主要通过氢键 、范德华
力 、静电作用和疏水相互作用.因此 ,可能是 Trp残基周围存在带相同电荷的极性区 ,排斥了 I-和 Cs+的
接近或被包埋的 Trp残基所处的疏水穴使 I-和Cs+不能进入[ 13] .丙烯酰胺是一种高效极性的淬灭剂 ,其
淬灭机理与S tern-Volmer方程相符合 ,所以它淬灭了黄精凝集素Ⅱ中大部分(74.07%)的 Trp残基荧光 ,
说明丙烯酰胺分子扩散到 Trp残基周围的疏水空隙中.而阴离子淬灭剂 KI 也能淬灭 66.7%的荧光 ,阳
离子淬灭剂 CsCl能淬灭 25%的荧光.表明黄精凝集素 Ⅱ分子中 Trp残基大部分是位于黄精凝集素 Ⅱ分
子表面的疏水袋中 ,小部分埋藏于分子内部疏水性环境中 ,且在实验条件(pH7.0 ～ 7.4)下黄精凝集素 Ⅱ
的 Trp残基周围有适宜 pK a的氨基酸解离 ,使发荧光氨基酸所处微环境带正电荷的比例比带负电荷的比
例高近一倍[ 14] .即表明黄精凝集素 Ⅱ的荧光基团附近有相应的酸性和碱性氨基酸分布.
参考文献:
[ 1] 　Dixon H B F.Defining a lectin[ J] .Nature , 1981(292):192.
[ 2] 　Liener I E , Sharon N , Goldstein I J.The Lectin:P roperties , Function and Application in Biology and Medicine[ M] .Lon-
don:Academic P ress , 1986.
695第 3期 刘超等:荧光淬灭作用研究黄精凝集素 Ⅱ微环境与构象的关系
[ 3] 　Peumans W J , Van Damme E J M.Lectins as plant defence pro teins [ J] .Plant Physiol , 1995 , 109:347.
[ 4] 　孙建忠 , 王克夷.天花粉凝集素的荧光光谱研究[ J] .生物化学与生物物理学报 , 1994(6):649.
[ 5] 　鲍锦库 , 曾仲奎 ,周红.黄精凝集素Ⅱ的纯化及部分性质研究[ J] .生物化学杂志 , 1996 , 12(2):165.
[ 6] 　鲍锦库 ,徐平龙 ,周红 ,等.酪氨酸的不同化学修饰对黄精凝集素生物学活性的影响[ J] .中国生物化学与分子生物学
报 , 2000 , 16(1):142.
[ 7] 　Sushama M G , Madhura M G , Islam M K.Fluorimetric studies on saccharide binding to the basic lectin from Artocarpus
hirsute[ J] .Biochemistry and Molecular Biology International , 1998 , 46(1):1.
[ 8] 　Eftink M R , Ghiron C A.F luorescence quenching studies with pro teins[ J] .Anal Chem , 1981(114):199.
[ 9] 　陶慰孙 , 李惟 ,姜涌明.蛋白质分子基础(2 版)[ M] .北京:高等教育出版社 , 1999.
[ 10] 　Burstein E A , Vedenkina N S , Ivkona M N.F luo rescence and the location of tryptophan residues in pro tein molecules[ J] .
Photochem.Photobio l , 1973 , 18:263.
[ 11] 　Nath D , Rao M.Structural and functional role of tryptophan in xylanase from an ex tremophilic Bacillus:Assessment of the
active site [ J] .Biochem Biophy s Res Commun , 1998 , 249(1):207.
[ 12] 　Gurjar M G , Khan M I , Gaikwad S M.α-Galactoside binding lectin from Artocarpus hirsuta:Characterization of the sugar
specificity and binding site[ J] .Biochim Biophys Acta , 1998 , 1381:256.
[ 13] 　刘一勇 , 周红 ,汪新艳 , 等.苦参凝集素的色氨酸残基修饰与荧光光谱研究[ J] .四川大学学报:自然科学版 , 2001 , 38
(5):738.
[ 14] 　Sneha S K , Musti J S.Fluorescence quenching , time-resolved fluorescence and chemical modification studies on the trypto-
phan residues of snake gourd (Trichosanthes anguina)seed lectin [ J] .J.Pho tochem.Pho tobiol.B:Biol , 1999 , 50:108.
Studies on the Effects of Quenchers on Micro-environment and
Conformation of Polyonatum cyrtonema Hua.LectinⅡ
LIU Chao
1、2 , XU Xiao-chao1 , L V Hong-zhou1 , LI Jian1 , KONG Y ang1 , LIU Jin-zhi 1 , BAO J in-ku1
(1.College of Life Science , Sichuan Universi ty , Chengdu 610064 , China;2.Department of
Chemist ry and Life Science , Sichuan Leshan Teachers College , LeShan 614004 , China)
Abstract:The ef fects of quenchers on the micro-environment and conformation of Polygonatum cyrtonema
Hua.LectinⅡ(PCLⅡ)were studied by fluorescence and quenching of intrinsic fluorescence analysis.Fluores-
cence studies of PCLⅡindicated that tryptophan residues locate in a relatively hydrophobic region.Fluores-
cence quenching show ed that acrylamide , KI and CsCl are able to quench 74.07%, 66.7%, 25%of the in-
trinsic f luorescence of tryptophan and 88.5%, 55.5%, 25% of the int rinsic fluorescence of ty rosine in PCL
Ⅱ , respectively.Furthermo re , the kinetics of quenching reactions w as only due to dynamic quenching pro-
cesses.The ex tent of quenching observed w as the highest w ith acry lamide , low er w ith KI , and the lowest
w ith CsCl , further supporting that t ryptophan residues are partially buried in a relatively hydrophobic core o r
predominantly positively charged areas near the surface of the PCLⅡmolecule.
Keywords:Polygonatum cyrtonema Hua.Lectin Ⅱ(PCL Ⅱ);fluorescence spect rum;fluorescence quench-
ing ;micro-environment.
696 四川大学学报(自然科学版) 第 43卷