全 文 ：第 24卷 第 9期
2 0 0 6年 9月
中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
Vo.l 24 No. 9
Sep. 2 0 0 6
中医药
1627
学刊
藤茶双氢杨梅树皮素抗肝癌 H22的实验研究
郑作文,阎 莉
(广西中医学院, 广西 南宁 530001)
摘 要:目的: 探讨双氢杨梅树皮素 ( Am pe lopsin, APS)的抗肿瘤作用。方法: 以 MTT法观察 APS及其含药血
清体外对肝癌 H22细胞及对小鼠肝癌 H22实体瘤的抑瘤作用。结果: APS及其含药血清均能明显抑制体外培养的
H22细胞的生长, APS的 IC50为 18. 65Lg /mL, 20%、10% 含药血清的抑瘤率分别为 35. 04%、30. 91% ; APS灌胃给
药对荷瘤 H22小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用, 600m g /kg剂量组的抑瘤率为 27. 38%。结论: APS对体外 H22细
胞和体内肝癌 H22实体瘤均有抑制作用。
关键词:蛇葡萄素;抗肿瘤作用; H22
中图分类号: R -33 文献标识码: B 文章编号: 1009 -5276( 2006) 09 - 1627 -03
收稿日期: 2006 - 03 - 15
作者简介:郑作文 ( 1957 - ) ,男, 山东沂源人, 教授,硕士,研究方
向:中药药理。
蛇葡萄素是藤茶总黄酮中主要的单体化合物 [1], 广泛
存在于藤茶、无刺根等中草药植物中, 且在藤茶中含量较
高 [2 ]。有文献报道, APS对白血病细胞 HL - 60、K 562以及
肝癌 Be l - 7402细胞的生长具有抑制作用 [ 3]; 刘德育等人
的研究也证实 APS体外对人鼻咽癌 HK - 1细胞和人乳腺
癌 MCF - 7细胞及体内对小鼠移植性 B16黑色素瘤的生长
均具有显著的抑制作用 [4 ]。本研究应用 APS肝癌 H22细胞
研究,以进一步揭示 APS的体内外抗肿瘤的作用。
1 材 料
1. 1 仪器 SUNRISE自动酶标仪为奥地利 TECAN公司
产品; 311二氧化碳培养箱为美国 Therm o Form a公司产品;
DLF560型超净工作台为荷兰 c lea rA ir Techniek bv公司产
品;倒置显微镜为德国 Leica BM IRB公司产品; 微量移液器
为法国 P ipe tm an公司产品, 十万分之一电子天平为德国赛
多利斯公司产品。
1. 2 药品与试剂 APS由广西中医学院中药化学教研室
从广西藤茶中提取而得。注射用环磷酰胺 ( cy clopho spha-
m ide, CPA )为上海华联制药有限公司产品, 批号 010914;
RPM I -1640培养基为 G IBCO公司产品, 批号 1243098; 新
生牛血清 ( NBS )为杭州四季青公司产品, 批号 040228; 四
甲基二氮唑蓝 (M TT)为北京拜尔迪生物公司分装, Am re sco
0793; 二甲基亚砜 ( DM SO )为生工生物工程 (上海 )有限公
司产品,批号 54186; 注射用生理盐水为四川奇力制药有限
公司产品,批号 041018。
1. 3 细胞系 腹水型肝癌 H 22瘤株由广西民族医药研究
所提供。
1. 4 实验动物 健康昆明小鼠, 体重 ( 20 ? 2) g, 雌雄均
用,由广西中医学院实验动物中心提供, 合格证号: 桂医动
字第 1104号。
1. 5 培养液的配制 RPM I1640不完全培养液:不加血清
的 RPM I1640培养液; RPM I1640完全培养液: 10% 新生牛
血清 + RPM I1640不完全培养液。
2 方 法
2. 1 H22细胞的培养 无菌抽取 8日龄荷瘤小鼠腹腔内瘤
细胞,以 RPM I1640不完全培养液洗 2次, 用 RPM I1640完
全培养液调整细胞数成 5 @ 104 ce lls /mL的细胞悬液, 置
37e 、5% CO2 培养箱中培养 24h, 加入含药血清, 每孔
100LL, 均设 5个复孔, 使含药血清终浓度分别为 20%、
10% , 并用相同浓度的空白组血清作对照。在 37e 、5%
CO
2
培养箱中培养 48h, 加入 M TT( 5m g /m L) 10LL继续培
养 4h,离心, 弃上清,加入 DMSO200LL,振荡 10m in, 以酶标
仪在 570nm处测各孔 OD值, 计算抑瘤率。抑瘤率% = (空
白组血清平均 OD值 -血清组平均 OD值 ) /空白组血清平
均 OD值 @ 100%。
2. 2 体外抑瘤实验 将 H22细胞 ( 1 @ 105 ce lls /m L)接种到
96孔细胞培养板上, 每孔 100LL, 并设空白对照孔 (只加
RPM I1640完全培养液, 不加细胞 )。置 37e 、5% CO 2培养
箱中培养 24h, 然后加入不同浓度的 APS, (终浓度分别为
50. 00、35. 70、25. 50、18. 22、13. 02、9. 27、6. 64、4. 74Lg /
ML ),每个浓度均设 5个复孔, 同时设细胞对照孔 (只加细
胞和 PRM I1640完全培养液, 不加药物 )。在 37、5% CO2培
养箱中培养 48h, 加入 MTT( 5mg /mL ) 10LL继续培养 4h,离
心,弃上清, 加入 DM SO200LL, 振荡 10m in, 以酶标仪在
570mm处测各孔吸光度值 ( OD ), 计算抑制率, 用回归法计
算半数杀伤浓度 ( IC
50
)。肿瘤细胞生长抑制率 = ( 1 -实验
组平均 OD值 /对照组平均 OD值 ) @ 100%
2. 3 含药血清抑瘤实验 [5 ] ¹ 含药血清的制备: 取健康
小鼠 12只,分为空白对照组、APS血清组。APS血清组给
药剂量为 600mg /kg, 空白对照组给蒸馏水,均灌胃给药, 每
天 2次, 连续 3天。末次药后 1h,取血分离血清, 于 56e 温
育 30m in灭活, 用 RPM I1640不完全培养液分别释稀至
40%、20% , 滤菌, 4e 保存备用。º将 H22细胞 ( 1 @
105 ce lls /mL )接种到 96孔细胞培养板上, 每孔 100LL, 设空
白对照孔 (只加 RPM I1640完全培养液不加细胞 )。接种后
置 37e 、5% CO2 培养箱中培养 24h, 加入含药血清, 每孔
100LL, 均设 5个复孔, 使含药血清终浓度分别为 20%、
10% , 并用相同浓度的空白组血清作对照。在 37e 、5%
CO2培养箱中培养 48h, 加入 M TT( 5m g /m L) 10LL继续培
养 4h,离心, 弃上清,加入 DMSO200LL,振荡 10m in, 以酶标
仪在 570mm处测各孔 OD值, 计算抑瘤率。抑瘤率% =
(空白组血清平均 OD值 -血清组平均 OD值 ) /空白组血
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DOI：10.13193/j.archtcm.2006.09.45.zhengzw.020
中 医 药 学 刊 2006年第 24卷
中医药
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学刊
清平均 OD值 @ 100%。
2. 4 对小鼠移植性肝癌 H22的抑制实验 取健康小鼠,无
菌条件下取 H22瘤液,以生理盐水 1B3稀释,于小鼠右腋皮
下接种 0. 2mL ( H22细胞悬液后, 随机分为 4组: 空白对照
组、CPA阳性对照组 ( 15m g /kg)、APS大剂量 ( 600mg /kg )、
小剂量 ( 300m g /kg)组。空白对照组给生理盐水,除阳性对
照组腹腔给药外,其余各组均灌胃给药,给药容积为 20m L /
kg。接种瘤体 24h后开始给药, 每天 1次,连续 10天。停
药次日处死动物,称瘤重,计算瘤重系数和抑瘤率。瘤重系
数% =瘤重 /体重 @ 100% ;抑瘤率% = ( 1 -给药组平均瘤
重 /对照组平均瘤重 ) @ 100%。
3 结 果
3. 1 对体外培养的 H22细胞的抑制作用 用 MTT法观察
不同浓度的 APS对体外培养的 H22细胞的影响, 结果如表 1
所示,当 APS终浓度为 50. 00、35. 70、25. 50、18. 22、13. 02、
9. 27Lg /m L时, 抑瘤率与细胞对照组相比差异有非常显著
性 ( P < 0. 01);当 APS终浓度为 6. 64、4. 74Lg /mL时,抑瘤
率与细胞对照组相比差异有显著性 ( P < 0. 05), 提示其有
强的体外抑制 H22细胞作用。通过抑瘤率对药物浓度作直
线回归方程,得到药物对 H22细胞的半数杀伤浓度 ( IC50 )为
18. 65Lg /mL。
表 1 APS对 H22细胞的抑制作用 ( …X ? s )
药物浓度
(Lg /mL) OD值
抑瘤率
(% )
IC50
( Lg /m L)
细胞对照组 - 0. 849 ? 0. 103 - -
50. 00 0. 304 ? 0. 030* * 64. 23
35. 70 0. 338 ? 0. 053* * 60. 16
A 25. 50 0. 353 ? 0. 077* * 58. 44
P 18. 22 0. 439 ? 0. 013* * 48. 23
S 13. 02 0. 438 ? 0. 029* * 48. 38 18. 65
组 9. 27 0. 439 ? 0. 018* 48. 23
6. 64 0. 647 ? 0. 104* 23. 82
4. 74 0. 686 ? 0. 050* 19. 18
注:与细胞对照组比较, * * P < 0. 01, * P < 0. 05。
3. 2 含药血清对体外培养的 H22细胞的抑制作用 用
MTT观察了不同浓度的 APS含药血清对体外培养的 H22细
胞的影响, 结果如表 2所示, 浓度分别为 20%、10% APS含
药血清的抑瘤率与空白组血清的抑瘤率相比, 差异有非常
显著性 ( P < 0. 0 1)。
表 2 APS含药血清对 H22细胞的抑制作用 ( …X ? s )
APS含药血清 空白组血清 抑瘤率
(% )
20%血清浓度 OD值 0. 817 ? 0. 155* 1. 257 ? 0. 034 35. 04
10%血清浓度 OD值 1. 015 ? 0. 204* 1. 470 ? 0. 079 30. 91
注:与空白血清组比较, * P < 0. 01。
表 3 APS对 H
22
小鼠瘤重的影响 ( …X ? s )
n
剂量
(m g /kg)
瘤重
( g)
瘤重系数
(% )
抑瘤率
(% )
空白对照组 10 - 3. 48 ? 0. 97 8. 45 ? 2. 04 -
CPA组 12 15 1. 95 ? 0. 61* * 14. 30 ? 6. 31* 44. 06
大剂量组 12 600 2. 53 ? 0. 90* 12. 03 ? 4. 73* 27. 38
小剂量组 10 300 3. 28 ? 0. 88 11. 78 ? 2. 70 5. 73
注:与空白对照组比较, * * P < 0. 01, * P < 0. 05。
3. 3 对小鼠移植性肝癌 H22的抑制作用 结果如表 3所
示, APS大、小剂量连续给药 10天, CPA组和 APS大、小剂
量组的抑瘤率分 ( P < 0. 05),而小剂量组与空白对照组差
异无显著性。
4 讨 论
恶性肿瘤严重威胁人类的健康。长期以来, 国际社会
花费巨资用于寻找抗肿瘤的新药和方法, 从中国传统医药
中筛选抗癌新药,日益受到国内外学者的青睐。黄酮类化
合物是一类存在于多种植物中的多酚化合物, 研究发现它
们具有许多潜在的药用价值, 其中抗肿瘤作用是一个研究
热点。许多种黄酮类化合物如槲皮素、大黄素、茶多酚、
Geniste in等均具有一定的抗肿瘤作用, 它们能抑制多种信
号转导分子如 PKC、IP3、酪氨酸激酶等 [6] ,同时黄酮类化合
物还有抗氧化、抑制 DNA拓扑异构酶、DNA多聚酶、诱导
细胞分化等作用。APS作为广西藤茶中含量最高的黄酮类
单体化合物 [7], 其有镇咳祛痰、降脂保肝、抗血栓、抗氧化
及降血糖等作用 [7 - 9]。近期, 周宁宁和刘德育等人的研究
证实了 APS还有抑制肿瘤细胞生长的作用 [3 - 4 ]。本文的
进一步研究发现, APS不仅体外对肝癌 H
22
细胞有抑制作
用,呈现出一定的剂量依赖趋势, 且具有明显的体内抗肿瘤
作用,提示 APS有抗癌活性, 其作用机制可能是直接杀伤
癌细胞。
中药血清药理学是指在动物经口服给药后一定时间采
血分离血清, 用此含药血清进行体外实验的一种实验方
法 [10 ]。这种新的实验方法可排除在体外实验中各种干扰
因素的影响,比较接近药物在体内环境中产生药理效应的
真实过程。APS含药血清对体外培养的肝癌 H22细胞的增
殖有明显的抑制作用,而且随着血清浓度升高,血清对 H22
细胞的抑制率也升高。提示 APS和 /或其代谢产物可能对
肝癌 H22细胞具有杀伤能力。血清中药物的作用形式、浓
度与抑制肿瘤细胞生长的关系,有待进一步研究。
参考文献:
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利用现状 [ J].中成药, 2002, 12( 24 ) : 971
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作用研究 [ J].广东药学, 2000, 10( 4) : 7
[ 4 ] 刘德育,罗曼,谢冰芬, 等.蛇葡萄素的抗肿瘤作用研究 [ J ].
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中国药理学通报, 1999, 15 ( 6) : 569
[ 6 ] W eberG, S hen F, Prajda N, et a.l Regu lation of the sigm al trans-
du ct ion p rogram by drugs[ J]. AdV. Enzvm e Regu,l 1997, 37: 35
[ 7 ] 覃洁萍,钟正贤,周桂芬, 等.双氢杨梅树皮素降血糖的实验
研究 [ J].中国现代应用药学杂志, 2001, 18( 5 ) : 351
[ 8 ] 覃洁萍,许学键,钟正贤, 等.广西藤茶中双氢杨梅树皮素的
提取、鉴定及药理活性研究 [ J ]. 中国中药杂志, 1999, (增
刊 ) : 85
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素的药理研究 [ J ].中国民族医药杂志, 1998, 7( 3 ) : 42
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$ 始D ? 药物血中浓度测定 N新 7 $ 世界 [ J ]. TDM研究,
1988, ( 5 ) : 54
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The Epermi enta l S tudy of Ampelops in on Ant itumor Effect
Zheng Zuowen, Yan L i
( Guang X i TCM Un ive rsity, Nanning 530001, Guangx,i China)
Abstrac:t Ob jective: To investigate the anti - tumo r effect o f Ampe lopsin( APS ) in v itro and in v ivo. Me thods : Cy to tox itity
effect o fAPS and APS serum on mouse hepa tic cancerH22 in m ice was observed. Results : APS cou ld obv iously inhib it the g row th of
cultured H22 cells, the IC50 ( 48 hours incuba tion) w as 18. 65Lg /mL. APS serum could a lso inhibit the H22 cells, the inhib ition rates
we re respective ly 35. 04% and 30. 91% under the serum concentration o f 20% and 10% . APS had sign ificant antitum or ac tivity on
m ice bearing H22. the inhibition ra te s wa s 27. 38% in 600m g /kg - do ses g roups. C onclusion: APS can inhibit the g row th o fH22 in
v itro and in v ivo.
Keywords: Ampelopsin; antitumo r e ffec;t H22
收稿日期: 2006 - 03 - 05
作者简介:邓悦 ( 1962 - ) ,男,辽宁沈阳人,教授,博士,主要从事中医药治疗心血管疾病及糖尿病慢性并发症研究。
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糖尿病大鼠肾脏 PPARCmRNA表达及
解毒通络保肾胶囊干预研究
邓 悦 1,李 才 2, 赵贤俊 3,南 征 1
( 1. 长春中医药大学附属医院,吉林 长春 130021; 2. 吉林大学再生医学科学研究所, 吉林 长春 130021;
3.延边医学院附属医院, 吉林 延吉 133000)
摘 要:目的:研究糖尿病大鼠肾脏组织过氧化物酶体增殖物激活受体 C( PPARC) mRNA表达及中药解毒通
络保肾胶囊的调节作用。方法: 42只W istar大鼠用链脲佐菌素诱发糖尿病后, 随机分为 DM组、罗格列酮治疗组
和解毒通络保肾胶囊治疗组, 以正常 10只大鼠作为对照。连续处理 12周后, 应用 RT - PCR检测肾皮质过氧化
物酶体增殖物激活受体 C( PPARC) mRNA的表达水平。结果: DM大鼠肾皮质 PPARCmRNA表达降低, 解毒通络
保肾胶囊治疗组 PPARCmRNA高于 DM组 (P < 0. 05)。结论:解毒通络保肾胶囊对 DM 肾脏病变有保护作用, 其
机制可能是通过激活 PPARC途径,调控相关基因表达,改善糖脂代谢, 减少细胞外基质的积聚。
关键词:糖尿病;过氧化物酶体增殖物激活受体 C;解毒通络保肾胶囊; 细胞外基质
中图分类号: R -33 文献标识码: B 文章编号: 1009 -5276( 2006) 09 - 1629 -03
糖尿病肾病 ( DN )早期的病理特征是肾脏肥大,肾小球
基底膜增厚和系膜基质进行性积聚。其发病机制十分复
杂,有诸多因素参与其发生发展, 其中胶原降解酶系统、细
胞因子和生长因子起重要的作用。近年来研究发现过氧化
物酶体增殖物激活受体 C( PPARC)参与 DN发展过程, 并
涉及肾小球血液动力学改变、细胞外基质 ( ECM )代谢、细
胞增殖和细胞肥大等诸多方面。采用激活 PPARC途径进
行干预后能明显抑制 DM大鼠肾脏肥大和 ECM的产生 [1 ]。
本实验旨在观察解毒通络保肾胶囊对糖尿病 ( DM )大鼠肾
脏的保护作用,并通过观察它对 DM大鼠肾组织 ECM积聚
的影响探讨其作用机制。
1 材料与方法
1. 1 材料 链脲佐菌素 ( STZ )为美国 S igm a公司产品,解
毒通络保肾胶囊由吉林省中医院制剂室提供, 兔抗大鼠
T IMP -2多克隆抗体、Ô 型胶原 ( Co l Ô )和纤维连接蛋白
( FN )多克隆抗体 (即用型 )、辣根过氧化物酶标记山羊抗
兔 IgG、H IGH - SABC试剂盒为武汉博士德公司产品, 逆转
录酶试剂盒由 Invitrogen公司生产, F ag酶为北京鼎国生物
技术发展中心产品, DNA M arker( DL - 2000)由 Faka ra公司
提供。日立 7150型全自动生化分析仪, UV755B分光光度
计, W ha tm an PCR扩增仪及 Tanon G IS - 1000凝胶图像处
理系统。根据文献 [6]合成 PPARC和 B - actin两对寡核苷
酸引物。 PPARC引物序列: 上游 5. CTT CGG AAT CAG
CTC TGT GGA C - 3.下游 5. GCA TCC TTC ACA AGCATG
GAC TC - 3. , B - ac tin上游 5. GTG GGG CGC CCC AGG
CAC CA -3.下游 5. CTTCCT TAA TGT CAC GCA CGA TTT
C - 3. 引物由北京鼎国生物技术发展公司合成。
1. 2 动物模型的建立及分组 W ista r大鼠 52只,雌雄各
半,体重 180~ 210g,按性别、体重随机分为正常对照组 ( N
组, 10只 ); DM组 ( D组, 14只 ); DM +罗格列酮治疗组 ( DL
组, 14只 ); DM +解毒通络保肾胶囊治疗组 ( D J组, 14只 )。
大鼠 DM模型的制备: 单次腹腔注射 STZ 50m g /kg(临用前
用 0. 1mo l /L枸橼酸缓冲液溶解, pH4. 2), 正常对照组仅腹
腔注射等体积上述缓冲液。注射 STZ 72h后, 尾静脉采血
测空腹血糖并同时测尿糖, 血糖 \ 16. 7mm o l /L, 尿糖
+ + +以上者列入 DM观察对象。
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