全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2012)01 － 0236 － 04
收稿日期:2011 － 07 － 14
基金项目:国家自然科学基金项目(C01010602)
作者简介:冯健玲(1960 －) ，女，广西桂平人，副教授，研究方向
为微生物生态和生物防治。
广西杨梅根瘤 Frankia菌的分离和培养特性研究
冯健玲，何新华，李一伟，李 峰，秦荣耀
(广西大学农学院，广西 南宁 530005)
摘 要:采用根瘤切片法从广西本地杨梅根瘤中分离获得 3 株内生菌，经镜检、革兰氏染色和 BAP无氮培养基培养，证实这 3 株内
生菌为 Frankia sp．，分别命名为 MF3、MF6 和 MF9。对这 3 株分离株在不同碳源、氮源和 pH值的培养特性进行研究。结果表明，3
株分离株在分别以吐温 － 80、葡萄糖、丙酸钠为碳源的 BAP培养基上生长良好，3 株分离株对琥珀酸钠的利用较差;适宜的氮源为
酵母膏、酪蛋白和氯化铵，尿素的利用率低。3 株分离株均适合在 pH 5． 5 ～ 6． 5 范围内生长，pH 7． 0 以上生长受到抑制。
关键词:杨梅;Frankia;资源;分离;培养特性
中图分类号:S667． 6 文献标识码:A
Isolation and Cultural Features of Frankia on
Root Nodule of Red Bayberry in Guangxi
FENG Jian-ling，HE Xin-hua，LI Yi-wei，LI Feng，QIN Rong-yao
(College of Agriculture，Guangxi University，Guangxi Nanning 530005，China)
Abstract:Three endophytes，isolated from root nodules of red bayberry (Myrica rubra)by nodule sectioning in Guangxi，were identified as
Frankia sp． dubbed MF3，MF6 and MF9． based on the results from microscopic examination，Gram-staining，and cultural characteristics on
N-deficient BAP medium． Effects of carbon sources，nitrogen sources and pH on three Frankia strains were studied by microscopic． The re-
sults showed that three Frankia strains grew very well on BAP medium with tween-80，glucose，sodium propionate as sole carbon source re-
spectively，but the three strains didn’t respond well to amber acid． Yeast extracts，casamino acid and ammonium chloride turned out to be
appropriate nitrogen source． The utilization rate of urea was low． The three strains grew well under the range of pH5． 5 － 6． 5，but they were
inhibited with the pH value over 7． 0．
Key words:Myrica rubra;Frankia;Resources;Osolation;Cultural characteristics
弗兰克氏菌(Frankia)是一类能与非豆科植物
共生结瘤进行固氮作用的放线菌。杨梅 (Myrica
rubra)是我国南方的特产水果，也是一种能与弗兰
克氏菌共生结瘤固氮的果树。在自然状态下，
Frankia在杨梅根部形成根瘤，通过共生体系固定大
气中的氮素，改善根系周围的土壤肥力，使其在养分
贫瘠的土壤中生长良好 ［1］。因此，杨梅是一种治理
水土流失、改善生态环境且经济效益显著的优良经
济林果树种，开展杨梅根瘤 Frankia 的研究具有重
要的经济价值和生态价值。
自从 1978 年 Callaham［2］等从香蕨木根瘤中分
离出 Frankia菌并成功进行离体培养，对 Frankia 的
研究取得了较大进展。目前为止，国内外已有不少
从杨梅中分离到内生菌纯培养物，并进行相关的生
物学特性研究的报道。日本的 Hiyoshi 等［3］和中国
科学院沈阳应用生态研究所的丁鉴和张忠泽 ［4］从
杨梅根瘤中曾分离出 Frankia 菌株;何新华等 ［5］研
究了 3 株浙江杨梅 Frankia 的形态培养、碳氮源利
用及固氮活性;范小明［6］研究了 1 株福建杨梅共生
菌在不同条件下的回接侵染效果;李志真［1］对福建
南部、中部和东北部的杨梅根瘤共生菌进行了分离
和菌株培养、初步鉴定及侵染特性检测。由于杨梅
地理分布广泛，能被不同类群的 Frankia 侵染，是混
杂性宿主［7 ～ 8］，从杨梅根瘤中分离获得的 Frankia菌
分离株存在着丰富的遗传多样性［9］。开展广西杨
梅根瘤 Frankia 的分离培养和研究，有利于丰富
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西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2012 年 25 卷 1 期
Vol. 25 No. 1
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2012.01.059
Frankia菌种资源，对于了解不同地域、保护和利用
Frankia资源具有重要意义。
1 材料与方法
1． 1 材料
供试根瘤采自广西大学农学院果树种质资源圃
的广西本地杨梅。
1． 2 方法
1． 2． 1 分离方法 采用根瘤切片法和 Q + +改良培
养基［10］分离 Frankia菌株。
1． 2． 2 分离菌株固体培养特征 将分离菌株接种
于 Q + +平板培养基和斜面培养基中，置于 27 ℃下
黑暗静止培养。培养 20 d后，观察培养特征。
1． 2． 3 分离株液体培养特征 将在Q+ +液体培养基
上同步培养的不同分离株离心收集沉淀，用无菌水洗涤
并将沉淀悬浮均匀制成菌悬液，分别取等量菌悬液接种
于 BAP［10］无氮液体培养基中。接种后，置于 27 ℃下黑
暗静止培养。培养20 d后，观察菌体生长状况。
1． 2． 4 菌体形态观察 采用贴片法将分离菌株接
种于 Q + +培养基平板，同时接种于 BAP无氮液体培
养基，分别于培养 7 ～ 10、20、30 d 的时间段取样，光
学显微镜下观察菌体形态。
1． 2． 5 碳源的利用 选取琥珀酸钠、丙酸钠、吐温
－ 80、葡萄糖 4 种碳源分别加到无碳源的 BAP 培养
基中(0． 1 % NH4Cl 为氮源) ，终浓度为 0． 1 %，以
无碳源的 BAP 培养基作为对照。将不同分离株菌
悬液等量接种到上述不同碳源的培养基中，同一分
离株相同处理重复 3 次。置于 27 ℃的培养室中暗
培养 20 d，用 Bradford 改良法［11］测定菌体蛋白含
量，用菌体蛋白含量代表菌体生长状况。
1． 2． 6 氮源的利用 选取酵母膏、尿素、氯化铵、酪
蛋白水解物 4 种氮源分别加到无氮源的 BAP 培养
基中(0． 05 %的丙酸钠为碳源) ，终浓度为 0． 05 %，
以无氮源的 BAP 培养基为对照。将不同分离株菌
悬液等量接种到上述不同氮源的培养基中，同一分
离株相同处理重复 3 次。置于 27 ℃的培养室中暗
培养 20 d，测定菌体蛋白含量，用菌体蛋白含量代表
菌体生长状况。
1． 2． 7 pH 对分离菌株生长的影响 以 BAP 为基
础培养基，0． 1 %葡萄糖为碳源，0． 05 %酪蛋白水
解物为氮源，采用 pH 计测定并调节培养基的 pH
值，pH值分别设 5． 5、6． 0、6． 5、7． 0、7． 5、8． 0 6 个处
理;将不同分离株菌悬液等量接种到上述不同 pH
值的培养基中，同一分离株相同处理重复 3 次。置
于 27 ℃的培养室中暗培养 20 d，测定菌体蛋白含
量，用菌体蛋白含量代表菌体生长状况。
2 结果与分析
2． 1 杨梅根瘤 Frankia菌株分离结果
采用根瘤切片法和 Q + +培养基进行杨梅根瘤
弗兰克氏菌的分离，分离培养约经过 10 d，原接种黑
色瘤瓣组织边缘陆续开始长出淡黄色或桔黄色生长
物，其后该生长物逐渐扩大，形成表面隆起、光滑，有
光泽的菌落。长时间培养后，有的菌株菌落会变黑
褐色，有褶皱。培养 35 d后将菌落转移至 Q + +液体
培养基培养 20 d，在 Q + +固体培养基上划线培养获
得单菌落，经镜检和革兰氏染色初步确认分离获得
的 9 株分离物均为 Frankia 的成员，革兰氏阳性菌。
选择其中的MF3、M F6、MF9 3 株分离菌株进一步研
究菌体形态和培养特性。
2． 2 分离菌株培养特征观察
2． 2． 1 分离菌株固体培养特征 在 Q + +平板培养基
上 Frankia MF3、M F6、MF9 菌株培养前期形成圆形
较小的菌落，桔红色、淡黄色、淡粉色等，以后菌落逐
渐长大，至培养后期(30 ～ 50 d)菌落颜色和形状发
生变化。其中，MF3 菌株由桔黄色圆形菌落逐渐变
为黑褐色，有光泽;MF6 菌株由表面光滑的淡黄色
圆形菌落，逐渐变为表面干燥，有褶皱的黑色菌落;
MF9 菌株由初期淡黄色圆形菌落，逐渐变为表面突
起、有褶皱的淡黄色菌落。
2． 2． 2 分离菌株液体培养特征 分离菌株经 Q + +
液体培养基培养，菌体沉入底部，团絮状生长，或粘
附于瓶壁，后期生长菌体表现出与固体培养菌落相
同的颜色。分离菌株能在 BAP 无氮培养基中生长
良好，在 BAP无氮液体培养时，出现白玉色、淡粉色
絮状生长，摇动分散形成小颗粒状，静止不悬浮而沉
淀在瓶底。
2． 3 分离菌株显微形态观察
通过光学显微镜可观察到分离菌株的菌丝体、
泡囊和孢囊结构。
菌丝体:分离菌株菌丝体波曲有分枝，粗细不
一，MF3 直径 0． 5 ～ 0． 7 μm、MF6 直径 0． 3 ～ 0． 5
μm、MF9 直径 0． 4 ～ 0． 6 μm。
泡囊:着生于菌丝的顶端或中间，桃形、草莓形
或灯笼形，表面光滑、浅薄通透，边缘清晰，具囊状结
构。大小约为 3． 3 ～ 6． 1 μm × 3． 0 ～ 5． 0 μm，每个
泡囊基部均有一着色深的泡囊内含物。内含物呈三
角形、半圆形或其他不规则形(图 1 a)。
孢囊和孢囊孢子:泡囊膨大产生孢子囊腔，孢子
囊呈多腔结构，内含孢子，孢囊呈卵形、草莓形、不规
则球形或纺锤形。单生或多个叠生，孢囊表面凹凸
不平，形似桑树果实桑葚。在更长时间(30 d以上)
7321 期 冯健玲等:广西杨梅根瘤 Frankia菌的分离和培养特性研究
a．泡囊形态(1000 ×) ;b．孢囊及其凹凸不平的表面(1000 ×) ;c．成熟破裂的孢囊和释放的孢囊孢子(1000 ×)
a． Vesicle morphology (1000 ×) ;b． Uneven surface of cysts (1000 ×) ;c． Mature cysts rupture and release sporangiospores (1000 ×)
图 1 MF6 菌株菌丝体、泡囊及孢囊
Fig． 1 Mycelium，vesicles and cysts of strain MF6
的培养物中可观察到破裂的孢囊和释出的孢囊孢
子。孢囊成熟球形、卵圆形，直径 1． 1 ～ 1． 4 μm，不
运动(图 1 b、图 1c)。
2． 4 分离菌株对碳源的利用
在添加不同碳源的 BAP 液体培养基中培养 20
d后，MF3、MF6、MF9 分离菌株对不同碳源的利用情
图 3 不同氮源对 Frankia MF3、MF6、MF9 菌株生长的影
响
Fig． 3 The effect of nitrogen sources on the growth of Frankia MF3，
MF6 and MF9
况见图 2。3 株分离株均能利用葡萄糖、丙酸钠和吐
温为碳源生长。其中，3 株分离株在以吐温 － 80 为
唯一碳源时，菌体生长最快;葡萄糖和丙酸钠次之。
3 株分离株对琥珀酸钠的利用均较差。
2． 5 分离菌株对氮源的利用
在添加不同氮源的 BAP 液体培养基中培养 20
d后，MF3、MF6、MF9 分离菌株对氮源的利用情况
见图 3。分离菌株均能利用氯化铵、酵母膏和酪蛋
白为唯一氮源生长。其中，MF3 菌株对酪蛋白利用
最好，氯化铵和酵母膏次之;MF6、MF9 菌株在以酵
母膏为唯一氮源时生长最好，氯化铵和酪蛋白次之。
3 株分离菌株对尿素的利用均较差。
2． 6 pH值对分离菌株生长的影响
在不同 pH值的 BAP 液体培养基中培养 20 d，
MF3、MF6、MF9 分离菌株的菌体生长量见图 4。3
株分离菌株在酸性条件下生长最快，随着 pH 值的
升高，生长受到抑制，pH值上升至中性时，生长开始
减缓，pH值上升至 8． 0 时，3 个分离菌株几乎停止
生长。其中 MF3 菌株在 pH 6． 0 生长最快，MF6 和
MF9 菌株在 pH 5． 5 生长最快。
图 4 不同 pH 值对 Frankia MF3、MF6、MF9 菌株生长
的影响
Fig． 4 The effect of different pH on the growth of Frankia MF3，
MF6 and MF9
832 西 南 农 业 学 报 25 卷
3 讨 论
从杨梅根瘤中分离获得的 Frankia 菌分离株表
型存在差异，菌株间呈现出丰富的多样性［9］。本研
究利用根瘤切片法和 Q + +培养基进行杨梅根瘤弗
兰克氏菌(Frankia)分离，不同分离菌株菌落形态和
颜色不同，同一菌株用不同的培养基培养，菌落形态
和颜色也不相同;分离菌株形态培养特征具有分枝
状菌丝、泡囊、孢囊等典型 Frankia 菌的特征性结
构。
杨梅根瘤 Frankia 在无氮培养基上能诱导生成
泡囊结构，从而使弗兰克氏菌纯培养在大气压下就
能固氮。固氮作用发生在泡囊中，NH +4 的进一步同
化则是在菌丝中进行［9］。本研究利用 BAP 无氮液
体培养基进行无氮诱导，分离菌株能在 BAP无氮培
养基上良好生长，具有固氮活性。经显微观察分离
株形成泡囊结构，其泡囊的固氮酶活力大小及感染
结瘤性将在今后的研究中进一步探讨。
有研究报道，从杨梅中分离的弗兰克氏菌能很
好地利用丙酸钠、乙酸钠等小分子有机酸或有机酸
盐和脂肪酸衍生物如吐温［4，12］，从杨梅属分离的菌
株一部分能利用糖，另一部分不能利用。本研究中
3 株分离株利用吐温效率最高，生长最快，能利用葡
萄糖和丙酸钠为碳源生长。
与杨梅共生的 Frankia 能利用的氮源主要有氨
基酸、尿素、硝酸盐、腺嘌呤、脲嘌呤、氨和氮气，
NH4Cl 和酪蛋白水解物是 Frankia 菌很好的氮
源［9］。本研究中的 3 株 Frankia 菌能很好利用
NH4Cl、酵母膏及酪蛋白为氮源生长。
本研究从杨梅根瘤分离的 Frankia 菌株在酸性
条件下生长良好，pH 大于 7． 0，Frankia 菌株生长受
到抑制，这是因为广西大多为酸性红壤，杨梅长期种
植在酸性土壤而适应环境的结果。
致 谢:本研究照片由广西大学农学院连云鹏教授
拍摄，特此致谢!
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(责任编辑 温国泉)
9321 期 冯健玲等:广西杨梅根瘤 Frankia菌的分离和培养特性研究