全 文 ：　中
药
研
究
水杨梅根提取物的体外抗肿瘤活性
　　叶　勇　涂先琴　宋兴文　施敏荣　江　虹
华南理工大学化工与能源学院 ,绿色化学产品技术广东省重点实验室　广州　510640
　　基金项目:华南理工大学自然科学基金资助项目(322-E5041170);学生研究计划 SRP项目(B10-Y13014)
Fund project:Item suppor ted by Natural Scientific Fund of South China University of Science and Eng ineering (322-
E5041170);item of S tudents Research Plan(SRP)(B10-Y13014)
摘要:[目的] 分离筛选水杨梅根中抗直肠癌细胞活性部位。[ 方法] 采用系统溶剂法对水杨梅根水提取物进行分离 , 应用 MT T
比色法对分离得到的部位进行体外抗肿瘤活性的测定。[结果] 乙酸乙酯提取物对直肠癌 LS174T 细胞表现出较强的抑制作用 ,
在测定浓度范围内呈现出良好剂量依赖性抑制作用 ,而正丁醇和氯仿提取部位的抑制作用较弱。[ 结论] 乙酸乙酯提取部位是
水杨梅抗肿瘤主要的活性部位。
关键词:MT T 法;水杨梅根;直肠癌
中图分类号:R285. 6　文献标识码:A　文章编号:1005-5509(2007)02-0372-02
Anticancer Effects of Root of Adina Rubella Hance Extract in Vitro Ye Yong , Tu Xianqin , Song Xinwen , e t al Pharmaceutical En-
gineering Department , Chemical Engineering College , South China University of Technology , Guangzhou(510540)
Abstract:[ Objective] To screen the anticance r f raction f rom ex tract o f roo t of Adina rube lla H ance. [ Methods] To separa te the
w ater e xtr act f rom roo t of Adina rubella H ance by different solvens , then determine their anticancer activities of the different e x-
tr acts in v itr o with MT T me thod. [ Results] The ethylace ta te ex tract str ongly inhibited cell prolifera tion o f LS174T , and showed
significant do sage-dependent re sponse w hile the butanol ext ract and the chlo rofo rm ex tract show ed low anticance r activities in
v itr o. [ Conclusion] The ethy lacetate ex tract is the principa l anticancer ext ract from roo t of Adina rubella Hance.
Key words:M TT;roo t of Adina rubella Hance;rectal cancer
　　中药水杨梅根为茜草科落叶灌木植物水杨梅
A dina rubella(Sieb. et Zucc.)Hance的根 ,分布于我
国江南及华南一带。临床表明它有抗消化道肿瘤的
作用[ 1] ,虽有报道自水杨梅根中分离出数种新化合
物[ 2] ,但有关其抗肿瘤活性报道甚少 。本文以水杨
梅根为实验材料 ,将其提取物对人直肠癌 LS174T 细
胞进行处理 ,观察水杨梅根提取物对直肠癌细胞增
殖的抑制作用 ,为水杨梅提取物抗肿瘤作用成分及
其机理的研究提供依据。
1　实验材料
1. 1　药材　水杨梅根购自浙江临安中药饮片厂 ,批
号:20040710
1. 2　细胞　人直肠癌 LS174T 细胞 ,广东中山大学
医学院提供。在 5%CO2 ,37℃条件下 ,用含 10%小
牛血清 、青霉素(100μg /ml), 链霉素(100μg /m l),
RMPI1640培养液传代培养 ,实验用细胞均处于对数
生长期 。
1. 3　药品与试剂 　RPMI 一 1640培养基为 Gibco
公司产品;小牛血清为四季青公司产品;MTT 和
DMSO均为 AM. RESCO 公司产品 ,其余试剂均为
分析纯。
2　方法
2. 1　水杨梅有效成分提取与配制　干燥水杨梅根
1kg ,加入 5000ml蒸馏水 , 90℃煎煮 2h ,过滤 ,滤渣再
加 3000m l蒸馏水继续 90℃煎煮 2h ,过滤 ,将两次滤
液合并后浓缩到 1500ml。依次用氯仿 、乙酸乙酯 、正
丁醇提取。每次加入溶剂1 /2体积萃取 2次 ,各部分
萃取液于旋转蒸发器上浓缩并回收溶剂 ,浓缩液挥
干溶剂后称重 ,计算得率 。所得的各提取物分别用
二华南理工大学自然科学基金资助项目(322 -
E5041170);学生研究计划 SRP 项目(B10 - Y13014)
甲基亚砜(DMSO)配成 lg /m l ,分装于 4℃保存 ,临用
时用培养液稀释成所需浓度 ,并使各组所含 DMSO
终浓度≤0. 1%。
2. 2　MT T 法　采用文献方法[ 3] 。直肠癌细胞以 8
×103 个 /孔的接种量接种于 96孔培养板 , 5%CO 2 、
37℃温箱中培养 24h 后 ,每孔加入不同浓度的药物
各 10μL 使初步筛选的药物终浓度分别为 103 、102 、
372
浙江中医药大学学报 2007年 5月第 31卷第 3期　
DOI牶牨牥牣牨牰牬牰牰牤j牣issn牨牥牥牭牠牭牭牥牴牣牪牥牥牱牣牥牫牣牥牰牪
　叶　勇,等:　水杨梅根提取物的体外抗肿瘤活性
10μg /ml ,继续培养 24h;而最终筛选的药物浓度分
别为 200 、400 、600 、800μg /ml ,继续培养 48h后 ,分别
加入 50μL MT T 温育 4h ,弃去培养基 ,加入 150μL
DMSO ,在平板摇床上摇匀 ,在酶标仪 495nm 读板 ,
根据测得的吸光度值按下式计算抑制率。按改良的
Karber公式计算 48h各提取部位的 IC50值 。抑制率
=(1一实验组吸光度值 /对照组吸光度值)×100%
2. 3　统计学方法 　组问比较和不同浓度条件下比
较均采用齐性方差 t检验 。
3　结果
3. 1　不同溶剂提取率　系统溶剂法分离提取部位
各提取部位称重 ,计算得率(相对于总提物),结果氯
仿 、乙酸乙酯 、正丁醇部位的得率分别为 0. 096%,
0. 26%和 1. 29%。
3. 2　　各提取部位对人直肠癌 LS174T 细胞的增殖
抑制作用
24h水杨梅根对直肠癌细胞作用效果表明 ,在
10 ～ 1000μg /ml浓度范围内 ,乙酸乙酯提取部位对
人直肠癌 LS174T 细胞的增殖具有抑制作用;而氯仿
和正丁醇提取部位的抑癌作用活性很低 。通过延长
各提取部位对人直肠癌 LS174T 细胞的作用时问及
增加它们的实验浓度梯度 ,结果表明 ,不同浓度的各
提取部位处理 LS174T 细胞 ,随浓度增加其抑制率也
增加 ,在测定浓度范围内表现为剂量依赖性抑制。
其中乙酸乙酯提取部位对人直肠癌 LS174T 细胞的
增殖具有明显的抑制作用 ,而氯仿和正丁醇部位的
抑癌作用不明显。结果见表 1 、2。
表 1　水杨梅根提取物对 LS174T作用 24小时后各组OD值和抑制率(%)(x±s ,n=6)
浓度
(μg /ml)
石油醚 乙酸乙酯 正丁醇
OD 值 抑制率 OD值　　 抑制率　 OD值 抑制率　
0 0. 363±0.032 0. 376±0. 039 0. 373±0. 035
10 0. 357±0.035 　1. 65±2.23 0. 351±0. 034 6. 65±3. 16 0. 358±0. 037 　　4. 02±2. 43
100 0. 336±0.024 　7. 44±2.63 0. 268±0. 021 28.72±2. 73 0. 317±0. 028 　15. 01±2. 18
1000 0. 282±0.023 22. 31±2.15 0. 037±0. 006** 90.16±1. 25** 0. 286±0. 017 　23. 32±2. 65
　　与空白对照组相比 , **P<0. 01
表 2　水杨梅根提取物对 LS174T作用 48小时后各组OD值和抑制率(%)(x±s ,n=6)
浓度
(μg /ml)
石油醚 乙酸乙酯 正丁醇
OD 值 抑制率　 OD值　　 抑制率　 OD值 抑制率　
0 0. 334±0.027 0. 362±0. 032 0. 326±0. 029
200 0. 316±0.033 　5. 39±3.17 0. 311±0. 026 14.09±3. 28 0. 304±0. 032 　　6. 75±2. 68
400 0. 297±0.028 11. 08±2.23 0. 238±0. 022 34.25±2. 57 0. 287±0. 026 　11. 96±2. 39
600 0. 289±0.027 13. 47±2.36 0. 137±0. 014* 62.15±2. 55* 0. 256±0. 019 　21. 47±2. 16
800 0. 264±0.023 20. 96±2.53 0. 026±0. 005** 92.82±1. 76** 0. 238±0. 017 　26. 99±2. 13
　　与空白对照组相比 , *P<0. 05 , **P<0. 01
3. 3　各提取部位对人直肠癌 LS174T 细胞增殖抑制
作用的比较　通过改良的 Karber 公式计算 48h 各
提取部位的 IC50值 。乙酸乙酯提取部位的 IC50为
483. 57μg /ml ,而正丁醇 、石油醚提取部位的 IC50分
别是 890. 26μg /ml和 730. 33μg /ml。比较各提取部
位对人直肠癌 LS174T 细胞的 IC50值 ,发现乙酸乙酯
提取部位对人直肠癌 LS174T 细胞增殖抑制作用最
强 ,正丁醇提取部位次之 ,氯仿提取部位抑癌作用则
不明显 。由此提示水杨梅抗直肠癌 LS174T 细胞的
有效部位可能在乙酸乙酯及正丁醇部位 ,其中乙酸
乙酯提取物是最主要的活性部位。
4　讨论
目前 ,直肠癌的主要治疗手段是手术治疗和化
疗 。手术治疗对病人带来生活的不便和心理上的痛
苦 ,化疗又存在较强的毒副作用。因此寻找既有较
好疗效而又无明显毒副作用的中药 ,单独使用或联
合化疗以提高疗效和减少毒副作用 ,是直肠癌防治
的必然趋势。临床实验表明水杨梅根能抑制消化道
肿瘤 ,为其成分研究提供了前提 。本研究则揭示水
杨梅根主要活性成分存在于乙酸乙酯提取物中 ,表
明它可能是酚性化合物 。因此下一步的研究将针对
乙酸乙酯提取物作进一步分离 ,从而探明水杨梅根
的抗肿瘤成分 。
参考文献:
[ 1] 　李郁仁. 中医肿瘤学[ M] .北京:科学技术出版社 , 1997:
72-73.
[ 2] 　何直升 , 方世跃 ,胥传凤.水杨梅化学成分的研究[ J] . 中
草药 , 1995 , 26(6):285-287.
[ 3] 　司徒镇强 , 吴军正. 细胞培养[ M ] . 西安:世界图书出版
西安公司 , 2003:186-187.
(收稿日期　2006-12-17)
373
　浙江中医药大学学报 2007年 5月第 31卷第 3期