全 文 ：收稿日期:2014-01-15
基金项目:广西自然科学项目资助(2011GXNSFA018243);广西中医药管理局项目(gzzc1052)
作者简介:唐 琪(1985-)，女，广西桂林人，住院医师，硕士，从事白内障及眼肿瘤免疫研究．
* 通信作者 E-mail:13617712201@ 163． com
藤茶双氢杨梅树皮素对人视网膜母细胞瘤
HXO-ＲB44细胞凋亡的诱导作用
唐 琪1，郑作文2，蒋林志3，严宇清3，何剑峰3，梁 皓3*
(1．南宁市第一人民医院眼科，广西 南宁 530000;2．广西中医学院药学院，广西 南宁 530000;
3．广西医科大学第一附属医院眼科，广西 南宁 530021)
摘要:目的 观察中药单体成分双氢杨梅树皮素(ampelopsin，APS)对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，ＲB)
细胞株 HXO-ＲB44凋亡的影响，以探讨中药治疗 ＲB 的可能性。方法 取对数生长期的人视网膜母细胞瘤细胞株
HXO-ＲB44用于实验，不同浓度的 APS作用于 HXO-ＲB44细胞 24 小时后，以 MTT法、生长曲线法、软琼脂克隆形成法
观察 APS对 HXO-ＲB44的体外抑制作用;倒置显微镜观察其形态学变化;AO/EB染色观察细胞凋亡形态学变化;流
式细胞仪检测细胞凋亡。结果 MTT法检测证实，APS对 HXO-ＲB44的 IC50为 14． 71 mg /L;细胞生长曲线法提示其
对 HXO-ＲB44细胞生长有明显抑制作用;软琼脂克隆形成法观察 APS 浓度 ＞ 9． 90 mg /L 时抑制率为 100． 0%，药物
浓度为 4． 40 mg /L，抑制率为 52． 2%。APS作用后出现了明显的凋亡细胞，表现为细胞皱缩、核染色质浓缩、核碎裂
等凋亡特征性的形态学改变。流式细胞仪检测 50． 00 mg /L、14． 84 mg /L、4． 40 mg /L和 0． 00 mg /L APS作用 24 小
时后的细胞凋亡率分别为 88． 1%、58． 5%、14． 8%和 4． 8%，各浓度组凋亡率与空白对照组(4． 8%)比较，差异均有
统计学意义(P ＜ 0． 05)，各浓度组细胞凋亡率之间差异也均有统计学意义(P ＜ 0． 05)。结论 APS对 HXO-ＲB44细
胞的体外增殖活性有明显的抑制作用，并可诱导体外培养的 ＲB细胞凋亡，可作为中药治疗 ＲB的候选药物。
关键词:视网膜肿瘤 /病理学;杨梅素 /药理学;黄酮醇类 /药理学;茶 /化学;视网膜母细胞瘤 /药物疗法;视网
膜母细胞瘤 /病理学;细胞凋亡 /药物作用;细胞系，肿瘤
中图分类号:Ｒ739． 7;Ｒ730． 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1692(2014)03-0223-05
Ampelopsin induces apoptosis of human retinoblastoma HXO-ＲB44 cells
TANG Qi1，ZHENG Zuo-wen2，JIANG Lin-zhi3，et al
(1． Department of Ophthalmology，Nanning First Peoples Hospital，Nanning，530000，China;
2． Faculty of Pharmaceutical Science，Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning，530000，China;
3． Department of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，530021，China)
Abstract:Objective To investigate the effect of ampelopsin on the apoptosis of human retinoblastoma HXO-ＲB44
cells．Methods Human retinoblastoma HXO-ＲB44 cells were treated with different concentration of ampelopsin in vitro for
24 h． Cell proliferation was measured by MTT and cell colony formation test． Morphological changes were observed under
optical microscopy． Cell apoptosis was observed by AO /EB staining and flow cytometry． Ｒesults MTT assay showed that
ampelopsin significantly inhibited the growth of cultured HXO-ＲB44 cells with an IC50 of 14． 71 mg /L． Cell colony test revealed
that the repressive rate was 100． 0% and 52. 2% after treatment with 9． 90 mg /L and 4． 40 mg /L ampelopsin，respectively．
AO/EB fluorescent staining showed typical morphological changes of cell apoptosis after the drug treatment，including cell
shrinkage，chromatin condensation and nuclear fragmentation． The apoptosis rates were 88. 1%，58. 5%，14. 8% and 4. 8%
after 24 h treatment with 50. 00 mg /L，14. 84 mg /L，4. 40 mg /L and 0． 00 mg /L of ampelopsin(P ＜ 0. 05)． Conclusion
Ampelopsin can inhibit the growth and induce the apoptosis of human retinoblastoma HXO-ＲB44 cells in vitro．
·322·实用肿瘤杂志 2014 年 第 29 卷 第 3 期
DOI:10.13267/j.cnki.syzlzz.2014.03.007
Key words:retinal neoplasms /pathology;MYＲICETIN /pharmacology;flavonols /pharmacology;tea /chemistry;
retinoblastoma /drug therapy;retinoblastoma /pathology;apoptosis /drug effects;cell line，tumor
藤茶双氢杨梅树皮素(ampelopsin，APS)是从藤
茶中提取的白色细针状结晶，是藤茶黄酮中含量较
多的单体成分之一［1］。其作用主要有抗高血压、祛
痰止咳、保肝、降血脂、增强免疫、抗氧化等［2］。最
近几年研究证实 APS对体外培养的人肺癌细胞、肝
癌细胞均有显著的抑制增殖及促凋亡作用［3-4］。但
是对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，ＲB)的作用尚
未见相关报道。本研究通过体外培养的人 ＲB 细胞
株进行实验，探讨 APS 对人 ＲB 细胞增殖和凋亡的
干预作用，为临床上探索新的眼内肿瘤的药物(特
别是中药单体成分)治疗提供参考依据。
1 材料及方法
1． 1 材料
1． 1． 1 细胞 人 ＲB 细胞株系 HXO-ＲB44，购自中
南大学湘雅医学院肿瘤研究所。
1． 1． 2 试剂 ＲPMI-1640(Hyclone 公司);新生牛
血清(杭州四季青公司);四甲基二氮唑蓝(北京拜
尔迪生物公司分装);二甲基亚砜(DMSO，博大泰
克公司);顺铂(齐鲁制药有限公司);四唑蓝
(MTT，Sigma 公司);AnnexinV-FITC 凋亡检测试剂
盒(南京凯基生物科技发展有限公司);吖啶橙染料
(AO，上海博蕴生物科技有限公司);溴化乙啶
(EB，AMＲESCO公司)。
1． 1． 3 仪器 SUNＲISE 自动酶标仪(Bio-Ｒad，
Modle-450);二氧化碳培养箱(Thermo，Model-3111);
DLF560 型超净工作台(荷兰 Clear Air Techniek bv
公司);倒置显微镜(Olympus);电子天平(德国 Sar-
torius AG);EpicsXL 型流式细胞仪(美国 Beckman
Coulter公司)。
1． 1． 4 药物的制备 APS 购自广西中医学院药理
学研究室，纯度 98． 5%。将 APS 溶解于 DMSO 中，
然后加入不含血清的 ＲPMI-1640 培养液(DMSO 浓
度 ＜0． 3%)，按浓度梯度稀释成 50. 00、33. 33、22. 22、
14. 84、9. 90、6. 60、4. 40 mg /L，待用，并设不含药物
的空白对照组、加入顺铂的阳性对照组以及加入
DMSO的溶剂对照组。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养 HXO-ＲB44细胞培养于含 10%小
牛血清的 ＲPMI-1640 培养液内，垂直放于含 5%
CO2，37℃ 细胞培养箱内。ＲB 细胞体外呈悬浮生
长，采用半量换液法，每周 1∶ 2传代 2 次。
1. 2. 2 MTT快速比色法测定药物对细胞的抑制作
用 取培养好的对数生长期的 HXO-Ｒb44细胞，离心
收集细胞。将收集的细胞悬浮于含 10% 血清的
ＲPMI-1640 培养液中，制成单细胞悬液，0. 4%锥虫
蓝染色，活细胞显蓝色，死细胞拒染，显微镜下计数，
活细胞数应 ＞ 90%。调节细胞浓度为 1 × 106个 /
mL。将细胞悬液接种于 96 孔板中，180 μL /孔。药
物组加不同浓度药物 20 μL，空白对照组加不含血
清 ＲPMI-1640 培养液 20 μL，阳性对照组加入 2. 00
mg /L的顺铂 20 μL，溶剂对照组加入 0. 3% DMSO，
加药后各组细胞在同等条件的培养箱中继续培养
24 小时。然后加入 10 μL /孔的 MTT溶液(5 g /L)，
继续培养 4 小时，离心吸去上清液。加入 DMSO 150
μL /孔，轻轻振荡 10 分钟。用酶标仪于 550 nm 波
长处测光密度(OD)值，通过对数回归方程计算，求
出半数抑制浓度(IC50)值。计算 APS 对 ＲB 细胞生
长抑制率。按下述公式求出细胞抑制率:
细胞生长抑制率 =［(对照组平均值 －实验组
平均值)/对照组 OD 值］× 100%。
1. 2. 3 倒置显微镜观察 在倒置显微镜下观察空
白对照组和不同浓度的 APS作用 HXO-ＲB44细胞 24
小时后的细胞形态学及细胞数目的改变。
1. 2. 4 APS 对 HXO-ＲB44细胞生长曲线的影响
取对数生长期的细胞，离心收集，制成单细胞悬液，
调节细胞浓度为 2 × 105个 /mL，接种于培养瓶。设 7
个药物浓度组和空白对照组，每组 3 瓶。分别于用
药后 0、24、48、72 小时用进行活细胞计数(锥虫蓝染
色法)。以活细胞数为纵坐标，时间为横坐标绘制
细胞生长曲线图。
1. 2. 5 软琼脂克隆形成试验 制备双层琼脂，上层
为浓度为 0. 3%，下层为 0. 5%，取对数生长期的细
胞，离心收集，然后制备单细胞悬液，设 7 个药物浓
度组和空白对照组，每组 3 个复孔。把不同药物浓
度的单细胞悬液加入到上层琼脂。继续培养 2 周。
每个细胞集落含≥50 个细胞为 1 个克隆，计数并计
算抑制率。抑制率(%)= 1 －实验组克隆数 /对照
组克隆数。
1. 2. 6 AO /EB法观察细胞凋亡形态学变化 取培
养好的对数生长期的 HXO-ＲB44细胞，调节细胞浓度
为 1 × 106个 /mL，将细胞种至 6 孔板，每孔 2 mL 细
·422· Journal of Practical Oncology Vol． 29 No． 3 2014
胞，根据 MTT 结果，选取高、中、低 3 个药物浓度
(4. 40、14. 84、50. 00 mg /L)，向每孔加入相应浓度
药物，培养 24 小时，离心收集细胞，PBS 洗涤后重悬
细胞，使悬浮细胞浓度达 1 × 106 /mL 左右，取 100
μL受检细胞悬液，各加 5 μL AO和 EB，加盖玻片后
立即置荧光显微镜下观察。
1. 2. 7 流式细胞仪检测细胞凋亡 按 1. 2. 6 法培
养细胞，加入 500 μL的 Binding Buffer 悬浮细胞，加
入 5 μL的 Annexin V-FITC 混匀后，避光，室温孵育
30 分钟，上机前 5 分钟再加入 5 μL 的 PI 染色。用
流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1. 3 统计学分析
采用 SPSS 13. 0 统计软件进行数据处理，实验
数据以 珋x ± s 表示，采用单因素方差分析，以 P ＜
0. 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 APS对 HXO-ＲB44细胞增殖的抑制作用
2. 1. 1 倒置相差显微镜观察结果(图 1) 空白对
照组细胞轮廓清晰、胞体折光性强、细胞核呈圆形、
核仁明显、细胞膜完整，且随着时间的延长，细胞密
度显著增高;细胞培养 24 小时后，低浓度药物组
(4. 40 mg /L)聚集成团的细胞减少，分裂相细胞减
少;中浓度药物组(14. 84 mg /L)细胞散在分布，轮
廓不清晰，胞体折光性减弱，细胞数量较对照组减
少;APS 浓度达到 50. 00 mg /L 时，细胞数明显减
少，成形的细胞非常少，细胞体积缩小，细胞质固化，
可见部分细胞细胞膜破裂，培养液中可见较多碎片
及颗粒样物质。
A．空白对照组;B． 4． 40 mg /L;C． 14． 84 mg /L;D． 50． 00 mg /L
图 1 APS作用 24 小时 HXO-ＲB44细胞形态变化
2. 1. 2 MTT 法 结果如表 1 所示，不同浓度 APS
药物组与空白对照组细胞 OD 值比较，差异均有统
计学意义(P ＜ 0. 05)。应用重复测量的方差分析，
各药物组间比较差异有统计学意义(F = 22. 960，P
＜ 0. 05)。而且 APS 对 HXO-ＲB44细胞生长的抑制
率随着药物作用浓度的升高而增大，即 APS 以剂量
依赖性方式抑制 HXO-ＲB44细胞的生长。细胞的
IC50为 14. 71 mg /L，提示 APS对 HXO-ＲB44细胞的增
殖活性有明显的抑制作用。
表 1 APS对 HXO-ＲB44细胞增殖的抑制作用(珔x ± s)
组别
药物浓度
(mg /L)
OD值
抑制率
(%)
t值 P值
空白对照组 － 1． 392 ± 0． 059 － － －
溶剂对照组 － 1． 185 ± 0． 125 14． 9 2． 223 0． 093
阳性对照组 2． 00 0． 613 ± 0． 147 55． 9 7． 462 0． 002
APS药物组 50． 00 0． 406 ± 0． 014* 71． 2 15． 937 0． 000
33． 33 0． 429 ± 0． 020* 68． 5 16． 315 0． 000
22． 22 0． 499 ± 0． 082* 64． 2 8． 788 0． 001
14． 84 0． 661 ± 0． 073* 52． 5 7． 819 0． 002
9． 90 0． 797 ± 0． 124* 42． 7 4． 331 0． 012
6． 60 1． 002 ± 0． 093* 28． 0 3． 529 0． 024
4． 40 1． 162 ± 0． 073* 16． 5 3． 513 0． 025
注 与空白对照组比较，P ＜ 0． 05
2． 1． 3 生长曲线法 采用生长曲线法观察不同浓
度 APS作用不同时间后，HXO-ＲB44细胞生长情况。
结果如图 2 所示，APS 干预 1 天对 HXO-ＲB44细胞
的生长抑制最明显。
图 2 APS对 HXO-ＲB44细胞的抑制作用
2． 1． 4 软琼脂克隆形成法 当 APS 浓度≥9． 90
mg /L时，抑制率为 100． 0%;当 APS浓度为 6． 60 mg /L
时，抑制率为 69． 2%;当 APS 浓度为 4． 40 mg /L，抑
制率为 52． 2%，与空白对照组比较差异均有统计学
意义(P ＜ 0． 05)。空白对照组细胞集落数及每个集
落中细胞数目均多于药物组(P ＜0． 05)(表 2)。
·522·实用肿瘤杂志 2014 年 第 29 卷 第 3 期
表 2 APS干预 HXO-ＲB44细胞后软琼脂克隆
形成实验(珔x ± s)
组别
药物浓度
(mg /L)
集落数 t值 P值
抑制率
(%)
空白对照组 0 25． 6 ± 3． 04 －
APS药物组 14． 84 0 18． 771 0． 000 100． 0
9． 90 0 18． 771 0． 000 100． 0
6． 60 7． 8 ± 0． 83 12． 587 0． 000 69． 2
4． 40 12． 4 ± 1． 34 8． 666 0． 000 52． 2
2． 2 APS对 HXO-ＲB44细胞的诱导凋亡作用
2． 2． 1 AO /EB 染色观察 APS 对 HXO-ＲB44细胞
株形态学改变 根据 MTT结果，选取 3 个不同浓度
的 APS (4． 40、14． 84、50． 00 mg /L)作用于 ＲB细胞，
24 小时后染色观察细胞形态学改变。空白对照组
的细胞呈黄绿色荧光，染色均匀一致，细胞核大，椭
圆型，大小不一。低浓度组(4． 40 mg /L)细胞未出
现明显的凋亡形态学改变，随着药物浓度的增加，高
浓度组(50． 00 mg /L)细胞染色由黄绿色向黄色、橘
红色转变，出现明显的核染色质固缩、染色不均匀，
细胞内可见核小体出现。由图 3 可以看出，随着药
物浓度的增加，细胞呈橘红色的凋亡细胞和坏死细
胞增多，细胞核固缩不均一。
A．空白对照组;B． 4． 40 mg /L;C． 14． 84 mg /L;D． 50． 00 mg /L
图 3 APS作用 HXO-ＲB44细胞后凋亡形态学变化
2． 2． 2 流式细胞仪测定 APS 对 HXO-ＲB44细胞株
凋亡的影响 3 个不同浓度的 APS(4. 40、14. 84、
50. 00 mg /L)干预 ＲB细胞 24 小时后流式细胞仪进
行检测。结果表明，HXO-ＲB44细胞凋亡率与药物
剂量呈正相关，分别为(14. 83 ± 4. 25)%、(58. 46 ±
6. 21)%、(88. 13 ± 3. 08)%(表 3)。APS 作用后的
各浓度组细胞凋亡率与空白对照组的凋亡率比较，
差异均有统计学意义(P = 0. 000)。
表 3 APS干预 HXO-ＲB44细胞 24小时后细胞凋亡率(珔x ± s)
组别 药物浓度(mg /L) 抑制率(%)
空白对照组 0 4． 82 ± 0． 33
APS药物组 50． 00 88． 13 ± 3． 08*
14． 84 58． 46 ± 6． 21*
4． 40 14． 83 ± 4． 25*
* 与空白对照组比较，P = 0． 000
3 讨 论
广西是藤茶的主要产地，周天达等［5］于 1996 年
首次从藤茶的茎叶中分离得到 APS，其含量约为
38． 17% ～38． 54%。APS是藤茶总黄酮中主要的单
体化合物，具有增强免疫、诱导分化和抗氧化作用。
前期研究显示，中药单体成分 APS 还具有抑制肿瘤
细胞侵袭和转移、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。同时，
研究证实，APS对多种肿瘤细胞及细胞株增殖均有
明显抑制作用［6-7］。APS 能与多柔比星、卡铂等联
用，对小鼠 S180 肉瘤产生协同抑制作用。然而，这
一天然中药有效成分 APS 对眼内肿瘤的作用如何
至今未见报道。
ＲB是小儿最常见的眼内恶性肿瘤，具有家族性
和遗传倾向。多发生在 3 岁以前，其病因复杂，可能
造成患儿视力丧失，严重地影响患儿的视力和生命。
目前国内仍以眼球摘除术为主，放疗、化疗及细胞靶
向治疗为辅，但效果不佳。在肿瘤的综合治疗中，抑
制肿瘤细胞增生、诱导其凋亡及向高分化转变是肿
瘤治疗的主要策略，成为各种保守治疗的主要方式
之一。寻找有效的抗肿瘤药物，尤其是中药单体成
分药物，对综合治疗 ＲB具有重要意义。
本实验研究发现，在药物浓度为 4. 40 ～ 50. 00
mg /L之间时，APS对 ＲB细胞活性的抑制作用随着
药物浓度的增加而增大，其半数抑制浓度(IC50)值
为 14. 71 mg /L。郑作文等［4］研究的对人肝癌 BEL-
7404 的 IC50为 22. 99 mg /L 和张玉萌等
［8］研究的对
Hela细胞的 IC50为 24. 6 mg /L，与之相比，ＲB 细胞
对 APS更为敏感;本研究用临床上常用的治疗 ＲB
的化疗药物顺铂作阳性对照，APS 作用浓度为
14. 84 mg /L时的抑制率与之相当。本实验中顺铂
对 ＲB细胞的抑制率低于徐和平等［9］的研究，可能
与顺铂的剂型有关。
此外，根据本实验结果显示，APS 对 ＲB 细胞活
性的抑制作用呈浓度依赖性。APS 浓度为 4. 40
mg /L时，抑制率为 16. 5%，APS 浓度增加到 50. 00
mg /L时，抑制率提高到 71. 2%。在 APS 的作用下，
·622· Journal of Practical Oncology Vol． 29 No． 3 2014
ＲB细胞的数量明显减少，形态发生明显的改变，尤
其是对单个细胞的作用更为明显，APS 浓度仅为
4. 40 mg /L时，其对单个 ＲB细胞活性的抑制率即可
达到 52. 2%，当 APS 浓度≥9. 90 mg /L 时，抑制率
可达到 100. 0%，说明 APS 对 ＲB 细胞的活性有明
显的抑制作用。
研究显示，未经治疗的 ＲB 可出现肿瘤的自发
退变，是所有肿瘤中自发退变率最高的一种，其退变
机制尚不明确，但自动图像分析技术(automatic
image analysis technology，AIAT)分析显示退化区内
凋亡指数明显高于其他肿瘤区域，ＲB细胞凋亡可导
致其自发退化［10］。如果通过某种手段使得肿瘤细
胞重新获得凋亡能力，恢复细胞凋亡与增殖的平衡，
即可达到治疗肿瘤的目的。本实验用 AO /EB 染色
观察药物干预下 ＲB 细胞凋亡的情况。结果显示，
空白对照组的细胞未出现明显的细胞凋亡形态学改
变，药物组随着药物浓度的增加，凋亡细胞也随之明
显增多。此外，用流式细胞仪检测 ＲB 细胞凋亡率，
结果显示随着药物浓度的增大，细胞的凋亡率明显
增加。本实验从细胞膜的形态学改变和生化性质改
变这两个方面证实了 APS 可以诱导体外培养的 ＲB
细胞凋亡，凋亡率随 APS 的浓度的增加而增高，与
张玉盟等［3］的研究结果一致，其作用机制可能与增
强 p53 的表达有关［11］。
综上所述，APS 对 ＲB 细胞有明显的抑制作用
及诱导凋亡作用，是一种较有效的低毒抗瘤植物药，
具有一定的开发前景，但对眼内其他正常组织是否
有不良反应，其具体的作用机制如何还有待于进一
步研究。
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187 － 210．
关于确定文稿作者的说明
科技文稿的作者应是:(1)参与选题和设计，或参与资料的分析和解释者;(2)起草或修改论文中关键性
理论或其他主要内容者;(3)能对编辑部的修改意见进行核对修改，在学术界进行答辩，并最终同意该文发
表者。以上 3 条均需具备。仅参与获得资金或收集资料者，仅对科研设计进行一般管理者，不能列为作者。
集体署名的文稿必须明确能对该文负责的作者。其他对该研究有贡献者，可在文后注明志谢。作者中如有
外籍作者，应征得本人同意，并附该作者证明信。作者应在投稿时确定，在编排过程中不应再作顺序更动或
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本刊编辑部
·722·实用肿瘤杂志 2014 年 第 29 卷 第 3 期