全 文 ：陈　红 ,张绿萍. 刺梨花药愈伤组织起源与倍性检测 [ J ] . 江苏农业科学 ,2011 , 39(5 ):49 - 51.
刺梨花药愈伤组织起源与倍性检测
陈　红1 , 张绿萍2
(1.贵州省果树工程技术研究中心 /贵州大学喀斯特山地果树资源研究所 ,贵州贵阳 550025;
2.贵州省果树科学研究所 ,贵州贵阳 550100 )
　　摘要:以刺梨花药为材料 , 采用组织学方法对花药愈伤组织起源进行了研究 , 并对花药不同部位产生的愈伤组织
以及培养在不同糖源及不同生长调节剂组合培养基中形成的愈伤组织进行了细胞学观察 , 研究不同处理对花药愈伤
组织倍性的影响。结果表明 ,刺梨小孢子脱分化的启动时间比药壁组织晚 1 周左右;贴近药壁组织的小孢子较易形成
愈伤组织;花药壁四周或腹缝线处形成的淡黄色疏松颗粒状愈伤组织大多为小孢子愈伤组织 , 单倍体愈伤组织率高达
80%;培养基中添加 7%的蔗糖或 0. 5 mg /L NAA +2. 0 mg / L 6 -BA最有利于小孢子愈伤组织的形成。
　　关键词:刺梨;花药培养;愈伤组织起源;倍性检测
　　中图分类号:S665. 903　　文献标志码:A　　文章编号:1002 -1302(2011)05 -0049 - 03
收稿日期:2010 -11 - 08
基金项目:贵州省省长基金(编号:黔省专合字 2007 - 18 );贵州省科
学技术基金(编号:黔科 J字 [ 2007 ]2054);贵州大学引进人才科研
项目(编号:X060039);贵州省果树学科科技创新人才团队建设项
目(编号:黔科合人才团队[ 2008 ]88007);贵州省特色农业产业人
才培养基地建设项目;贵州省果树工程技术研究中心建设项目 (编
号:黔科合农 G字 [2007 ] 4001 )。
作者简介:陈　红(1975— ),男 ,重庆潼南人 ,博士 ,副教授 ,主要从事
生物技术与园艺植物遗传育种方面的研究。 E - mai l:chenh96@
yahoo. com. cn。
　　通过花药培养获得单倍体 ,可缩短育种年限和提高育种
效率 ,并为基因高度杂合的果树遗传特性研究提供纯系材料 ,
从而促进果树遗传理论的研究 [1 ] 。花药培养能克服远缘杂
种的不育性 ,获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种 ,并可利
用在远缘杂交 F1 代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染
色体变异材料 ,有利于新种源的不断发现 。利用花药离体培
养对开展刺梨新品种育种 、遗传学和细胞学研究均具有重要
意义 。在花药离体培养过程中 ,花药愈伤组织倍性复杂 ,除了
由小孢子形成的愈伤组织外 ,还有由花药壁等体细胞形成的
愈伤组织 ,给后期再生植株的倍性鉴定增加了工作量 ,大大降
低了单倍体育种效率 。目前 ,对刺梨花药愈伤组织倍性鉴定
及促使小孢子愈伤组织发生的相关研究还未见报道 。本研究
对刺梨花药培养过程中花药的组织学变化 、愈伤组织发生特
点及规律开展研究 ,以确定花药愈伤组织的起源;并针对促使
小孢子愈伤组织形成的相关技术措施开展研究 ,为提高刺梨
单倍体诱导率提供依据 。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料品种为贵农 5号刺梨 ,采自贵州大学教学实习
农场 。
1. 2　方法
1. 2. 1 　刺梨花药愈伤组织起源研究 　分别将在 MS +
1. 0 mg/L 6 -BA +2. 0 mg/ L NAA +3%蔗糖 +0. 6%琼脂培
养基中培养不同时间 (2 、7 、14 、21 、28 、35 d)的花药 ,用卡诺氏
固定液 (乙醇 ∶乙酸 =3 ∶1 )固定 12 h后 ,转入 70%乙醇保
存 ,然后采用铁矾苏木精整染石蜡切片法制片观察 。
1. 2. 2　愈伤组织的染色体数观察　分别从花药不同部位 、不
同糖源以及不同生长调节剂组合的处理中 ,取适量未经继代
的花药愈伤组织 ,用饱和对 N -二氯苯溶液预处理 2 ～4 h ,卡
诺氏固定液固定12 ～24 h ,转入 70%乙醇中 ,置于 4 ℃保存 。
参照文晓鹏等的方法 [2 ] ,5 mol/ L HCl酸解 10 ～13 min ,4. 0%
铁钒媒染 1 h , 0. 5%苏木精染色 2 h , 45%醋酸分色压片 ,
Olympus BH -2显微镜下进行染色体数目观察 ,并照相记录 。
1. 3　结果观察与统计
观察染色体数后统计含单倍体细胞的愈伤组织数 。
单倍体愈伤组织诱导率 =含单倍体细胞愈伤组织数 /观
察愈伤组织数 ×100%。
2　结果与分析
2. 1　花药愈伤组织起源的组织解剖学观察
刚接种时 ,花药呈淡黄色 ,显微观察显示多数花粉处于单
核靠边期 。培养2 d时 ,花药呈深黄色 ,花药壁最外部由 1 层
扁平状的细胞组成表皮 ,其内为 1 ～2层细胞排列紧密的纤维
层 (其组成细胞呈规则四边形 );此时 ,可观察到大多数花粉仍
处于单核或二核花粉阶段 ,花粉在形态上没有明显变化 ,活力
大的花粉体积增大 ,花药壁变薄 ,原生质分布均匀 。培养7 d ,
药隔组织开始解体 (图 1 -a ),仅少数花粉细胞无明显变化 ,部
分为具有 1个生殖核和 1个营养核的二核花粉 (图 1 - b ),也
有部分花粉细胞进行均等分裂形成 2 个等核花粉 (图 1 - c ),
同时观察到部分二核花粉中的营养核进行再一次分裂 ,形成三
核花粉(图1 -d )。培养 14 d ,大部分花药转为褐色 ,切片观察
显示 ,未见到单核或二核花粉;观察到2个均等核继续分裂 ,形
成 4个等核的花粉 ,未见新细胞壁随之产生 ,游离核被包在花
粉壁内(图1 -e );脱分化的多核花粉有些中途停止发育而解
体 (图 1 -f );花丝断裂处 (外壁细胞或残存的花丝细胞 )细胞
启动分裂 ,表面形成一层薄壁细胞 (图 1 - g )。培养21 d ,部分
花药变成黑褐色并且干瘪 ,切片观察显示 ,贴近细胞内壁的小
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DOI 牶牨牥牣牨牭牳牳牴牤j 牣i ssn牣牨牥牥牪牠牨牫牥牪牣牪牥牨牨牣牥牭牣牨牭牨
孢子形成大量的薄壁细胞 ,并向细胞腔内延伸 (图 1 - h);花
丝断裂处形成大量愈伤组织 (图1 - i )。培养 28 d ,切片观察
显示 ,愈伤组织充满花药腔 ,细胞壁开始破裂 (图 1 - j )。培
养35 d ,切片观察显示 ,愈伤组织突破花药壁 ,形成大量肉眼
可看见的愈伤组织团 (图 1 -k )。
　　通过花药愈伤组织起源的细胞学和愈伤组织形成过程观
察 ,初步判断花药接种培养大约 20 d后 ,花丝断裂处出现的
半透明白色致密的愈伤组织为花药壁及花丝组织诱导而来的
体细胞愈伤组织 (图 2 - a )。30 d左右 ,花药的原竖状顶部 、
四周或腹缝线出现的淡黄色疏松颗粒状愈伤组织多数为小孢
子诱导产生的愈伤组织 (图 2 -b )。
2. 2　花药愈伤组织染色体数鉴定及不同处理对愈伤组织倍
性的影响
在花药培养中 ,花粉愈伤组织和体细胞愈伤组织同时存
在 ,导致愈伤组织染色体倍性复杂 ,为了提高花粉愈伤组织分
化培养的针对性 ,本研究对不同形态的愈伤组织进行染色体
数目鉴定 。根据前人研究报道 ,刺梨体细胞正常染色体数为
14条 [3 ] 。通过对刺梨花药愈伤组织染色体进行观察 ,发现花
药愈伤组织中存在二倍体细胞 (图3 - a )和单倍体 (图 3 - b )
细胞 。
2. 2. 1　花药愈伤组织形成部位对单倍体愈伤组织诱导率的
影响　在同一培养基中 ,从花药不同部位诱导形成的愈伤组
织的倍性明显不同 ,花丝断裂处形成的白色致密愈伤组织 ,未
观察到单倍体细胞;而花药壁四周形成的疏松愈伤组织 ,单倍
体愈伤组织诱导率高达83.3%(表1 )。
表 1　花药愈伤组织形成部位对单倍体愈伤组织诱导率的影响
愈伤组织
形成部位
愈伤组
织形态
愈伤
组织数
含单倍体细胞
愈伤组织数
诱导率
(%)
花丝断裂处 白色致密 15 0 0
花药壁四周 淡黄色疏松 12 10 83 . 3
2. 2. 2　糖源种类及浓度对花药愈伤组织倍性的影响　糖源
的种类和浓度对刺梨小孢子愈伤组织诱导率有明显的影响
(表2 )。在分别以蔗糖 、葡萄糖及可溶性淀粉为糖源的培养
—50— 江苏农业科学　2011 年第 39 卷第 5 期
表 2　糖源种类及浓度对花药愈伤组织倍性的影响
糖源 浓度(%)
愈伤组
织数(块)
含单倍体细胞
愈伤组织数(块)
诱导率
(%)
蔗糖 1 72 3 4 . 2
3 87 5 5 . 7
5 33 10 30 . 3
7 28 17 60 . 7
葡萄糖 1 45 0 0
3 58 2 3 . 4
5 61 8 13 . 1
7 17 6 35 . 3
可溶性淀粉 1 12 1 8 . 3
3 15 2 13 . 3
5 18 4 22 . 2
7 7 3 42 . 9
基中 ,小孢子愈伤组织诱导率均呈现出随糖源浓度的升高而
增加的趋势 ,试验的 3 种糖源中 ,以蔗糖为糖源的培养基 ,小
孢子愈伤组织诱导率最高 ,其中以添加 7%蔗糖浓度的培养
基最有利于小孢子愈伤组织的诱导 ,诱导率为 60. 7%。
2. 2. 3 　不同浓度的 NAA 和 6 - BA 组合对花药愈伤组织倍
性的影响　不同浓度的 NAA和 6 -BA组合对小孢子愈伤组
织的诱导率有明显的影响 。其中以组合 0. 5 mg/L NAA +
2. 0 mg/L 6 -BA最有利于小孢子愈伤组织的诱导 ,其单倍体
愈伤组织的诱导率为 45. 9%;以 3. 0 mg/ L NAA +1. 0 mg/L
6 - BA生长调节剂组合单倍体愈伤组织诱导率最低 ,诱导率
为 2. 7%。从各组合的试验结果总趋势来看 ,较低浓度的生
长素和较高浓度的细胞分裂素组合较有利于刺梨小孢子愈伤
组织的诱导 (表 3 )。
表 3　NAA和 6 - BA组合对花药单倍体愈伤组织诱导率的影响
处理 NAA(mg /L)
6 - BA
(mg /L)
愈伤组
织块数
含单倍体
细胞愈伤
组织数
诱导率
(%)
1 0 . 5 0. 5 54 14 25 . 9
2 0 . 5 1. 0 69 6 8 . 7
3 0 . 5 2. 0 37 17 45 . 9
4 1 . 0 0. 5 48 9 18 . 8
5 1 . 0 1. 0 40 12 30 . 0
6 1 . 0 2. 0 47 13 27 . 7
7 2 . 0 0. 5 71 7 9 . 9
8 2 . 0 1. 0 58 6 10 . 3
9 2 . 0 2. 0 63 15 23 . 8
10 3 . 0 0. 5 78 5 6 . 4
11 3 . 0 1. 0 75 2 2 . 7
12 3 . 0 2. 0 67 6 9 . 0
3　讨论
花药培养得到的愈伤组织起源不同 ,因而倍性不相同 ,其
中由花药壁 、花丝等体细胞发育形成的愈伤组织为二倍体 ,而
由小孢子发育形成的愈伤组织为单倍体 。虽然花药单倍体育
种在育种研究领域取得了重大进展 ,但花粉愈伤组织诱导率
低 ,是亟待解决的问题 。花药培养过程中的花药组织学和细
胞学研究大多是观察小孢子发育途径 [4 -5 ] ,而对小孢子及体
细胞愈伤组织发生部位 、形态特征及规律则鲜有报道 [6 ] 。本
试验组织学切片观察发现体细胞愈伤组织与小孢子愈伤组织
发生的时间 、部位明显不同 ,结合愈伤组织形态特征及其染色
体检测可以准确地分辨出小孢子愈伤组织与体细胞愈伤组
织 ,从而减少花粉愈伤组织分化的盲目性 , 提高单倍体诱
导率 。
在花药培养中 ,蔗糖的浓度对花粉细胞和体细胞的分裂
起着重要的调节作用 。研究结果显示 ,提高蔗糖浓度 ,可以抑
制体细胞增殖 ,增加花粉愈伤组织形成率 [7 -8 ] ,周毓君等 [9 ] 、
徐振南等 [10 ]在草莓花药研究中也得到相似的结果 。本试验
中以 3%蔗糖为糖源处理花药的愈伤组织诱导率较高 ,但小
孢子愈伤组织诱导率很低 ,而使用 7%蔗糖浓度处理 ,花药愈
伤组织诱导率虽不高 ,但其小孢子愈伤组织诱导率最高 ,这可
能是由于低浓度蔗糖适宜花药壁细胞脱分化 ,而高浓度蔗糖
使花药壁 、绒毡层等体细胞因渗透压增大而失去分裂增生的
能力 ,但花药内部的花粉细胞的细胞质较浓 ,耐受较高的渗透
压 ,仍可以分裂生长 ,形成愈伤组织 。
本研究结果表明 ,在培养基内添加一定浓度内的 NAA ,
花药愈伤组织的诱导率随其浓度的升高而增加 ,而小孢子愈
伤组织的诱导率却相反;在培养基中添加一定浓度的 6 - BA ,
花药愈伤组织和小孢子愈伤组织均随其浓度的升高而增加 。
Margaret等 [11 ]的研究也证实 ,较高的细胞分裂素可在一定程
度上抑制花丝产生愈伤组织 ,而有利于花粉愈伤组织的产生 。
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