全 文 ：不同蛇含委陵菜居群遗传多样性的 ISSR分析
牛友芽1 , 　　欧资东2 , 　　赵溶娟1 , 　　吴　弼1 , 　　喻　娟1 , 　　佘朝文1
(怀化学院 1.生命科学系 民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室
湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室 , 湖南 怀化　418008;
2.浙江中南建设集团有限公司 , 浙江 杭州　310052)
摘　要:以 8个蛇含委陵菜居群为材料进行 ISSR分析.从 20条 ISSR引物中筛选出4 条稳定性强 、 条带清晰及多
态性丰富的引物;筛选出的 ISSR引物共扩增出 41 条带 , 其中 39 条多态性带 , 多态性比率为 95.21%.用 Ntsys2.10e
软件进行 UPGMA 聚类分析.结果表明:蛇含委陵菜种质资源具有较高的遗传多样性 , 且其遗传多样性差异与生态分
布和地理来源密切相关.
关键词:蛇含委陵菜;　ISSR;　遗传多样性
中图分类号:R282　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-9743 (2012)11-0041-04
收稿日期:2012-10-17
基金项目:湖南省教育厅一般项目 (09C754);湖南省教育厅科技创新平台项目 (09K105);湖南省科技计划重点项目
(2009FJ2008;2012FJ4064).
作者简介:牛友芽 (1976-), 男 , 湖南新宁人 , 怀化学院讲师 , 硕士 , 主要研究生物化学 、 植物分子生物学.
　　委陵菜 (Potentilla chinensis Ser)又名白草 、 生血
丹 、扑地虎 、 五虎噙血 、 天青地白 , 其性寒 、 味苦 ,
具有清热解毒 、 凉血止痢等功效 , 可用于治疗痢疾 、
肠炎 、 疟疾 、 百日咳 、 衄血 、 痔疮下血 、 功能性子宫
出血 、白带 、 疥疮等疾病[ 1-2].全球委陵菜属植物约有
500种 , 多原产于北温带和北极 , 多数为多年生.国内
学者主要在药理作用 、 化学成分 、 环境适应性等方面
对委陵菜开展了部分基础研究.药理研究表明 , 委陵
菜具有显著的降血糖 、 抗菌 、 保肝及镇痛等作用 , 其
化学成分类型涉及黄酮 、 三萜和鞣质等[ 2] .另外 , 由
于委陵菜的适应性强 , 根系发达 , 能牢固地贴伏于地
面 , 在防风治沙 、 水土保持方面 , 具有极高的应用价
值.
ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)是一种近年来
应用较为广泛的遗传标记技术 , 它来源于植物基因组
中丰富的简单重复序列 (Simple Sequence Repeat , SSR)
由2 ～ 4个随机的核苷酸锚定在微卫星序列的 3或 5
端 , 由此组成的单引物进行重复序列间 DNA的 PCR扩
增[ 3].一方面因其具有无需预知受试材料基因组序列 ,
成本低 、 操作简单 、 灵敏性高且重复性好等优点 , 被
认为是非常理想的分子标记[ 4] ;另一方面 , ISSR标记
技术的引物序列短 , 退火温度高 , 反应体系稳定.因
此 , 近年来已被广泛应用于品种鉴定 、 遗传作图 、 遗
传多样性等方面的研究[ 5] .本研究应用 ISSR分子标记
对 8个蛇含委陵菜居群进行聚类分析 , 力求为委陵菜
种质资源的收集 、 评价和利用提供科学依据.
1　材料与方法
1.1　实验材料
表 1　蛇含委陵菜种质资源
序号 来源地 生境
1
2
3
4
5
6
7
8
湖南益阳
湖南张家界
湖南辰溪
湖南溆浦
湖南凤凰
湖南新宁
湖南通道
广西桂林
稻田渠边
山坡
稻田田埂
稻田田埂
山坡
稻田渠边
山坡
山坡
　　供试材料采自湖南和广西的不同区域 , 经鉴定为
第 31卷第 11 期　　 　 　　　　　　怀化学院学报　　 　 　　　　　　Vol.31.No.11
2 0 1 2年 1 1月　 　 　 　 　JOURNAL OF HUAIHUA UNIVERSITY　 　 　 　 　 　Nov., 201 2
DOI :10.16074/j.cnki.cn43-1394/z.2012.11.008
蔷薇科委陵菜属蛇含委陵菜 (Potentilla kleiniana), 其
来源地及生境如表 1.
1.2　实验方法
1.2.1　蛇含委陵菜 DNA基因组的提取
采取 CTAB法 , 取新鲜嫩叶 1 g , 加入 2% CTAB
800μl , 在干净研钵中迅速磨成粉末状.将细粉转移至
1.5 ml离心管中 , 于 65℃水浴 1 h , 2 min摇一次.冷却
至室温 , 8 000 rpm离心 10 min , 取上清液于另一离心
管中.加入等体积氯仿 异戊醇 (体积比 24:1), 振荡
30 min以上 , 8 000 rpm离心 20 min , 取上清液于另一离
心管中 , 加入 2 倍体积预冷的无水乙醇 , 轻摇 , 出现
白色絮状物 , 挑取絮状物于另一离心管中.用 70%乙
醇洗两次 , 自然干燥 , 大约 1 h.加 50 ulTE溶液溶解沉
淀 , 备用.
1.2.2　ISSR-PCR反应
反应体系为 18 μl , 包括优化后的 ddH2O 11 μl , 10
×PCR缓冲液 2.2 μl , dNTPs0.6 μl (10 nmol L), Mg2+
1.2μl (25 mmol L), 引物 0.8 μl (10 nmol L), DNA 模
板 2 μl (50 ng μl), TaqDNA 聚合酶 0.2 μl (5 U μl), 所
有操作均在冰上进行.94℃预变性 5 min , 94℃变性 30
s , 52℃退火 45 s , 72℃延伸 1.5 min , 共循环 35次 , 然
后 72℃后延伸 10 min , 4℃保温.
1.2.3　DNA电泳检测
将提取的 DNA 和 PCR产物在含有溴化乙锭 (EtBr)
染料染色的 1.0%琼脂糖凝胶中电泳 , 电泳结束后在凝
胶成像系统中照相保存.
1.3　数据分析
同一引物 , 同一位点 , 根据扩增产物的有 (1)无
(0)得到二元资料 , 形成 0 、 1 矩阵 , 用 Ntsys2.10e软
件进行 UPGMA 聚类分析 , 构建聚类图.
2　结果与分析
2.1　ISSR引物的筛选
用以上提取的 8个蛇含委陵菜居群的基因组 DNA
为模板 , 对 20 个引物进行筛选 , 共筛选出 4条稳定性
强 、 条带清晰及多态性丰富的引物.
2.2　ISSR-PCR扩增结果
用筛选出的 4条 ISSR引物共扩增出 41条带 , 其中
39条多态性带 , 多态性比率为 95.21%, 其中一条引物
816对 8个蛇含委陵菜居群的 ISSR-PCR扩增图谱 , 如
图 1.
图 1　引物 816 对蛇含委陵菜基因组的 ISSR扩增结果
注:M 为 DNA marker , 1～ 8样品名称与表1 的相同
2.3　8 个蛇含委陵菜居群的遗传相似性与遗传差异性
根据引物 816 扩增图谱 , 用 NTsys-2.10e 软件计
算供试材料间的遗传相似系数 , 见表 2.由表 2 可知 ,
遗传相似性系数变化范围在 0.4667 ～ 0.8000之间 , 其
中 3号材料辰溪与 4 号材料溆浦的相似系数达到了
1.0000 , 而材料 1号益阳与 6 号新宁 、 8 号桂林蛇含委
陵菜种质资源的相似系数只有 0.4667.由此说明蛇含委
陵菜种质资源间的遗传基础相对较宽 , 存在较大的遗
传变异性.也可见在蛇含委陵菜种质内部有丰富的遗
传多样性 , 从遗传学的角度来看丰富的遗传多样性具
有比较高的环境适应能力[ 6] , 蕴涵着比较大的进化潜
能以及比较丰富的育种和遗传改良潜力.研究遗传多
样性的目的 , 就是为了最大限度地保持种内的遗传多
样性水平 , 维持物种进化潜力和群体的自然繁殖能力 ,
以确保种质资源的可持续利用[ 7].
·42· 怀化学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　2012 年 11月
表 2　8个蛇含委陵菜居群遗传相似性系数
1 2 3 4 5 6 7 8
1 -
2 0.7333 -
3 0.6000 0.6000 -
4 0.6000 0.6000 1.0000 -
5 0.5333 0.8000 0.5333 0.5333 -
6 0.4667 0.6000 0.7333 0.7333 0.5333 -
7 0.6667 0.8000 0.8000 0.8000 0.6000 0.6667 -
8 0.4667 0.6000 0.7333 0.7333 0.5333 0.7333 0.5333 -
图 2　8个蛇含萎陵菜居群基于 ISSR标记的聚类图
2.4　UPGMA聚类
根据遗传相似系数利用 UPGMA 所构建的遗传关系
聚类结果 , 如图 2.UPGMA 聚类的结果表明:8 个蛇含
委陵菜居群在 GS值为 0.668处划分为三大类 , 第一类
是 1号益阳的蛇含委陵菜种质资源 , 第二类包括 2 号
张家界 、 5 号凤凰 , 第三类包括 3 号辰溪 、 4 号溆浦 、
7 号通道 、 6号新宁 、 8号桂林蛇含委陵菜种质资源.
4　讨论
ISSR是一种近年来广泛应用于种质资源遗传多样
性分析的标记技术 , 相对于其他标记方法更简便 、 快
捷 , ISSR技术的原理与 SSR、 RAPD技术类似 , 但它在
引物设计上较 SSR 技术简单得多 , 不需知道 DNA 序
列[ 8] ;ISSR-PCR中引物增加了锚定碱基 , 扩增中基
因组上只有与锚定核苷酸匹配的那些位点才能被靶定 ,
增强了结合的专一性[ 9] ;该技术所需 DNA用量少 , 检
测方便 、 费用低廉 , 且具有很好的稳定性和多态
性[ 10].张福生[ 11] 的金线莲 ISSR反应体系的建立与优化
的研究结果表明:ISSR-PCR反应体系稳定性高、 重
现性好 、 标记位点清晰 、 检测多态性能力强 .本研究
对委陵菜的 ISSR-PCR获得了较高的扩增多态性 , 高
于其它作物上的研究.如孙淑霞[ 12] 等在 ISSR分子标记
技术在桃品种鉴定中的应用中获得了 51.06%的多态
性;高山等[ 13] 在苦瓜种质遗传多样性 ISSR分析中获得
了 61.29%的多态性;赵丽华[ 14] 等在石榴种质资源遗
传多样性及亲缘关系的 ISSR 分析中获了 90.83%的多
态性;何海燕[ 15] 等在黑龙江省大豆种质资源遗传多样
性的 ISSR分析中获得了 89.23%的多态性;ISSR 单位
引物扩增的多态性条带数可能与物种的特异性有关.
从 ISSR-PCR扩增和聚类分析的结果来看 , 不同
蛇含委陵菜居群具有较高的遗传多样性 , 且其遗传多
样性差异与生态分布具有明显的地域规律 , 即地理相
近的材料聚在一起 .虽然呈现一定的地域界限 , 但蛇
含委陵菜居群并不是严格按照地理位置聚在一起 , 还
可能与其生长的环境有关 , 比如气候 、 光照 、 水分 、
土壤 、植物 、 动物 、 微生物以及人类的活动等.在其
适应环境的过程中 , 产生了变异的基因型个体 , 从而
导致不同地区的委陵菜在分子水平上存在一定的差异 ,
表现出一定的地域性分布规律.
·43·第 31 卷第 11 期　　　　　　　牛友芽 , 等:不同蛇含委陵菜居群遗传多样性的 ISSR分析
参考文献:
[ 1] 中国科学院中国植物志编.中国植物志 [ M] .北京:科
学出版社 , 2010:288.
[ 2] 刘 普 , 邓瑞雪 , 段宏泉 , 等.委陵菜化学成分研究
[ J] .中国药学杂志 , 2009 , 44 (7):493-495.
[ 3] 孙雪梅 , 乔爱民 , 孙 敏 , 等.27 个菜心品种遗传多样
性的 ISSR分析 [ J] .西南师范大学学报 , 2010 , 35 (1):
120-123.
[ 4] 张春平 , 何 平 , 王瑞波 , 等.三角叶黄连 ISSR 反应体
系的建立与优化 [ J] .中草药 , 2009 , 40 (2):280 -
284.
[ 5] 冯亮亮 , 唐 红 , 李 毅 , 等.甘肃红砂不同种群遗传多
样性的 ISSR分析 [ J] .草业学报 , 2011 , 20 (1):125-
130.
[ 6] 曹雅男 , 李庆章 , 孙 岳 , 等.正品龙胆遗传多样性的
RAPD及 ISSR 分析 [ J] .中草药 , 2005 , 36 (1):100-
103.
[ 7] 陈燕妮 , 孙振兴 , 常林瑞.长竹蛏不同地理居群的遗传
多样性 [ J] .水生生物学报 , 2010 , 34 (2):271-277.
[ 8] 王照兰 , 杨 持 , 赵丽丽 , 等.扁蓿豆不同品系 ISSR标
记遗传差异和遗传多样性 [ J] .中国草地学报 , 2010 ,
32 (1):11-17.
[ 9] 黎小正 , 童桂香 , 韦信贤 , 等.ISSR-PCR技术及其在
水产生物遗传多样性研究中的应用 [ J] .西南农业学
报 , 2010 , 23 (3):959-964.
[ 10] 邱丰艳 , 邓用川 , 林栖凤 , 等.胡萝卜 ISSR反应体系
优化的研究 [ J] .热带生物学报 , 2010 , 1 (4):306-
313.
[ 11] 张福生 , 郭顺星.金线莲 ISSR反应体系的建立与优化
[ J] .中草药 , 2011 , 42 (1):137-142.
[ 12] 孙淑霞 , 李 靖 , 陈 栋 , 等.ISSR分子标记技术在桃品
种鉴定中的应用 [ J] .中国农学通报 , 2011 , 27 (4):
173-177.
[ 13] 高 山 , 林碧英 , 许端祥 , 等.苦瓜种质遗传多样性的
RAPD和 ISSR分析 [ J] .植物遗传资源学报 , 2010 , 11
(1):78-83.
[ 14] 赵丽华 , 李名扬 , 王先磊 , 等.石榴种质资源遗传多
样性及亲缘关系的 ISSR分析 [ J] .果树学报 , 2011 , 28
(1):66-71.
[ 15] 何海燕 , 沙 伟 , 张艳馥.黑龙江省大豆种质资源遗传
多样性的 ISSR分析 [ J] .大豆科学 , 2011 , 30 (1):36
-40.
Genetic Diversity of Potentilla kleiniana from Different
Populations Based on ISSR Analysis
NIU You-ya1 , 　　OU Zi-dong2 , 　　ZHAO Rong-juan1 , 　　WU Bi1 , 　　YU Juan1 , 　　SHE Chao-wen1
(1.Department of Life Science , Laboratory of Hunan Provincefor Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources , Laboratory of
Hunan Higher Education for Hunan-western Medicinal Plant and Ethnobotany , Huaihua University , Huaihua , Hunan 418008;
2.Zhongnan Construction Group Limited Company in Zhejiang , Hangzhou , Zhejiang 310052)
Abstract:8 samples of Potentilla kleiniana from different areas were analyzed by ISSR markers.The confirmed 4 primers
were screened out from 20 test primers , with highly reproducible , clear and polymorphic bands.The results showed that 39
(95.21%)polymorphic bands were obtained in the total of 41 bands.UPGMA dendrogram analyzed by NTSYS demonstrated that
the diversity levels of the different Potentilla kleiniana resources were relatively high , suggested the relationship of Potentilla
kleiniana from different places were related with the geographical location and ecological distribution.
Key words:Potentilla kleiniana ;　ISSR analysis;　genetic diversity
·44· 怀化学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　2012 年 11月