全 文 ：浙江大学学报 (农业与生命科学版 )　 29( 6): 609～ 613, 2003
Journal of Zhejiang Un iversity ( Ag ric. & Life Sci. )
　　收稿日期: 2002-05-09
基金项目: 浙江省自然科学基金资助项目 ( 302362) .
作者简介: 何新华 ( 1966— ) ,男 ,湖南衡阳人 ,副教授 ,博士研究生 ,从事分子生物学和生物固氮工作。 Tel: 0571-86971390;
E-mai l: h e xh@ yahoo. com.
文章编号: 1008-9209( 2003) 06-0609-05
杨梅根瘤 Frankia菌的分离和培养特性研究
何新华 1, 2 , 陈力耕 1 , 柴春燕3 , 何水平 1
( 1. 浙江大学 园艺系 ,浙江杭州 310029; 2. 广西大学园艺系 ,广西 南宁 530005; 3. 慈溪市杨梅研究所 ,浙江 慈溪 315300)
摘　要: 从荸荠种杨梅根瘤中分离获得 3个内生菌株 ,经显微镜检查、回接、固氮活性测定、革兰氏染色
检测 ,证实这 3个内生菌为 3个 Frankia sp. ,分别命名为 M pc11、 Mpc12、 Mpa11,并对这 3个分离株的
培养特性进行了研究。 结果表明 , M pc11、 M pc12、 Mpa11 3个菌株的固氮酶活性分别为 691 nmol乙烯 /
mg蛋白 h、 689 nmo l乙烯 /mg蛋白 h和 1039 nmol乙烯 /mg蛋白 h。 适宜于在 BAP(有氮 )固体培养
基、 BM+ NZ和 FM S液体培养基上生长。 且分别以葡萄糖、丙酮酸钠 (含量均为 1 g /L )、吐温-20(含量
为 1 m L /L )为唯一碳源或分别以酪蛋白水解物、酵母抽提物 (含量均为 0. 5 g / L)为唯一氮源的 BAP培
养基上生长良好 ;能利用丙酸钠 ,但利用率低 ;且均不能利用尿素。 Mpc11和 M pa11分离株适宜于在
pH5. 5～ 6. 5范围内生长 , pH7. 0以上则菌体生长受到抑制。
关　键　词: 杨梅 ; 弗兰克氏菌 ; 分离 ; 培养特性
中图分类号: Q945. 13　　　文献标识码: A
HE Xin-hua1, 2 , C HEN Li-geng1 , CA I Ch un-yan3 , HE Shui-ping1 ( 1. Dept. of Horticulture , Zhejiang
University , Hangzhou 310029, China; 2. Dept. of Horticulture , Guang x i University , Nanning
530005, China; 3. Yangmei Institute of Cix i City , Zhe jiang 315300, China )
Isolation and cultural characterist ics of Frankia symbiosed with Myrica rubra. Journal o f Zh ejiang
Univ er sity ( Ag ric. & Life Sci. ) , 2003, 29( 6): 609-613
Abstract: Three endophytes iso la ted from roo t nodules of Myrica rubra var. biji w ere identified as
Frank ia sp. and designated as Mpc11, Mpc12 and Mpa11 based on results of mic roscopic examina tion,
inocula tion, nit rog enase activ itity measurem ent and Gram-staining. Char acteristics o f behavior o f the
th ree iso la tes during culture wa s studied. The nitr og ena se activities o f Frank ia Mpc11, M pc12 and
Mpa11 expressed as the amount of ethy lene relea sed pe r unit o f pro tein w ere 691 nmol C2 H4 /mg pro tein
h, 689 nmol C2H4 /mg protein h and 1039 nmol C2 H4 /mg pro tein h respectiv ely. BAP( nitro gen) solid
media , BM+ NZ and FM S liquid media w ere sufficiently suitable fo r the g row th o f th ree Frank ia
strains, wher ea s th e PAM solid media failed to suppo r t their g row th. Especially fine g row th we re ob-
tained on BAP media with g luco se , sodium py ruva te o r Tw een-20 as sole carbon source and casamino
acid o r y east ex tract as so le nit rog en source. They could use sodium propionate , a lthough inefficiently.
U rea could no t be utilized. p H 5. 5-6. 5 w ere suitable fo r the g rowth o f Frankia strain Mpc11 and
Mpa11 w hich w ere inhibited a t pH above 7. 0.
Key words: Myrica rubra; Frank ia; iso la tion; cultural characte ristics
　　目前世界上有 8科 , 24属 , 200多个种的木
本双子叶非豆科植物是由放线菌中的弗兰克氏
菌 (Frankia )诱导结瘤固氮的 [1 ] ,杨梅属 35个种
中有 28种植物能与放线菌 Frankia共生结瘤固
氮。我国有 4种杨梅 ,其中毛杨梅、矮杨梅和杨梅
能与放线菌 Frankia共生结瘤固氮 [2 ]。其中杨梅
(Myrica rubra )是我国特产水果 ,是唯一能共生
固氮的果树 ,具有重要的经济价值和生态价值。
　　自从 1978年 Callaham[3 ]等从香蕨木中分
离出内生菌并离体培养成功以来 , Frankia菌的
研究获得了突破性的进展 ,已成为当前生物固氮
研究中最活跃的一个领域。中国科学院沈阳应用
生态研究所 [4 ]和日本的 Hiyo shi等 ( 1988) [5 ]从
杨梅根瘤中曾分离出少量的 Frank ia菌株 ,但未
见对这些分离株进行深入研究。浙江是杨梅主产
区 ,但未见有从浙江产区杨梅根瘤中分离内生菌
的报道。本文采用根瘤切片法从荸荠种杨梅根瘤
中获得了一些分离株 ,并对这些分离株的培养特
性进行了较为详细的研究。
1　材料与方法
1. 1　材　料
　　供试根瘤采自浙江省慈溪市横河镇和浙江
省安吉县荸荠种杨梅。
1. 2　方　法
1. 2. 1　分离方法　 　采用根瘤切片法和
Qmod改良培养基分离 Frankia菌株 [2 ]。
1. 2. 2　回接试验　　将在 1 /2 M S固体培养
基无菌培养的杨梅小苗根系浸入接种剂中 12
h,然后移入盛有营养液的玻璃瓶中 ,用报纸将
玻璃瓶包裹 ,使根系处于避光状态 ,置于 25℃
左右的培养室中培养 ,光暗周期为 16 /8 h,营
养液为 1 /4 Hoagland无氮溶液 ,每隔两周更换
一次营养液。接种 2个月后 ,将杨梅苗移入装有
珍珠岩的的较大标本瓶中 ,浇灌 1 /4 Hoag land
营养液 ,每月定期观察结瘤情况。
1. 2. 3　菌体形态　　用 O LMPU S光学显微
镜和 PHILIPS X L-30ESEM扫描电镜观察菌
体形态。
1. 2. 4　固氮酶活性　　乙炔还原法测定分离
株纯培养物的固氮活性。用 SP-6800气相色谱
仪监测乙烯的生成量 ,并换算成固氮酶比活。气
相测试条件为:炉温 40℃ ,进样温度 70℃ ,检
测温度 100 ℃ ,载气 ( N2 ) 0. 12 M Pa,氧气
0. 078 M Pa,氢气 0. 05 M Pa。
1. 2. 5　培养特性观察　　离心收集菌体 ,经无
菌水洗涤后匀浆 ,分别接种于 PAM [6 ]、 BAP[7 ]
(有氮 )、 BM+ N Z、 FM S[8 ]、 DPM [9 ] 5种培养基
(液体和固体 )上 , 25℃下黑暗静止培养 , 1周
后开始观察各试验菌株在不同固体培养基上的
生长情况 ;接种后 20 d,采用 Bradfo rd改良
法 [ 10]测定不同液体培养基中菌体蛋白含量 ,用
菌体蛋白含量代表菌体生长情况。
1. 2. 6　碳源和氮源利用　　供试碳源 5种:琥
珀酸钠、丙酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖和吐温 -20,
基础培养基是 BAP液体培养基 ( 0. 1% NH4 Cl
为氮源 ,无碳源 ) ,以无碳源的 BAP培养基作对
照 ,碳源终浓度为 0. 1%。 供试氮源 4种:酪蛋
白水解物、酵母膏、尿素、氯化铵 ,基础培养基是
BAP液体培养基 ( 0. 05%的丙酸钠为碳源 ,无
氮源 ) ,以无氮源的 BAP培养基为对照 ,氮源的
终浓度为 0. 05%。 供试碳源、氮源及所用的其
它试剂均为国产分析纯试剂。接种供试菌株 ,置
于 25℃的培养室中暗培养 15d后 ,测定菌体生
长量 ,每个处理重复 3次。
1. 2. 7　 pH对 Mpc11和 Mpa11生长的影响
以 BAP为基础培养基 , 0. 1%葡萄糖为碳源 ,
0. 05%酪蛋白水解物为氮源 ,采用 PHS-3C精
密 pH计测定培养基的 pH值 ,用 1. 0 mol /L
HCl和 1. 0 mol /L NaOH调节 pH, pH值分别
设 5. 5、 6. 0、 6. 5、 7. 0、 7. 5和 8. 0 6个处理 ;相
同分离株的不同处理分别接入等量的菌悬液 ,
每个处理重复 3次。 接种后在 25℃下暗培养
15 d,测定菌体生长量。
2　结果与分析
2. 1　分离结果
　　采用根瘤切片法在 Qmod固体培养基上
610　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 9卷　
28℃下暗培养 33 d后 ,从组织块边缘长出约 1
mm大小的菌落 ,获得 3个不同的菌落 ,将这 3
个菌落在 BAP有氮液体培养基中培养 ,然后 ,
在 BAP有氮固体培养上划线获得单菌落 ,即获
得 3个分离株 ,分别命名为 Mpc11、 Mpc12和
Mpa11,经革兰氏染色 ,全部为阳性。
2. 2　回接结果
　　接种 8个月后 ,每个分离株接种的 3株杨
梅幼苗中均有一株杨梅幼苗根部形成根瘤 ,而
对照无根瘤形成 (图 1)。
A-未接种 ; B-接种 Mpa11.
图 1　Mpa11回接试验
Fig. 1　Nodu les formed in Myrica rubra seedlings
in oculated wi th Fran kia Mpa11
2. 3　菌体形态
　　在光镜下可观察到分离株的菌丝、泡囊和
孢子囊结构 ;用扫描电镜观察 ,能看到分枝状的
菌丝 ,直径为 0. 6～ 1. 1μm,在菌丝末端或菌丝
居间形成孢子囊 ,孢子囊直径 15～ 30μm,长椭
圆形 (图 2)。
2. 4　固氮酶活性
　　 3个分离株在无氮 BAP培养液 ,以葡萄糖
sp-孢子囊
图 2　Frankia分离株 Mpc11的形态结构
(× 3000) ( SEM )
Fig. 2　 St ructure of Frankia Mpc11(× 3000)
为碳源 , 25℃暗培养 15 d, 用乙炔还原法测定
固氮活性。 Mpc11、 Mpc12和 Mpa11 3个分离
株的固氮酶活性分别为: 691 nmol乙烯 /mg蛋
白 h, 689 nmol乙烯 /mg蛋白 h和 1039 nmol
乙烯 /mg蛋白 h。
2. 5　培养特性
2. 5. 1　在固体培养基上的生长情况　 　
Mpc11、 Mpc12菌株在 BAP(有氮 )和 BM+ N Z
上生长最好 , 其次是 FM S和 DPM,在 PAM
上生长最差。 Mpa11在 BAP(有氮 )和 DPM上
生长最好 , BM+ N Z和 FM S次之 ,在 PAM上
不能生长。 3个菌株在不同的培养基上颜色不
同 ,有无色、淡黄色、黄褐色和粉红色几种颜色。
2. 5. 2　在液体培养基中的生长情况　　 3个
分离株在不同的液体培养基中培养 20 d后 ,测
其菌体生长量 (表 1)。
　 　从表 1的结果可见 , Mpc11、 Mpc12和
Mpa11 3个分离株在 BM+ N Z培养基中生长
最好 ,在 PAM和 DPM液体培养基上生长
较差。
表 1　 3个 Frankia菌分离株在不同液体培养基中的生长情况
Table 1　 Grow th yield of th ree isolates of Frankia cultured in dif ferent liquid media 菌体蛋白μg /mL
菌株 培养基
PAM BAP BM+ NZ FM S DPM
Mpc11 1. 40± 0. 24 8. 21± 0. 43 45. 84± 0. 98 38. 48± 0. 45 0. 84± 0. 13
Mpc12 1. 06± 0. 24 4. 81± 0. 30 31. 47± 1. 05 21. 34± 0. 40 0. 64± 0. 23
Mpa11 0. 69± 0. 91 5. 69± 0. 34 72. 77± 3. 42 36. 10± 1. 09 0. 96± 0. 14
611　第 6期 　 何新华 ,等: 杨梅根瘤 Frankia菌的分离和培养特性研究 　 　　　　
2. 6　碳源和氮源利用
2. 6. 1　碳源利用　　 3个分离株对葡萄糖、丙
酮酸钠 (含量均为 1 g /L)和吐温 -20(含量为 1
m L /L)的利用良好。 Mpc11和 Mpc12对以丙
酮酸钠为唯一碳源时 ,菌体生长最快 ;葡萄糖和
吐温-20次之。 Mpa11以葡萄糖为唯一碳源时
生长最快 ,丙酮酸钠和吐温次之 , 3个菌株利用
丙酸钠较差 ,对琥珀酸钠 (含量为 1 g /L)基本
不能利用 (图 3)。
图 3　碳源对 Frankia菌生长的影响
Fig. 3　 Th e ef fect of carbon sources on grow th of
F rankia sp.
　　根据供试菌株对碳源的利用情况 ,选择
Mpc11分离株为代表 ,探讨不同碳源浓度对生
长的影响。 Mpc11分离株利用吐温 -20的最适
浓度为 0. 5 mL /L,在 1. 0～ 4. 0 mL /L的吐
温 -20范围内 ,也能很好地生长 ,但当吐温-20的
浓度为 5. 0 mL /L时 ,生长受到抑制 ; M pc11在
葡萄糖浓度为 0. 5～ 5. 0 g /L时 ,均生长良好 ,
但随着浓度的增加 ,生长速度减慢 ,在本试
验中 ,当葡萄糖浓度为 0. 5 g /L时 ,生长最快。
当丙酮酸钠的浓度在 0. 5～ 5. 0 g /L范围时 ,浓
度的变化对 Mpc11分离株影响不大 ,均能很好
地生长 ,但随着浓度的增加 ,生长速度加快 ,在
本试验中 ,丙酮酸钠浓度为 5. 0 g /L时达最
大值。
2. 6. 2　氮源利用　　 3个分离株对酪蛋白水
解物、酵母膏、氯化铵 (含量均为 0. 5 g /L )均能
利用 ,但不能利用尿素。 以酵母膏为唯一氮源
时 ,菌体生长最快 ;酪蛋白水解物也是良好的氮
源 ,菌体生长快。但菌体对氯化铵的利用较差
(图 4)。
图 4　氮源对 Frankia菌生长的影响
Fig. 4　 Th e ef fect of ni trogen sources on grow th of
Frankia sp.
2. 7　 pH对 Mpc11和 Mpa11生长的影响
　 　以不同地理来源的 Frankia菌分离株
Mpc11和 Mpa11来探讨 pH对 Frankia菌生
长的影响 ,结果发现 Mpc11和 Mpa11菌株的
生长受 pH影响较大 ,在 pH5. 5～ 6. 5范围内生
长良好 , pH7. 0以上时 ,菌体生长受到抑制。
Mpc11在 pH5. 5时菌体生长最快 ,在 pH5. 5～
6. 5范围内随着 pH值的升高 ,菌体生长速度变
慢 ;而 Mpa11则相反 ,在 pH5. 5～ 6. 5范围内
随着 pH值的升高 ,菌体生长速度加快 ,在
pH6. 5时 ,菌体生长最快。
3　讨　论
3. 1　光学显微镜与电子显微镜观察到的杨梅
根瘤 Frankia分离株的菌丝、孢子、孢子囊及泡
囊大小与丁鉴等 ( 1989) [11 ]报道的分离自香杨
梅根瘤的 Frank ia菌株 Mg+ 和宾州杨梅根瘤
的菌株 MpI基本相同 ,而与王慧英等 ( 1990) [12 ]
观察到的杨梅根瘤内生菌的菌丝、孢囊大小有
差异。这些差异是否属杨梅根瘤内生菌自然状
态和离体培养条件下存在的差异 ,有待进一步
研究。
3. 2　已有的研究报道 ,从杨梅属植物分离出来
的 Frankia菌株均能很好地利用丙酸钠 ,不能
利用丙酮酸或丙酮酸钠 [2, 4, 13～ 15 ] ,或能利用丙酮
酸钠但对糖不利用 [15 ] ,但本试验得到的 3个分
离株 Mpc11、 Mpc12和 Mpa11均能很好地利
用丙酮酸钠 ,对丙酸钠利用较差或利用很差。这
可能是因浙江杨梅根瘤中的 Frankia菌与其他
612　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 9卷　
地方的杨梅属植物根瘤 Frank ia菌存在菌株差
异所致。
3. 3　从杨梅根瘤中分离出来的 Frankia菌株
在酸性条件下生长良好 ,若 pH大于 7, Frank ia
菌株生长明显受到抑制 ,这与杨梅适合种植在
酸性土壤有关 ,是长期适应环境的结果。但从不
同地方的杨梅根瘤中分离出的 Frankia菌株 ,
生长所需的最适 pH值存在一定的差异。
致　谢: 电镜观察承蒙浙江大学电镜室的徐 颖、洪
健、何黎平、胡东维等同志的协助 ,特此致谢。
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