全 文 ：2009年 6月 甘　肃　农　业　大　学　学　报 第 4 4 卷
第 3 期 106 ～ 111 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSIT Y 双 月 刊
甘肃不同生态区域苜蓿根瘤菌表型多样性分析
张小甫 ,师尚礼 ,南丽丽 ,陈积山 ,满元荣
(甘肃农业大学草业学院 , 草业生态系统教育部重点实验室 , 中美草地畜牧业可持续发展研究中心 ,甘肃 兰州　730070)
摘要:对甘肃不同生态气候区域筛选出的促生能力好的 31 株分离自`阿尔岗金 (Medicago sativa `Alogon-
quin )和`陇东苜蓿 (Medicago sativa `Longdong )2 个紫花苜蓿品种的根瘤菌株 , 进行性状测定和聚类分析.结果
表明:31 株供试菌中 , DL67、GL16 、QA33B、QL31B 、WA24 和WL27 菌株综合功能最强;聚类分析结果表明 , 31 株
供试菌和 3 株对照标准菌株均为中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp)根瘤菌 ,但 GA26 菌株与其它 33 株菌株分属不
同类群.
关键词:苜蓿;根瘤菌;抗逆性;表型性状
中图分类号:Q 939.11 +4　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1003-4315(2009)03-0106-06
作者简介:张小甫(1981-),男 ,汉族,在读硕士 ,主要从事牧草种质资源方面的研究.E-m ail:zhangxiaofu1981@126.com
通信作者:师尚礼 ,教授 ,研究方向为草原种质资源与育种.E-mail:shish l@gsau.edu.cn
基金项目:“十一五”国家科技支撑计划(2006BAD01A19);农业部公益性行业(农业)科研专项(nyh yzx07-022).
收稿日期:2008-05-28;修回日期:2008-06-29
Phenotype diversities of alfalfa rhizobium strains collected in
dif ferent ecological regions in Gansu P rovince
ZHANG Xiao-fu ,SHI Shang-li ,NAN Li-li ,CHEN Ji-shan , MAN Yuan-rong
(Colleg e of P rataculture , Gansu Ag ricultur al Unive rsity , Key Labo ra to ry of G rassland Ecosy stem , Ministry of
Education Sino-U S Center fo r G razingland Ecosystem Sustainability , Lanzhou 730070 , China)
Abstract:31 bacterial stains sepa rated f rom tw o alfafa cultiv ars , Medicago sativa `A logonquin and
Medicago sativa `Longdong , which w ere collected in different ecolog ical o r climatic regions in Gansu
Province ,were screened for t rai ts dete rmination and cluster analysis.The results showed that DL67 ,G L16 ,
QA33B ,QL31B ,WA24 and WL27 had st ronger comprehensive function than o thers.A ccording to the clus-
ter analysis , all the 31 bacterial stains and 3 control stains belonged to S inorhizobium ,how ever , the st rains
GA26 w as clustered into one g roup.
Key words:alfalfa;rhizobium;anti-adversi ty ability;pheno typic t rait s
　　根瘤菌的形成是非常复杂的过程 ,需要共生体
双方的相互诱导和识别 ,以及各自一系列基因的时
序表达.就根瘤菌而言 ,其结瘤基因 、结瘤因子 、胞外
多糖和脂多糖等都与共生体双方的相互识别有关 ,
而且在不同程度上决定了根瘤菌的寄主范围.豆科
植物与根瘤菌的共生关系具有高度专一性 ,所以 ,根
瘤菌的生态分布对应于寄主的生态分布[ 1] .对根瘤
菌资源和其固氮机理的研究正在逐步广泛和深入 ,
特别是在根瘤菌资源研究方面 ,新的属 、种不断被发
现.近年来的研究表明 ,许多分离自相同寄主植物的
根瘤菌表现出很高多样性 ,不同地区 ,甚至同一地区
或同种寄主来源的根瘤菌也存在着多样性[ 2-3] .
苜蓿根瘤菌的不同菌株与不同品种间有很强的
选择性 ,只有共生性很强的“菌株-品种”才能形成固
氮的最佳体系[ 9] .本研究选取甘肃不同地区的 31个
紫花苜蓿根瘤菌株为研究对象 ,进行表型多样性测
第 3 期 张小甫等:甘肃不同生态区域苜蓿根瘤菌表型多样性分析
定 ,选育优良菌株 ,以期为西北干旱半干旱区紫花苜
蓿种植提供优良菌株资源.
1　材料和方法
1.1　试验材料
供试菌株选用从甘肃不同生态气候区域 ,筛选
出的 31 株分离自`陇东苜蓿 (Med icago sativa
`LongDong )和`阿尔岗金 (Med icago sat iva `Al-
ogonquin )2个紫花苜蓿品种的根瘤菌株 ,菌株编
号 、宿主名称及宿主的产地见表 1;3株对照标准菌
种为 CK-2531(S inorhizbium mel i loti i)、CK-2545
(S inorhizbium f redi i)、CK-2547(S inorhizbium
med icar).
表 1　供试菌种名称编号及产地
Tab.1　The strains tested name , number and habitat
菌株编号　　 宿主品种名称 宿主产地
DA10、DA42 、DA53 、DA99 阿尔岗金 定西
DL15 、DL58、DL67 、DL81 陇东苜蓿 定西
GA26 、GA28、GA66 阿尔岗金 甘南
GL16 、GL21 、GL24 、GL65 陇东苜蓿 甘南
QA33B、QA46A、QA50A 阿尔岗金 庆阳
QL20B、QL31B 、QL36B 陇东苜蓿 庆阳
TA34 阿尔岗金 天水
TL18、T L22A 、TL47 陇东苜蓿 天水
WA24 、WA32、WA62A 阿尔岗金 景泰
WL47 、WL53、WL68 陇东苜蓿 景泰
1.2　性状测定
1.2.1　形态观察　根据微生物的菌落特征和革兰
氏染色法 ,来观察菌落形态和菌体形态.
1.2.2　生理生化性状　生理生化测定主要参照《微
生物学实验》 《伯杰细菌鉴定手册》 《一般细菌常用
鉴定方法》[ 4-7] 等书中介绍的方法进行.
1.2.2.1　唯一碳源氮源测定　唯一碳源利用测定
包括蔗糖 、葡萄糖 、甘露醇 、苹果酸 、乳糖 、肌醇 、肌酸
的测定;唯一氮源利用测定包括硝酸钾 、硫酸铵 、L-
色氨酸的测定 ,且碳氮源的终浓度均为 0.1 %.
1.2.2.2　耐盐性测定 　NaCl浓度的处理梯度为
10 g ·L-1 、20 g · L-1 、30 g · L-1 、40 g · L-1 、45
g ·L-1 、50 g ·L-1 、55 g · L-1和 60 g ·L -1 .耐酸
(HCl)性测定 pH 为 3 、4 、5 、6 ,耐碱(NaOH)性测定
pH 为 9 、10 、11 、12.
1.2.2.3　抗生素敏感性测定　卡那霉素 5个浓度
处理:20 mg · L-1 、30 mg · L-1 、40 mg · L -1 、50
mg ·L-1 、60 mg ·L -1 ;氨苄青霉素 6个浓度处理:
50 mg · L-1 、 60 mg · L-1 、70 mg · L-1 、80
mg ·L-1 、90 mg ·L -1 、100 mg ·L-1 ;硫酸链霉素
5 个浓度处理:40 mg · L -1 、50 mg · L-1 、60
mg ·L-1 、70 mg ·L -1 、80 mg ·L-1 .
1.2.2.4　其它测定项目　其它测定项目包括淀粉
水解实验 、纤维素分解 、甲基红试验 、乙酰甲基甲醇
试验 、柠檬酸盐试验 、过氧化氢试验 、石蕊牛乳试验 、
产氨试验 、产硫化氢试验 、硝酸盐还原试验和卵磷脂
酶试验.
1.2.3　聚类分析　采用 SPSS 软件进行分析 ,运用
欧式距离和组间平均连锁法完成 ,聚类结果以树状
图表示.
2　结果与分析
2.1　菌株形态观察结果
由图 1和图 2 菌株形态观察结果可以看出:供
试根瘤菌的菌落形态特征多为圆型 ,边缘整齐 ,半透
明粘稠状突起 ,表面光滑 ,有光泽 ,乳白色;只有少数
为长圆型.供试根瘤菌经过革兰氏染色后多为粉色 、
图 1　菌落特征
Fig.1　Co lony mo rphology rhizobia
图 2　菌株形态及革兰氏染色结
Fig.2　Gram staining of str ain
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甘 肃 农 业 大 学 学 报 2009 年
浅粉色或乳白色 ,形态为杆状 、短杆状和球状.
2.2　菌株生理生化性状测定结果
2.2.1　菌株碳源氮源利用　在试验中发现 ,供试菌
株和对照标准菌株均能在葡萄糖 、甘露醇 、蔗糖 、乳
糖 、肌醇等单糖或双糖培养基上生长 ,其中 ,最适碳
源培养基为葡萄糖 、甘露醇和蔗糖 ,在乳糖 、肌醇碳
源培养基上生长较慢 ,而苹果酸和肌酸等酸性碳源
培养基由则对菌株生长起抑制作用.此外 ,供试菌株
和对照标准菌株均能在硫酸铵 、硝酸钾和 L-色氨酸
等氮源培养基上较快生长.
2.2.2　菌株耐盐能力 　试验结果表明 ,在 31株供
试菌株中 ,WA24菌株的耐盐性最好 ,可在 NaCl质
量浓度为 55 g ·L-1的 YMA 培养液中生长;GL16 、
QA33B和WA 62A 菌株的耐盐性较好 ,在 NaC l质
量浓度为 50 g ·L -1的 YMA 培养液中能够生长;
DA10 、DA99 、DL15 、DL58 、DL67 、DL81 、GA66 、
G L21 、GL24 、 GL65 、 QA46A 、 QA 50A 、 Q L31B 、
QL36B 、T L18 、T L22A 、T L47 、WA32 、WL53菌株的
耐盐性好 ,能耐受 45 g · L-1的 NaCl质量浓度;其
他菌株的耐盐性较差 ,只能耐受 35 g ·L-1的 N aCl
质量浓度.
2.2.3　菌株耐酸碱能力　试验结果表明 , 31 株供
试菌株和 3株对照标准菌株均可在 pH3.5 ～ 5.0的
范围内生长 ,大多数在 pH5.0以上长势较好 ,其中 ,
DA53 、QL31B和 TL47菌种能耐受 pH3.5 的酸性
环境;在碱处理中 ,供试菌株和对照标准菌株均可在
pH9.0 ～ 12.0 的范围内生长 ,其中 , DL67 、GL21 、
QA33B和WA 32菌株可耐受 pH12.0的碱性环境 ,
其余菌株在 pH9.0 ～ 10.0的碱性环境下生长良好.
2.2.4　菌株抗生素敏感性　通过对供试苜蓿根瘤
菌菌株的抗生素性能的测定及筛选证明 , 31株供试
菌株和 3株对照标准菌株在较低的抗生素浓度下 ,
大多数能够正常生长.其中 ,能耐受 50 mg · L-1卡
那霉素的菌株有 DL67 、DL81 、GL16 、QA46A 、
T L22A 、T L47 、WA24 、WL53 、WL68;能耐受 100
mg ·L -1氨卞青霉素的菌株有 QL31B 、TL47;能耐
受 80 mg ·L -1硫酸链霉素的菌株有 DL67 、DL81.
2.2.5　石蕊牛奶试验　本试验中 ,只有 GA26菌株
加入到石蕊牛奶中时 ,石蕊变成蓝色 ,说明菌株分解
酪蛋白产生碱性物质;而其它 30株供试菌加入到石
蕊牛奶中时 ,石蕊均变成红色 ,说明菌株发酵乳糖产
酸.此外 ,所有供试菌的石蕊牛奶试验均有血清层.
2.2.6　菌株其他指标测定　由表 2 可知 ,淀粉水
解 、纤维素分解和柠檬酸盐试验中 ,供试菌种和对照
标准菌种均不能直接利用淀粉 、纤维素和柠檬酸盐;
甲基红和乙酰甲基甲醇试验 ,供试菌种和对照标准
菌种均为阴性反应;在过氧化氢酶的试验中 , 除
GA26外其余菌株均能发出气泡;硝酸盐还原试验
中 ,GA 26 、GL16和 GL24菌株不能使硝酸盐还原 ,
说明 GA26 、GL16和G L24菌株不能把培养基中的
硝酸盐还原为亚硝酸盐;在产硫化氢试验中 ,供试菌
种和对照标准菌种均不能产生硫化氢气体;在卵磷
脂酶试验中 ,所有的供试菌株与对照标准菌株均有
溶磷能力.
2.3　聚类分析结果
通过对测定的所有生理生化表型性状数据进行
转化 ,去除完全相同性状 ,在 SPSS 软件里运用欧式
距离 、组间平均连锁法 ,进行系统聚类分析 ,得到数
值聚类树状图(图 3).
由图 3可知 ,所有供试菌株若以遗传距离的远
近为分类界限 ,它们可以聚为 2大类群:第 Ⅰ类群由
5 个亚类组成 , 第一亚类包括 GA66 、QA46A 、
WL53 、QA50A 、DA99 、G L21 、DL81 、QL36B 、T L18 、
GL65 、DL67 、TA34 、DL15 、QL31B , 能与 CK-2545
(S inorhizbium f redii)聚为第 Ⅰ类群 ,这类根瘤菌
菌株之间遗传距离较小 ,以甘露醇 、葡萄糖 、蔗糖为
碳源利用一致;在耐卡那霉素和耐盐性试验中都表
现出好的耐受性;DL58 、T L22A 、 TL47 、WA32 、
DA10菌株聚为第二亚类;第三亚类由 G L24 、CK-
2547 、GL16菌株组成 ,它们的寄主都是甘南的`陇
东苜蓿 ,菌株之间的遗传距离较近 , 与 CK-2547
(S inorhizbium medicar)可聚为一类 ,并且在硝酸
还原试验中结果一致;QA33B 、WA62A 、WA24 菌
株为第四亚类 ,菌株的寄主分别来自庆阳和武威`阿
尔冈金 ,说明根瘤菌结瘤主要影响因素是寄主的范
围 ,与地域的差异不大 ,此类菌株在耐盐性和耐酸碱
性有着较高的抗性;第五亚类包括 GA28 、QL20B 、
DA42 、DA53 、WL47和WL68与CK-2531(Sinorhi-
zbium meli lot ii)可聚为一类 ,由于菌株之间遗传距
离较近 ,在耐盐试验中 ,菌株对盐分条件敏感 ,但含
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第 3 期 张小甫等:甘肃不同生态区域苜蓿根瘤菌表型多样性分析
表 2　供试菌株生理生化指标
Tab.2　Cha racteristics o f the tested stains
菌株 淀粉水解 纤维素分解 甲基红
乙酰甲
基甲醇 柠檬酸盐 过氧化氢
硝酸盐
还原 产氨 产硫化氢 卵磷脂
DA10 - - - - - + + - - +
DA42 - - - - - + + - - +
DA53 - - - - - + + - - +
DA99 - - - - - + + - - +
DL15 - - - - - + + - - +
DL58 - - - - - + + - - +
DL67 - - - - - + + - - +
DL81 - - - - - + + - - +
GA26 - - - - - - - - - +
GA28 - - - - - + + - - +
GA66 - - - - - + + - - +
GL16 - - - - - + - - - +
GL21 - - - - - + + - - +
GL24 - - - - - + - - - +
GL65 - - - - - + + - - +
QA33B - - - - - + + - - +
QA46A - - - - - + + - - +
QA50A - - - - - + + - - +
QL20B - - - - - + + - - +
QL31B - - - - - + + - - +
QL36B - - - - - + + - - +
TA34 - - - - - + + - - +
TL18 - - - - - + + - - +
TL22A - - - - - + + - - +
TL47 - - - - - + + - - +
WA24 - - - - - + + - - +
WA32 - - - - - + + - - +
WA62A - - - - - + + - - +
WL47 - - - - - + + - - +
WL53 - - - - - + + - - +
WL68 - - - - - + + - - +
CK-2545 - - - - - + + - - +
CK-2547 - - - - - + + - - +
CK-2531 - - - - - + + - - +
　　注:“-”表示阴性反应;“ +”表示阳性反应.
盐量达到一定值时 ,菌株停止生长;硝酸还原试验中
不能将硝酸盐直接还原;在氨苄青霉素和硫酸链霉
素敏感性试验中 ,有较好的耐药性 ,可以作为耐药菌
株进行推广利用.第 Ⅱ类群只有一个菌株 GA26.
GA26与大多数菌株的遗传距离较大 ,并且它的理
化指标中石蕊牛奶测定变碱并有血清层 ,在过氧化
氢酶的试验中未发出气泡;在硝酸盐还原反应中 ,
GA26不能使硝酸盐还原.由于这 31个菌株都能聚
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甘 肃 农 业 大 学 学 报 2009 年
在一类 ,并且和 3个对照标准菌株都聚在其中 ,可以
认为 31株供试菌均是中华根瘤菌属(S inorhizobi-
um sp)根瘤菌.
图 3　菌株的表型聚类图
Fig.3　Str ains rescaled clustering figure
3　讨论与结论
本试验发现 ,葡萄糖 、甘露醇和蔗糖等大多数单
糖和双糖适合菌株生长 ,以乳糖 、肌醇作为碳源时 ,
菌株生长较慢 ,苹果酸与肌酸等酸性碳源物质对菌
株生长起抑制作用 ,此外 ,供试菌株和对照标准菌株
均能以硫酸铵 、硝酸钾和 L-色氨酸作为氮源 ,此结
果与王素英等根瘤菌碳源氮源利用结果相一致[ 8] .
万晓红等[ 9] 研究表明 ,在抗生素敏感性实验中 , 52
株未知菌株在低抗生素浓度下 ,绝大部分菌株能够
正常生长 ,但随着浓度的升高 ,能够生长的菌株数目
逐渐减少.本试验结果表明 , 31 株供试菌株和 3 株
对照标准菌种在较低的抗生素浓度中绝大多数菌株
能够正常生长 ,与万晓红等人的研究结果一致.此
外 ,微生物生长繁殖需要一定的酸碱度即 pH 值环
境 ,一般根瘤菌需要的最适 pH 值环境为近中性 ,过
酸过碱的环境条件对根瘤菌的生长和结瘤均有明显
的抑制作用(Thakuria D , 2004)[ 11] .在本试验中 ,
DL67 、GL21 、QA33B和 WA32 菌株可在碱性条件
下生长 , 有很强的耐碱性 , DA53 、QL31B 和 T L47
可在酸性条件下生长 ,能耐受 pH3.5的酸性环境 ,
大多数菌株在 pH6.0 ～ 10.0的环境下生长良好 ,与
陈文新等人结果一致[ 10] .综合根瘤菌耐盐性 、抗酸
碱 、耐受抗生素和溶磷能力 ,以及其他生理生化指标
发现 ,综合功能较强的菌株有 6株 ,分别为 DL67 、
GL16 、QA33B 、QL31B 、WA24 、WL27.
从聚类分析图中可以得出 ,第一亚类供试菌株
GA66 、 QA46A 、 WL53 、 DA10 、 QA50A 、 DA99 、
GL21 、 DL81 、 Q L36B 、 TL18 、 GL65 、 CK-2545 、
DL67 、CK-2531 、DL15 、QL31B 和 DL58 、T L22A 、
TL47 、 WA32 、 DA10 、 GL24 、 CK-2547 、 G L16 、
QA33B 、WA62A 、WA24初步可认为是中华根瘤菌
属(S inorhizobium)根瘤菌.在生理生化特征上表现
为相似性 ,并且其寄主包括分离自定西 、甘南 、天水 、
庆阳 、武威的`阿尔冈金 和`陇东苜蓿 ,其表型性状
的相似性高.周湘泉等研究说明 ,虽然根瘤菌的形成
是复杂的过程 ,但根瘤菌与豆科植物共生结瘤具有
专一性[ 12] ,不同程度上决定了根瘤菌的寄主范围 ,
即一种植物只能被一种根瘤菌或一种根瘤菌的几个
菌株感染结瘤 ,而不能被其它菌株感染 ,所以根瘤菌
的生态分布相应于寄主的生态分布.
通过对菌落形态 、生理生化特性的测定 ,以及聚
类图分析可得出 ,菌株 GA 26聚为不含对照标准菌
株 S inorhizbium melilo tii 、S inorhizbium fred ii 、
S inorhizbium med icar 的新表观群 ,说明该表观群
可能是一类新的根瘤菌种群.GA26 与大多数菌株
的遗传距离较大 ,并且它的理化指标中石蕊牛奶测
定变碱并有血清层 ,在过氧化氢酶的试验中未产生
气泡;在硝酸盐还原反应中 ,GA26 不能使硝酸盐还
原;与对照标准菌株的差异较大 ,对其分类地位的最
终确定 ,尚需进一步测定.
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(责任编辑　许　涛)
(上接第 72 页)
肥 84.45 kg.因此 ,在无公害菠菜生产上 ,尿素施用
量一定不要超过 506.25 kg ·hm-2 .尤其是在土壤
肥力中等以上的情况下 ,更要低于这一施肥水平.
本试验仅以单一微肥用量与尿素不同用量配合
施用进行研究 ,而微肥的最佳施用量以及与氮肥的
最佳配比有待以后继续研究.
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