全 文 ：果 树 学 报 !#，!（#）$!%&!’
()*+,-. )/ 0+*12 3415,45
杨梅根瘤内生菌超微结构及其固氮酶
结构基因的研究
何新华 ’，! 陈力耕 ’ 胡西琴 ’ 张建业 ’
（’浙江大学园艺系，浙江杭州 #’!6；!广西大学园艺系，广西南宁 7#8）
摘 要 用透射电镜首次观察到杨梅根瘤内生菌泡囊结构存在两种类型，有隔或无隔，椭圆形，直径 ’9# !:。并
首次从杨梅根瘤共生固氮的内生菌中通过 ;<= 反应克隆了 ! %>7 ?@ 的固氮酶结构基因，包括 !#A 和 !#B 全长基因
及 !#C 基因片段，对其 !#A 和 !#B 基因的核苷酸序列分析结果表明，其核苷酸与已报道的 $%&!’&菌株同类基因
的核苷酸的同源性高，达 D6E以上。D%’ ?@ 的 !#A 基因开放阅读框架和 ’ 87D ?@ 的 !#B 基因开放阅读框架的氨基
酸序列与已报道的其他 $%&!’&菌株同类基因的氨基酸序列的同源性分别为 6!E以上和 D6E以上， 特别是起重要
作用的氨基酸残基非常保守。!#A、!#B 及 !#C 基因是连锁在一起的，!#A 和 !#B 及 !#B 和 !#C 之间的间隔序列
分别为 86 ?@ 和 !7 ?@，与已报道的 $%&!’&菌株同类基因之间的间隔序列在长度和同源性上差异较大，因而杨梅
根瘤共生固氮的内生菌与其它属植物根瘤共生固氮内生菌及分离株存在菌株之间的差异。
关键词 杨梅；弗兰克氏菌；超微结构；固氮酶基因
中图分类号：3%%>9% 文献标识码：F 文章编号：’6G66DGH!#IG#G!7G7
!#$% &’ () *+,-.,#/#,) -’$ !#012 3)’) &4 5&$#+-, 6’$&7(%). &4
$%&’( &)*&(
A5 J1,K*-’，!，()*+,&%-+!. /# 0/%.123.2%+，45+6&!7 8!9+%:.;，0&!7<5/2，45+6&!7 =)>>?@ A5!&；?*+,&%.-+!. /# 0/%.123.2%+，B2&!7C 8!9+%:.;，
D&!!!7，B2&!7C E=>>>E A5!&F
89.,-/ RS) T1,OU )/ V5U14.5U S12K U5@2*: )+ S12K)*2 U5@2*:，)V-. 1, UK-@5，-?)*2 ’9# !: 1, O1-:525+ S5+5 O1U4)VW
5+5O /1+U2.Q 1, ,)O*.5 )/ G;%1& %2H%& ?Q RXY9 F ! %>7 ?@ U5N*5,45，1,4.*O1,M 4):@.525 ,*4.5)21O5 U5N*5,45U )/ !#AB M5,5
-,O @-+21-. ,*4.5)21O5 U5N*5,45 )/ !#C /+): ,)O*.-+ 5,O)@KQ25 )/ G;%1& %2H%& S5+5 O525+:1,5O -,O -,-.QZ5O ?Q ;<=，
4.),1,M -,O U5N*5,41,M9 35N*5,45 -,-.QU1U )/ ! %>7 ?@ +5V5-.5O 2S) )@5, +5-O1,M /+-:5U -,O ?5M1,,1,M )/ - 2K1+O 1, 2K5 U-:5
)+15,2-21),， 5-4K )/ 2K5: UK)S5O K1MK O5M+55 )/ U5N*5,45 K):).)MQ S12K !#A， !#B -,O !#C )/ )2K5+ $%&!’& U2+-1,U +5W
U@5421V5.Q9 RK5 O5O*45O -:1,) -41O U5N*5,45 )/ 2K5 !#A [=0，4),U1U21,M )/ D%’ ?@，UK)S5O U5N*5,45 U1:1.-+12Q )/ -?)V5
6!E S12K 2K)U5 )/ )2K5+ $%&!’& U2+-1,U，SK5+5-U 2K-2 )/ !#B [=0，4),U1U21,M )/ ’ 87D ?@，UK)S5O :)+5 2K-, D6E U1:1.-+1W
2Q9 RK5 -:1,) -41O +5U1O*5U，@.-Q1,M 1:@)+2-,2 /*,421),-. +).5U -+5 V5+Q S5.. 4),U5+V5O9 \,25+M5,14 U5N*5,45UH\]3I ?52S55,
!#A -,O !#B -,O ?52S55, !#B -,O !#C S5+5 86 ?@ -,O !7 ?@ +5U@5421V5.Q9 RK5 \]3 ?52S55, !#A -,O !#B )+ ?52S55,
!#B -,O !#C K-U ?1M O1//5+5,45U 1, .5,M2K )+ K):).)MQ S12K 2K)U5 )/ )2K5+ $%&!’& U2+-1,U9RK5 +5U*.2 UK)S5O 2K-2 $%&!’&
U2+-1,U /+): ,)O*.-+ 5,O)@KQ25U )/ G;%1& %2H%& S5+5 O1//5+5,2 /+): 2K)U5 1U).-25O /+): ,)O*.5U )/ )2K5+ -421,)+K1Z-. @.-,2U9
2)% :&,$. G;%1& %2H%&；$%&!’&；^ .2+-U2+*42*+5；!#ABC
据报道 _’，!‘，与弗兰克氏放线菌H$%&!’&I共生结
瘤固氮的非豆科木本双子叶植物有 D 科，!8 属，!
多个种。其中杨梅属的 #7个种中有 !D个种具有共
生固氮能力，杨梅（G;%1& %2H%&）便是我国南方种植
面积较大的非豆科木本固氮植物之一，它不仅是我
国的特产水果，而且是绿化荒山的先锋树种，其共
生固氮效率较高，具有重要的经济价值和生态价值。
国内外对杨梅属植物共生固氮的研究主要集中
在香杨梅（GI 7&3+）、南部杨梅（GI 1+%#+%&）和宾州杨
梅（GI ,+!:;39&!1&），对我国的特产水果杨梅的共生
收稿日期$ !!G6G’ 接受日期$ !!G’!G’%
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目H编号：#!#%!I。
致谢：电镜观察承蒙浙江大学华家池校区电镜室的徐颖、洪健、何黎平、胡东维等同志的协助，特此致谢。
何新华，男，副研究员，在职博士生。
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2003.03.013
图 ! 左：杨梅根瘤内生菌丝，示分隔，#$%&&（’()）；
右：杨梅根瘤泡囊结构，! 示泡囊， 示分隔，#!%*（’()）
+,-. ! /0123 452,67895024: 06;7<2920 =,2> ?0<24@A 1B78
!#$%& #’(#& 67;C:0?D#$%&&@’()AE F,->23 G0?,5:0?@HA =,2>
?0<24@AD ?>7=,6- ,2? ?2BC52CB0D #!%* @’()A
固氮研究不多，日本的 #$%&’($ 等 )*+从杨梅根瘤中分
离出 !#$%&#菌株，中国科学院沈阳应用生态研究
所 ),，-+、中国林业科学院亚热带林业研究所 )./0+、福建
林业科学研究所 )1+和福建亚热带植物研究所 )2+等单
位曾对杨梅根瘤进行过形态结构、菌株分离、固氮
活性等方面的研究，但对杨梅属植物根瘤内生菌共
生固氮的固氮酶结构基因未见报道。固氮酶由铁蛋
白和钼铁蛋白组成，固氮酶结构基因3$&’#456包括
$&’#、$&’4、$&’5 * 个基因，它们分别编码固氮酶的
铁蛋白和钼铁蛋白的 !7亚基及 7亚基),+。我们用电
子显微镜观察杨梅根瘤内生菌的形态结构并分离
克隆了杨梅根瘤内生菌固氮酶结构基因，以期探明
杨梅根瘤内生菌的固氮机理。
8 材料和方法
!.! 主要试材
供试根瘤采自浙江省慈溪市横河镇的荸荠种
杨梅。
主要试剂：9-4:; 连接酶、<=>?79 载体、@7
ABC、DE9A、F:9E、9BG 生物工程制品公司；限制性内切酶等酶类购自
EI&?JKB 公司；4L,MMM 4:; NBIOJI 购自 9B5BPB 公
司；氨苄青霉素3;?<6购自华美生物工程公司，其他
试剂均为国产分析纯试剂。
!.I 根瘤内生菌的超微结构
参照林钧安等)Q+的电子显微技术，用 RSN78,MMS@
透射电镜观察根瘤中内生菌形态。
!.J 根瘤基因组 KLM的提取及 NOF
参照 #HKHJT 等)8M+的 >9;U 法并作稍微改进，提
取杨梅根瘤基因组 4:;。
根据已报道的相关序列设计两对引物，然后进
行 E>P 反 应 。 第 8 对 引 物 ： 上 游 .V 7
;9A>A>>;A;9>A>>99>9;>AA 7*V， 下 游 .V 7
;>>9>A>;>9>>99>>A;>>>>9>7*V； 第 , 对引
物：上游 .V7A>;>A>>A;A>9A>A>>AA;7*V，下游
.V7 >9>A;;>9A>99>9AA9;A;7*V。E>P反应体系
为 8MWE>P X&I 9BG MY. #L，引物各 . #L，8M ??&C Z L F:9E’ MY. #L，模
板 4:; MY. #L，加 FF#,[至 .M #L。
第 8 对引物的反应条件为：Q-\ * ?$] 预变性；
Q-\ 8 ?$]，.2\ 8 ?$]，1,\ QM ’，*. 个循环，1,延伸 8M ?$]。
除预变性 Q.\ . ?$] 和退火温度 02\ -M ’ 外，
第 ,对引物与第 8对引物的反应条件基本相同。
!.P 目的 KLM片段重组入质粒载体
参照 B?^I&&O 等 )88+分子克隆第 , 版的方法获
得重组质粒。
!.% 测序与分析
委托上海晶泰生物技术有限公司和上海申友生
物技术有限公司测序，并用 UCB’T 和 >CH’TBC _
（8Y2,）软件分析测序结果。
, 结果与分析
I.! 根瘤内生菌的超微结构
杨梅成熟根瘤通过超薄切片， 透射电镜观察，
可观察到菌丝和泡囊结构。菌丝直径 MY0/8Y8 #?，
有隔，菌丝粗细不匀；泡囊椭圆形，有隔或无隔，直
径 8Y*/*YM #?（图 8）。
I.I NOF产物的获得和克隆
以荸荠种杨梅根瘤基因组 4:; 为模板， 用所
设计的两对引物分别进行 E>P 扩增，扩增产物在
8‘琼脂糖凝胶上电泳，分别获得 8 条 8 M.0 ^< 和
, M,2 ^< 的特异条带， 从胶上割取目的条带， 用
aD; GH$bO 胶回收试剂盒回收 4:;。取适量纯化的
E>P 产物与 <=>?79 载体在 9-74:; 连接酶的催
化下 8,/80\连接过夜。连接产物转化大肠杆菌
9A8 菌株感受态细胞， 通过蓝白斑筛选、 E>P 验
证、质粒长度对比和酶切鉴定，获得两 个重组质粒
株的相关序列比对，同源性在 QM‘以上，证实所得
两个克隆为所需的目的基因3图 ,6。
I.J )$*QK*基因序列与结构分析
将两个序列通过拼接，获得了 $&’#、$&’4基因的
完整序列、$&’5基因的部分序列及 $&’#7$&’4 的 DA
和 $&’47$&’5的 DA序列，全长 , 01. ^<（图 *）。
何新华等：杨梅根瘤内生菌超微结构及其固氮酶结构基因的研究* 期 ,M1
果 树 学 报 ! 卷
菌株或菌种
#$%&’() *% )+,-’,)
.,(/&(0
1--,))’*( 2*3
!#$ !#%
($ && ($ &&
&’(!)( )+3 1%45
&’(!)( )+3 1%45
&’(!)( )+3 6&78
&’(!)( )+3 9:4;8
*+,-,.(/-0’ 1!02(!3
*+,-,.(/-0’ /4’,,/,//56
7’(38’4+,.56 9(:,!/56
;20.<022( :!056,!(0
<=85==
>?@A
B?55A5
B?55A!
C!?AD
>?8@?A
165!!8!
>8555
ED
ED
E5
E8
@D
@@
AD
@!
EE
EE
E?
E!
@A
@A
@!
@?
ED
E=
E5
DE
@8
?=
A@
AA
EE
DE
E?
DE
A?
58
A?
A=
表 ! !#和 !## 基因的核苷酸序列
及氨基酸序列的同源性
$%&’( ! )*+’(,-./( %0/ %1.0, %+./ 2,1,’,3.(4
,5 !# %0/ !## 3(0(4
图 6 789 产物、重组质粒、质粒酶切产物凝胶电泳
1：泳道 8 为 F21 C&%0,% ，!、5、=、? 分别为 G7H产物、重组质粒、
GB78E、酶切重组质粒 +C%+I。图 / 和 7 为第 ! 对引物扩增及重组产
物结果的电泳图，泳道 A、8 为 F21 C&%0,%，@、D、E、88 分别为重组
质粒、酶切重组质粒 +C%+J、GB78E、G7H产物
:.3; 6 <3%=,4( (’(+-=,>2,=(-,3=%>2 ,5 789 >=,/*+-4，
=(+,1.&%0- >’%41./，=(+,1&.0%0- >’%41./4 /.3(4-(/ &?
@+,9 A %0/ B%1A
<&(, 8K88L F+M&)P’J，GB78E +M&)P’J，J’Q,)$,J +%*J:-$ *N %,-*PR’(&($ +M&)P’J
+C%+I，F21 M&JJ,% P’S，+C%+J +M&)P’J，J’Q,)$,J +%*J:-$ *N
%,-*PR’(&($ +M&)P’J +C%+J，GB78E +M&)P’J，F+%*J:-$) *N !#F;
!3538 !#OF; 核苷酸序列 图 5 显示杨梅根瘤未分
离培养内生菌固氮酶结构基因的两个开放阅读框
架的完整核苷酸序列和推测的氨基酸序列及第 5
个开放阅读框架开始部分的核苷酸序列和推测的
氨基酸序列。第 8 个开放阅读框架 （!#O 基因）由
DA8 R+ 组成，与其它 &’(!)(菌株 !#O基因的核苷
酸序列同源性为 E8TKEDT，与其它非 &’(!)(菌属
的固氮生物的核苷酸同源性为 ADTK@DTU表 8V。
第 !个开放阅读框架（!#F基因）由 8 =?D R+ 组
成，与其它 &’(!)(菌株 !#F 基因的核苷酸序列同
源性为 DETKEDT，与其它非 &’(!)(菌属的固氮生
物的核苷酸同源性为 ?=TK@8TU表 8V。
!#;基因片段长 EA R+。 !#O和 !#F、 !#F 和
!#;之间的基因间序列（4.#）分别为 =E R+和 !? R+，
存在可能的核糖体结合位点 ..1..序列U图 5V。
!353! 2’NO（固分子氮酶还原酶）和 2’NF（固分子氮
酶 !W亚基）的氨基酸序列 !#O 和 !#F 基因分别
编码 !D@和 =DA个氨基酸。!#O基因推测的氨基酸
序列与其它 &’(!)(菌株 !#O基因的氨基酸序列同
源性为 E!TKEET，与其它非 &’(!)(菌属的固氮生
物的氨基酸同源性为 @?T左右； 而 !#F 基因推测
的氨基酸与其它 &’(!)(菌株 !#F 基因的氨基酸序
列同源性为 DETKEET，与其它非 &’(!)(菌属的固
氮生物的氨基酸同源性为 58TKA?T（表 8）。
从图 5 氨基酸序列组成可以看出，起重要功能
作用的氨基酸残基非常保守。在 2’NO 和 2’NF 中，
连接 X6,W#Y 族的 ? 个半胱氨酸残基相当保守。在
2’NO的 2W端，有 88 个氨基酸残基，酪氨酸W甘氨
酸W赖氨酸W甘氨酸W甘氨酸W异亮氨酸W甘氨酸W赖
氨酸W丝氨酸W苏氨酸W苏氨酸，它们是典型的结合
1ZG 的基序结构X8!Y；在第 5 个半胱氨酸残基附近的
第 EE位有一个精氨酸残基，它是 1FGW核糖体位点
X85Y。在 2’NO中不含色氨酸，酸性氨基酸高于碱性氨
基酸。
在 2’NF 中，存在保守的氨基酸残基，组氨酸W
甘氨酸W>W>W甘氨酸W半胱氨酸（第 D? 位的组氨酸
到第 E位的半胱氨酸），它们是亚基间铁钼辅因子
的结合位点X8=Y。
通过分析，从杨梅根瘤中分离克隆的 !#O 和
!#F基因分别行使固分子氮酶还原酶（铁蛋白）和固
分子氮酶 !W亚基（钼铁蛋白 !W亚基）的功能。
!3535 !#O 和 !#F 基因的密码子分析 分析 !#O
和 !#F 基因的密码子，显示与其它 &’(!)(菌相同
的模式，编码精氨酸和亮氨酸残基的第 8个密码子
为 7，几乎所有的氨基酸的第 5个密码子为 .或 7X8Y。
在 !#O 和 !#F 基因的开放阅读框架中，X.[7YT分
别为 A=3DT和 A?3!T。
5 讨 论
透射电镜观察杨梅根瘤内生菌的菌丝宽 3AK
838 P，泡囊直径约 835K53 P，这与王慧英等 XEY
报道的杨梅根瘤内生菌的菌丝宽 3?K3@ P，泡囊
!D
! 期
!#
#$%&%&&#%#$&%&&$$&$#&%%&##%%%$%%$#$$%%&##%$&&#&&#&&&#%&#%##& ’(
) * + , # - . % / % % , % / 0 $ $ + + 1
#&&#$%%&%%&&#$%%&&%#%#$%%%&&#%&%%%$&#$%#$&%$&%%%$%$%#&&&%##% 23(
$ ) # # ) # 4 ) % + * 5 ) , 5 % & 6 7 /
%&$%#&$&&#&&&%&&$%#$&&$%&#&$&%##%%&%&#%#&&$&&%$&#$&&#%&$&%&& 28(
# 6 0 $ * 9 , 9 0 / # + $ 0 5 , + 9 #
%&&%#%##%%%$$&%%$&%#%%#&&$%%#%&$&%#&%#%%$%&$&%$&%#%%%&&#%$%% 3:(
# 4 / % 0 5 4 6 9 4 9 6 4 5 9 5 4 % + ;
%%&#$&##%$%&%$&%#%$&&%%$%%&&&%%#%&&%%%$%$%%%&$%&%&&%%&&%$%%& !((
% , / & 5 4 0 % % 7 4 7 % 5 % & # % * %
%$&#$&#&&$&&#$&#&&$#&&$%%#%%#%%&&%%&%&%$#&%#%%#&&$&%#&$$&%$& !’(
5 , $ 0 , $ . 9 4 4 # % # . 4 6 9 6 - 5
#&&$#&%#&%$&&$&%%$%#&%$$%$%$%$%%$%%%$$&%&%#$%&&%#$&&%&&#%%%& :3(
$ . 6 5 9 % 6 5 5 & % % - # ) 7 , * + %
##%%&%&#%%#%#$&$#&#$&%$&#&&$&&%%&%#%#$%#$%%&%#$%$#&%&%%&%##& :8(
/ # + 4 , . , 5 $ 0 % 4 ) ) # ) . # # 1
##&#$&%&&&%#%%&#$&&$%##%$#&%&%&#&$&&%%&%%$%$&&%%&$&%%&%%%&$& <:(
1 , # * % , 9 / . # 0 % % 5 * 9 % % 9
#$&$%&##&#%&&%&##%#&&%#&&%&%#%%#&%#%&$%#$&#$%%#%&$&%&&&%&&%& ’((
, & 1 0 * / $ 6 * 4 6 4 9 , ) 4 9 # * *
&$&##&#&&&#%#$%#$&&#&$$&#$&&&%&%$##&##&%$&%$%&#%&#&%&&%#%&$% ’’(
9 1 $ + ) , - , 7 * 1 1 5 5 + # 4 9
&%&&%%#$%#&%%$&#$&%#%$#&%#&&&%##%##&#%&&#%%&&%#&%#%$#&&%&&#% =3(
* * ) $ 5 , 4 . 6 7 / 1 0 + # 6 4 . * +
&$%%&&##&##%#$&%$&##&##&%#&#$%##%#&%#$&&&%#&&&&%#$&#&%#$%%#& =8(
9 # 1 / , 5 1 1 6 ) / $ , 7 $ 7 , $ ) 6
%#%&$&%#%%#%&$&&$&#$&%#&$$&%%%#$&#$%%&%&#%%#%%#&%#%#%&%$%#$& 8:(
4 9 4 4 9 9 , 6 - % , ) # + 4 6 4 0 5 ,
%%&##%%&&%&&%&#%$&%&&$%#&%#$&&&#&%&&&#&&$%&#&&%#&#&&%$&%#%%# >((
% / # # # 5 # ?
!#6
$%#%%$&&&%#&&#$%#&%#&%#&#&&%%&#&&&%#%&%%%&&%#%#&&%#%%&%#$%#$ >’(
) $ $ $ 7 # 7 4 * # 4 $ 4 # ) ,
&%&&%#%%$$&$%$&$&#%$#&&&&##%##%%&#%&&##%$$&&%%%&&##%&#&&$&## 2(3(
# 4 5 9 0 + . 7 / / # # / - * # / 9 /
%%&&##&%#&&&&%#%%%%$&%##%%#%$%&%#%%$&##%$&&##&#$&##%$&&&%%&& 2(8(
# 1 6 7 4 % 0 / 4 & 4 5 / 0 1 , / 0 * 7
&%%%%$&#$%#&%#$&&%&%%&$%&%&&$#&%&&%%$$&&##%%%&%$%%$%$%%%%&&& 22:(
% 5 ) $ , * % & # . # % 0 / % 5 5 ; % 7
%%$%##%%#&#$%%$&#&&#$&#%&&#&%%&&&%%$&%%&$%&%%$&#%$#&$&&$%%%& 23((
5 / 6 ) 5 $ , 0 % 7 5 % & % + . 0 ; #
%#&&&%%&%&##&$#&%&&&#&%%$&#&&$$%%&%$&%#&##&$$&#&%%&%#$%&#%#$ 23’(
$ * * 1 . # % 9 % 5 6 1 - $ # ) + ,
&#&%#&%%#&$$&&#%%#%##%%#&#$&%$&$$&%%&%%$%#&&&&##%&$%%#%&#%%$ 2!3(
$ $ 6 - + 4 / 6 , 5 - % % 6 7 / 9 4 + 5
&$%&%#&%#%#$&%$&%#%$$%$$&&&%&$%%&&##%%%&#$&$&%%$%&#%$&&%#%$% 2!8(
& 6 4 , 5 4 9 - 7 9 # / % , 0 5 + 0 4 &
&&&%#$&%%$&$%#$&%%%%#&%#&#$&%#%%&%%$&%&&##%##%$&&%&&##%##%&$ 2::(
7 , % 9 , % 6 6 , 4 # 5 # / / 0 # / / 9
&%#&#$&&&%%$&#$&&&%%$&&%&$%$%#%%%&$$&&%$%%&%$&#%&&#%$&%&$%%% 2<((
6 , 7 5 , 7 5 * & 4 % - * % 5 0 + 0 9 %
$&#&&#&#$&%&%##&%#&%&$%$&&%$%#&&#&%$%&$&%%&#&&%%&%%&%#&$&&$$ 2<’(
, # 1 6 # 5 * 6 5 9 % $ % % 6 0 -
&%#%&%%#&&%#&$#&%#&%$&%&%&$%#$&%%$%#&$#&##&#$&%%&%%$%#&%&&$% 2’3(
4 * $ 6 . 6 5 # 9 , % 6 . 1 , % % 6 # ;
%%&&$&&&%%&%&#$&&$&%#%%#%#$%%%&&$%&%%%$&#$&%&&&#%$%%$&&%%&%# 2’8(
# 0 * * , 9 4 4 ) % 9 * 5 , # + ; 0 % 6
&%%&#&%#$&##&%#%#$%%&&$&%#&%&#&&$%$&%##%&$&##&&$%#$&&#&$%&$# 2=:(
% $ , 1 4 ) # 0 $ 9 0 / 9 1 9 , & .
&&%&$&%#$%##&$#&#$&$%&#&&#&&#$%%#%%#%&%&$$&%%&#&$&&&$%%#&&%# 28((
* 0 ) 1 . , & $ $ ) 4 4 * - % $ 7 ; $ 4
%$$&##&$$&$$&%%$&&&#&%##%#$&#$&$&&$&&#$%&%&##%#$&%&&%#%$$&$$ 28’(
- 1 - - % 7 $ / , , 0 0 ) * / , # 4 - -
$%#&%#&%#%#$&##%%&%##%#&&%#%%&%%&%#$&%&&&%%$#&&#%%$%&%&$$&%# 2>3(
6 6 4 , / # / $ 4 # # , # * . + 5 * - 6
&%#%#$&#&&##%%&%$$&&%%&&%&%%&$&%#%%%&##%&%&%$&#$%&$&%&&%$&%% 2>8(
4 , $ / # - * 7 * 9 4 % / * 5 ) 9 # 5 %
$%%&&$%&%&&&&&%%&#&#&&#$&%%&%&%$#&%#%%#&&$&%%&#$%%#%%$&%$&%% 3(:(
% 9 * 7 * $ , % # . 4 6 9 % ) 4 5 5 %
&#&&%%&$#&%#%$$&%&&&#&##%%#&%#&$#&#&&&%%#&&$#&%%&#$%&$&##%%# 32((
$ % . 4 - # / 6 6 . $ * $ . % ) 9 / 4
#%%&#&&%$&&$&$#&%#&%#&&&%#&&%&%$$&%#%&$&%#%%#%$$$%&&##%$$&&$ 32’(
% $ 5 9 . 6 6 7 $ # - 4 9 4 4 - # / - 9
&##%&&%%#&&$%#$%%%$%&%%%&%$&##%%#%##%$#&%$&$$&&#&##%#$%%%&#$ 333(
/ 7 6 9 ) % # % 5 / 4 / . 5 - / ) % ,
&&&&$$&&%%&#%#$%&#&$&&$%%%#&$#&$&&%%%&&&$#&&#&%%&%$&%#&%%&$$ 338(
7 - * + ) 0 ; 6 . 0 % 7 . % 5 6 % -
&%&%%$&$$&%&&&%%%#&#$%%#&#$&%&&#$&##&#%&&&%%&&$%%%#&&$&&$&%# 3!:(
# 5 - # * 6 ) 6 , # , 1 0 7 # ; 6 9 9 4
#%&$&&&$%%$&%##%%&&%%&%#%%$&%&&$%#$&&%&&%&&&$%&%%%&#&&&%%%&# 3:((
# 7 ; 0 / # % 4 5 # ?
&&$%%&%&%##%&%&&&&#%$#%#$%&&&#&$$%&#%$#%&$%#&&#%$#%$$&#$&&#% 3:’(
%$&$%%&&%##&%&#%&&%&&#%&%#&&&&%$%#&&&&%#%#$%%$&%&$%%&%%&$%&& 3<3(
%&%%&#%%&&$&##%&&&&#&&$%%%%#&##%&&&&#&#%%%%#%#%%#%%%#&%$&&%% 3<8(
@AB/
)
$%#&%#&%#&&&&&%#%&#&#&&#%&%&%%$&&&%&$%&%%%$&&$$%#&&#&##&%#&# 3’:(
$ $ $ 7 4 $ 0 # 5 7 9 * 5 9 6 1 6 ,
$&$$&&%&%#&%#%%$&$#&&#%##%&#%$$&%#% 3’=<
- * 6 4 5 . + / + - 4
!
!
图 ! 杨梅根瘤内生菌 !## 全部核苷酸及推测的氨基酸序列和 !#$片段的核苷酸及推测的氨基酸序列
可能的核糖体结合位点、翻译起始密码子C#$%或 %$%D、在功能性 1AB和 1AB6中起重要作用的保守氨基酸残基均用下划线标示
%&’(! )*+,-./. 012-.*/&3. 4.51.02.4 *6 !## 703 ,78/&7- 012-.*/&3. 4.51.02. *6 !#$ 68*+ .03*,9:/. *6 0*31-.
*6$%&’( &)*&( ;&/9 3.312.3 7+&0* 72&3 4.51.02.4
7EFGFAHI JAKLMLNI KA@OA@P MAFIM，FJG@MQGFAL@ A@AFGFAL@ RLOL@C#$% LJ %$%D G@O RL@MIJHIO GNA@L GRAO JIMAOEIM SQGTA@P ANSLJFG@F JLQIM
A@ BE@RFAL@GQ 1AB G@O 1AB6 GJI E@OIJQA@IO
!
何新华等：杨梅根瘤内生菌超微结构及其固氮酶结构基因的研究 3(>
直径约 !#$%& !’，差异较大；而且泡囊的形状也
有差异，我们观察的泡囊有分隔的，也有不分隔的，
而王慧英()*报道杨梅泡囊没有分隔。这些差异是否
与内生菌的发育阶段有关或者是不同杨梅品种有
关，有待进一步研究。
从杨梅根瘤内生菌克隆的 !#+ 和 !#, 基因的
核苷酸和推测的氨基酸序列来看，和已报道的从其
它属植物根瘤中分离的 $%&!’&菌株的 !#+ 和 !#,
基因的核苷酸和推测的氨基酸序列的同源性较高，
基本上在 )-.以上，说明 !#+ 和 !#, 基因比较保
守，特别是起重要作用的氨基酸残基非常保守。但
!#+ 和 !#, 及 !#, 和 !#/ 之间的基因间隔序列差
异较大。如从木麻黄、桤木、胡颓子、沙枣、沙棘根瘤
中分离获得的 $%&!’&菌株 0123、4523、678!9、6:!;
!< 和 +=8!): 的 !#, 和 !#/ 之间的基因间隔序列
的大小分别为 >% ?@、<># ?@、>! ?@、>- ?@ 和 >> ?@
(!#*，而本研究从杨梅根瘤内生菌分离克隆的固氮酶
结构基因的 !#, 和 !#/ 之间的基因间隔序列为
<&# ?@，与上述 #个菌株 !#,;!#/的 2AB的同源性
分别为 3<.、C3.、<-.、<).和 %&.，由此看来，利
用 !#,;!#/的 2AB能区分 $%&!’&菌株。
各种固氮生物之所以能将空气中分子态氮素
在常温常压下固定下来，转化成可供有机体利用的
化合态的氨，都是通过其体内的固氮酶来完成的。
这种生物固氮作用过程是地球上氮素循环的重要
组成部分，它所固定的分子氮量占全部自然界和工
业合成氨量的 >&.左右(<*。因此，探索固氮酶的结构
及其作用机制，始终是生物固氮研究中的热点。阐
明固氮酶的结构基因及其结构，只是第一步，它还
不能说明其机理。固氮酶的反应过程远比其结构复
杂得多，还有许多问题有待深入探讨，如活性调控
和固氮机理等。这些问题的研究和阐明将有助于提
高固氮效率，开辟肥源，而且也为人工模拟固氮酶
的活动， 在温和条件下还原分子氮工业合成氨，以
至于将固氮基因引入其它非豆科植物进行自主固
氮提供理论基础和技术储备。
参 考 文 献
(!* DEFGHF ,=，BIJKEGLE5 MD DIHJHNO H9 $%&!’& GL5:IFG，:1LIFH’O1ELE
GO’?IHFLG H9 :1LFH5PIQ:J @J:FLG(R* SI15H?IHJJ =EK，!--3，#CT<-3$3!-
(<* 洪国藩，宋鸿遇 固氮之光;共生固氮体系中最佳结瘤固氮控制
模型的研究(S*长沙：湖南科技出版社，!--C
(3* +IOHGPI U，B:G:V:W: +，X:L:Q:W: S 2GHJ:LIHF H9 $%&!’& GL5:IFG 95H’
5HHL FHYZJEG H9 ()%*& %+,%&(R* BHIJ B1I [J:FL 8ZL5，!-))，3%\!]：!&C$
!!>
(%* 丁鉴，张忠泽 $%&!’&放线菌与非豆科植物共生固氮的研究(4*
土壤微生物研究 \理论，应用，新方法 ](0* 沈阳：沈阳出版社，
!--3
(#* 吴晓丽，顾小平 杨梅结瘤固氮特性研究 (R* 林业科学研究，
!--%，C（3）：3&>$3!&
(>* 吴晓丽，顾小平不同肥料对杨梅生长和结瘤的影响(R*林业科学
研究，!--3，>（>）：C&C$C!&
(C* 李志真，黄家彬，杨林聪，等杨梅根瘤固氮活性和固氮量的评价
(R*福建林业科技，!--3，<&（!）：3>$3)
()* 王慧英，黄维南 杨梅根瘤的显微和亚显微结构及固氮活性(R*
植物生理学报，!--&，!>（<）：!#3$!#C
(-* 林均安，高锦梁，洪健主编 实用生物电子显微术(S* 沈阳：辽宁
科学技术出版社，!-)-
(!&* +ZNZEL ^，D:LQJI RS，_I’@9E5 R‘，EL :J ,IKE5GILO :FY G@E1I9I1ILO H9
$%&!’& GL5:IFG IF FHYZJEG H9 GO’@:L5I1 ()%*& -&./，0.!+1 !*&!&，
:FY 23/43/%5& *&!&5/!11 YELE5’IFEY ?O %%1 NEFE @HJO’H5@PIG’(R*
4@@J 6FKI5HF SI15H?IHJ，<&&!，>C\#]T < !!>$< !<<
(!!* B:’?5HHV R，‘5ILGP 6‘，S:FI:LIG U6 SHJE1ZJ:5 1JHFIFN; : J:?H5:LH5O
’:FZ:J(S* 8EW XH5V：0HJY B@5IFN +:5?H5 a:?H5:LH5O，!-)-
(!<* =H?GHF =a 2YEFLI9I1:LIHF H9 @HGGI?JE :YEFIFE FZ1JEHLIYE;?IFYIFN
GILEG IF FIL5HNEF:GE ‘E;:FY SH‘E;@5HLEIFG ?O :’IFH :1IY GEbZEF1E
1H’@:5IGHF(R* ‘6DB aELL，!-)%，!C3T3-%$3-)
(!3* [H@E S=，SZ55EJJ B4，aZYYEF [M 0HK:JEFL ’HYI9I1:LIHF H9 LPE
I5HF @5HLEIF H9 FIL5HNEF:GE 95H’ 6375714%..+8 %+,%+8 ?O :YEFHGIFE
YI@PHG@PH5I?HGOJ:LIHF H9 : G@E1I9I1 :5NIFIFE 5EGIYZE(R* [5H1 8:LJ 41:Y
B1I 7B4，!-)#，>(!%* 45FHJY M，=Z’@ 4，/JI@@ M，EL :J 4 8Z1JEHLIYE GEbZEF1E H9 : <%，
<&>;?:GE;@:I5 ,84 95:N’EFL 1:55OIFN LPE EFLI5E FIL5HNEF 9Ic:LIHF
NEFE 1JZGLE5 H9 9./,1/..& 4!/+87!&/ (R* R SHJ DIHJ，!-))，<&3T
C!#$C3)
(!#* PLL@T d d WWWF1?IFJ’FIPNHK d（<&&<;!<;!&）
果 树 学 报 <& 卷