全 文 ：第 33卷　第 2期
2009年 3月
南京林业大学学报(自然科学版)
JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalScienceEdition)
Vol.33, No.2
Mar., 2009
　收稿日期:2007-09-11　　　　修回日期:2008-04-25
　基金项目:国家林业局 “ 948”项目(98-04-07)
　作者简介:许晓岗(1968—),讲师 ,博士 ,研究方向为园林植物资源开发利用。 E-mail:xxg903@sohu.com
　引文格式:许晓岗 ,丁俊刚 ,童丽丽.激素对楸子插穗内源激素含量和可溶性蛋白组成的影响 [ J] .南京林业大学学报:自然科学版 ,
2009, 33(2):60-64.
激素对楸子插穗内源激素含量和可溶性蛋白组成的影响
许晓岗 1 ,丁俊刚2 ,童丽丽 3
(1.南京林业大学森林资源与环境学院 ,江苏南京　 210037;2.南京市红山森林动物园管理处 ,江苏南京　 210028;
3.金陵科技学院园艺系 ,江苏南京　210038)
摘要:为了从分子水平上探究外源激素对楸子(Malusprunifolia)插穗中可溶性蛋白组成和内源激素含量变化的
影响 , 利用 SDS-PAGE电泳技术和酶联免疫吸附分析法 , 研究了楸子插穗切口处的可溶性蛋白质变化和激素变
化与生根的关系。结果表明:分子质量为 83、72、65、 52、43、 39、31、 28、26、 22 ku的可溶性蛋白质等与生根有关。
其中 , 分子质量为 65、39、26、22 ku的蛋白是调控蛋白 , 当根原基分化时存在 , 不定根形成后即消失;分子质量为
52、43、31、28ku的蛋白是伴随不定根产生而新形成的蛋白 , 52ku的蛋白是一种阻碍细胞分化的蛋白 ,对生根不
利 , 其余蛋白可促进楸子插穗的生根。内源激素 ZR在不定根产生过程中始终维持较高水平 , 而空白对照中这
种趋势不明显。 IAA不起主要作用 , 只起协同作用。 GA在根原基分化时期起重要作用并与 28 ku蛋白质合成有
关。经过处理的插穗中 ABA的含量均低于空白对照。说明不同外源激素的处理影响楸子插穗内部激素含量的
变化 , 进而通过调控蛋白质的合成影响蛋白质的种类 、数量以及出现时间的变化。
关键词:楸子;不定根;插穗;可溶性蛋白;内源激素
中图分类号:S718　　　　文献标志码:A　　　　文章编号:1000-2006(2009)02-0060-05
Changesofsolubleproteinsandcontentofendohormoneintheprocessof
strikingrootsofMalusprunifoliaBorkh
XUXiao-gang1 , DINGJun-gang2 , TONGLi-li3
(1.ColegeofForestResourcesandEnvironment, NanjingForestryUniversity, Nanjing210037, China;2.ManagingDepartmentofNanjing
HongshanForestZoo, Nanjing, 210028, China;3.HorticultureSchool, JinlingInstituteofTechnology, Nanjing210038, China)
Abstract:MalusprunifoliaBorkhisakindofnicearborwhichholdsflowerandfruitornamentalmerits, whosemarket
needsincreaseyearbyyear.HowtoclonemasssaplingsofM.prunifoliaisanurgentissueinitsindustry.Foryears,
somerootingtraitsofMalusspp.havebeenexploredatcelllevel, suchascutingsoilmaterial, exogenoushormones,
cutingseasonandotherfactorseffectsontheabilitiesoftakingroots, aswelastheanatomicalcharactersontherooting
ofthecutings.However, thestudiesonchangesofsolubleproteinsintheprocessofstrikingrootofM.prunifoliaare
stilnotreported.Therefore, toexplorethismatterhelpstoestablishtheoreticalbasisforcloningmasssaplingsofM.
prunifolia.ByapplyingthetechniquesofSDS-PAGE＆ELISA, thispaperstudiedandexploredtherelationshipbe-
tweenrootingandthevariancesofbothsolubleproteinsandendogenousplanthormonesintheprocessofstrikingroot
cutingofM.prunifolia.Theresultsshowedthat:duringthecutingprocedure, thesolubleproteinsof83, 72, 65, 52,
43, 39, 31, 28, 26, 22 kuwererelatedtorooting.Thesolubleproteinsin65, 39, 26, 22kuexistedwhentheadventi-
tiousroots′primordiumdiferentiated.Furthermore, theydisappearedwhenthecuttingsgeneratedadventitiousroots.
Whilerootingwasinproceeding, somenewkindsofsolubleproteinslike43, 31, 28 kuthatweregoodforpromoting
newadventitiousrootsgenerated.Itseemedthatanothersolubleprotein52kuinstrikingrootshadsomedisadvantagesto
theadventitiousrootprimordiumdiferentiation.Moreover, intheBtreatment, solubleproteins83ku＆ 72 kuemerged
whichhadsomeadvantagestoboththequantitiesandqualitiesofadventitiousroots.Duringtheprocessofstrikingroot,
endogenousplanthormonesZRunderA＆Btreatmentkeptatahighlevelalthetime, whereasCKwasrelativelylow.
IAAplayedaconcurrentroleotherthanmagistralones.GAplayedanimportantroleinadventitiousroots primordium
diferentiatinganditcorrelatedwiththesynthesisof28 kusolubleprotein.ABAcontentintreatedcuttingswaslower
　第 2期 许晓岗 , 等:激素对楸子插穗内源激素含量和可溶性蛋白组成的影响
thanthatofCK.Amongthem, cutingsunderBtreatmentheldlowestrecord.Theconclusionisthatdifferentexogenous
hormonetreatmentsafectthevariancesofendogenoushormonesofthecuttingsofM.prunifolia.Furthermore, theyalso
influencedthetypes, quantitiesandarisentimeofsolubleproteinsinthecutingsofM.prunifolia.
Keywords:Malusprunifolia;adventitiousroot;cuttings;solubleproteins;endogenoushormones
楸子(MalusprunifoliaBorkh)是蔷薇科苹果属优良的观花及观果的园林植物 ,其苗木需求量逐年增
加 ,如何快速繁殖大量优质苗木已成为楸子苗木生产上亟须解决的关键问题 。多年来 ,人们对海棠类植物
的生根特性进行了一些细胞学水平的研究 ,主要包括外源激素 、扦插基质 、扦插季节等因素对扦插生根能
力的影响 ,以及扦插生根的解剖学过程等方面 [ 1] ,但从分子水平对楸子进行蛋白质组分及含量变化的研
究尚未见报道。笔者对楸子生根过程不同时期插穗中可溶性蛋白质变化进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)[ 2] ,以及扦插生根过程中激素变化的测定实验(ELISA),通过分析比较来研究对生根有影响
的特异蛋白 ,以期为楸子的苗木扦插繁殖提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
实验材料来源于 2005年 4至 5月间取自南京中山植物园实验基地的 3年生楸子的实生苗。每插穗
长 10 ～ 12 cm,保留 3个芽。楸子的插穗分别用不同激素处理后扦插:A处理为 500mg/L的 NAA水溶液;
B处理为 500 mg/L的 NAA+IBA水溶液(两种激素量各一半);C处理为空白对照。 3种处理的时间均为
60 min。在扦插后 ,于不同时期取插穗切口处 5 cm茎段带回实验室作为待用的实验材料。
1.2　插穗切口处可溶性蛋白的提取
取约 0.5 g的插穗切口处组织作为蛋白质样本的提取来源 。制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶 ,进行电泳 、染
色和脱色[ 2] ,电泳结束的凝胶用 UVP凝胶成像系统 GDS7600(GelDocumentationSystem)进行照相 [ 3] 。
1.3　内源激素和可溶性蛋白质的测定
内源激素采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定。可溶性蛋白质的测定采用十二烷基磺酸钠-聚丙
烯酰胺凝胶电泳(SodiumDodecylSulphate-PolAcrylamideGelElectrophoresis, SDS-PAGE)法 [ 2] 。
所有采集数据均来自同一批次扦插实验的样品 ,实验时间为 2005年 4月 5日至 5月 25日。试验结
果应用 SAS(6.12)软件进行观测数据分析 ,分析方法为重复的单因素方差分析法[ 3-7] 。对于各组试验数
据显著的数据用 Duncan测验进行多重比较并用成组数据 t测验进行分析。
2　结果与分析
2.1　楸子插穗生根过程中外部形态变化
4月 13日 , 3种处理下绝大部分插穗切口处没有产生愈伤组织 ,被药剂处理过的部分呈黑色。只有 B处
理的少数插穗切面上髓的部位出现了少量的愈伤组织突起 ,呈晶莹透明状。 4月 20日 ,观察到 B处理大部分
切口以上 1 ～ 2cm区段部位的插穗产生肿胀和一些白色突起 ,而其他两种处理很少。 4月 27日 , B处理中有
一些插穗切口以上的皮部突起或皮孔已伸出明显的不定根尖。另外两种还没有生根迹象。此外 ,在这段时
间还观察到 3种处理插穗切口处木质部绝大部分有不同程度的腐烂 。至 5月 4日 B处理的插穗不定根从皮
孔处突出并已形成明显的根系 , A处理已伸出明显的不定根尖 ,空白对照中的插穗只产生肿胀和一些白色突
起。同时还发现 3种处理中都有部分插穗没有产生根也无愈伤组织 ,并且多数在切口处有一定程度的腐烂。
5月 11日 B处理的插穗已形成完整的根系 ,这些不定根细长而且生根量大 , A处理生成的根短而粗 ,生根量
少 ,空白对照中有少量插穗切口以上的皮部突起或皮孔已伸出明显的不定根尖。 3种处理下插穗所产生不定
根的发根部位多数在离插穗茎基部 1 ～ 2cm之内 ,部分高位不定根在腋芽下 0.5cm处发生 ,具有高位不定根
的插穗基部腐烂较为严重。一些插穗腐烂受害较轻 、发展较慢 ,腐烂以上部分仍能生根成活。
2.2　楸子插穗生根过程中 4种内源激素的变化
经过两种不同处理后 ,楸子扦插生根率结果中 A处理为 80.91%, B处理为 97.98%,空白对照为
21.01%, B处理在生根率和生根数量上总是比 A处理和空白对照要高 。
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 33卷
2.2.1　细胞分裂素 (ZR)的变化
ZR对细胞的扩大生长起重要作用。插穗从母体脱离的初始阶段 ,由于 ZR的供应路线被切断 ,插穗
切口处组织细胞的脱分化 , ZR的消耗利用正常进行 ,因此其含量逐渐下降(图 1A)。当扦插一段时间后 ,
插穗自身启动了 ZR的合成 , ZR含量随着扦插时间的推移而不断增加 。比较楸子不同处理后 ZR的含量
变化可见 ,生根率高的 B处理中的 ZR含量在不定根产生过程中始终维持在相对较高的水平 ,在空白对照
中这种趋势不明显。 ZR在促进生根 、提高扦插生根率方面起主要作用。
图 1　插穗生根过程中 4种内源激素含量的变化
Fig.1　Thevarianceoffourkindsendogenousplanthormones(ZR, IAA, GA, ABA)contentincuttingsoftheroot
takingprocess
横坐标数字代表的时间为:1.4月 6日;2.4月 13日;3.4月 20日;4.4月 27日;5.5月 4日;6.5月 11日;7.5月 18日
2.2.2　吲哚乙酸(IAA)的变化
B处理下楸子生根率高的插穗刚从母树上取下时 IAA的含量最低 ,而生根率相对低的 A处理在扦插
初期 IAA含量却较高 ,对照中具有同样的趋势但各时间段 IAA含量相对略低一些(图 1B)。IAA在 3种
处理后插穗生根过程中的含量及其变化规律与激素 ABA大致相同。 IAA是生长促进物质 ,在楸子扦插生
根过程中的含量变化规律与抑制物质 ABA相同 ,未表现出对插穗生根的决定作用[ 4] ,说明 IAA在楸子插
穗生根时不起主要作用 ,只是协同作用。
2.2.3　赤霉素(GA)的变化
插穗刚脱离母树后 ,对照插穗中的激素 GA的含量没有大的变化(图 1C)。从扦插后大约第 7 ～ 28天 , B
处理下插穗中 GA的含量不断升高 ,相比而言 , A处理下 GA含量的增加相对缓慢。从扦插第 14 ～ 35天 , B处
理下楸子插穗中的 GA含量比 A处理下高出许多 ,而此时正是根原基形成并分化的时间。由此可知 ,在根原
基分化的时期 , GA起很重要的作用[ 5] 。
2.2.4　脱落酸(ABA)的变化
B处理中 , ABA在楸子插穗的初始含量以及后来生根过程中的含量均保持在相对较低的水平 。A处
理下插穗的 ABA含量相对较高 ,空白对照中的含量除起始略高于 A处理外 ,其余各时间点均为最高 。插
穗中 ABA含量决定着愈伤组织或不定根原基的形成 ,影响着插穗的生根率 [ 6] 。
2.3　插穗生根过程中可溶性蛋白的变化
楸子插穗生根过程中可溶性蛋白的 SDS-PAGE图谱如图 2。由图 2可知 ,随着时间推移 , A处理的插穗
切口处出现了 65、52、43、39、31、28、26、22 ku8种可溶性蛋白[ 7] , B处理的楸子插穗切口处出现了 83、72、65、
52、43、39、31、28、26、22ku10种可溶性蛋白 ,空白对照中只出现了 65、39、26、22ku这 4种可溶性蛋白 。
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　第 2期 许晓岗 , 等:激素对楸子插穗内源激素含量和可溶性蛋白组成的影响
3种处理后的插穗切口中 , 65、39、26、22ku蛋白的变化相似 ,在 4月 6日 、4月 13日的含量都较高 ,到
了 4月 20日后含量急剧下降 ,且一直保持在较低的水平 。这 4种蛋白含量的下降可能与细胞的脱分化和
再分化及根原基的产生有关 [ 8] 。插穗生根过程中新合成的 28ku蛋白在 4月 13日出现(图 2B),而 GA含
量在 4月 27日开始急剧增加。这两种物质对生根都起促进作用 ,由此推得 28ku蛋白可能与合成 GA的
过程有关[ 9] 。 28 ku蛋白产生后影响 GA合成量增加 ,调节了根原基的分化。
图 2　不同处理楸子插穗生根过程可溶性蛋白的 SDS-PAGE图谱
Fig.2　TheSDS-PAGEofsolubleproteininrootingprocessofMalusprolifolia
条带上方数字所代表的时间为:1.4月 6日;2.4月 13日;3.4月 20日;4.4月 27日;5.5月 4日;6.5月 11日;7.5月 18日;M.marker
为了更准确地分析楸子插穗中可溶性蛋白在生根过程中的作用 ,将 3种不同的处理结果进行比较发
现:B处理的楸子插穗无论是生根率还是生根数量和质量都较高。不定根分化过程中 , SDS-PAGE结果显
示空白对照的插穗中可溶性蛋白的种类最少 , A、B处理下新产生的蛋白质较多 。
外源激素处理下 , 28、31、43、52 ku蛋白亚基在两种处理中均是新生成的 ,这两种处理下插穗中 31、
43 ku蛋白亚基均在 4月 13日左右开始出现 ,持续到生根结束都存在 。从 4月 13日到 4月 20日左右是产
生不定根原始体的时期[ 10] ,需要合成新的功能蛋白 ,该时期新生成的这两种蛋白与该过程呈明显的一致
性关系 。而 52ku蛋白亚基在 5月 11日左右才开始产生 ,此时正是不定根伸长生长和新的不定根停止发
生的时期 , 52ku蛋白与根系的伸长生长及不定根产生的 “终点 ”有关 。相比之下在空白对照中这些蛋白
均未出现 ,这可能也是对照生根困难的原因之一。可见 ,控制分化出不定根原始体的基因在扦插初期就开
始启动 ,产生相应的功能蛋白和停止或降低一些蛋白的合成 [ 11] 。
与 A处理相比 , B处理的插穗中还出现了 72、83 ku两种新的蛋白质 ,这两种新形成的蛋白均在 4月
20日左右出现并持续到 5月 18日。 B处理后插穗长出的根系在形态 、生长速率及生根的数量方面与 A
处理的结果差别很大 ,即 B处理产生根的数量和性状要大大超过 A处理所生的根 ,而空白对照中产生的
根的数量就更少 ,这些差异可能是由于 B处理中的 IBA诱发了产生不定根的形态及数量相关蛋白质性状
所致[ 12-13] 。这与实际观察到的结果相一致:处理 A的插穗生根相对较粗壮而短 ,数量也相对较少 ,颜色
呈白色;处理 B的插穗生根粗细都有 ,而且较长 ,数量也较多 ,颜色相对较暗(图 3)。这种现象可能与这两
种蛋白有着密切的关系。
图 3　楸子插穗生根外部形态特征
Fig.3　ThemorphologiccharacterofcutingsrootingofMalusprunifolia
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3　讨　论
分析不同处理后楸子插穗生根过程中的内源激素和可溶性蛋白质的变化可知 ,与生根可能有关的可
溶性蛋白是 83、72、65、52、43、39、31、28、26、22 ku的蛋白。
通过分析楸子插穗切口的内源激素和可溶性蛋白质发现 ,楸子插穗的激素变化趋势基本一致 ,但外源
激素对内部遗传物质的诱导作用却大不相同 [ 14] ,这一点可以从空白对照中看出 。内外源激素的变化对楸
子插穗内部蛋白质种类和含量以及蛋白质产生的时间或速度有一定影响。
虽然 SDS-PAGE对一定分子质量范围内的可溶性蛋白质有很高的分辨率 ,但要确切地找出与生根有
关的蛋白质还应进行双向 SDS-PAGE来验证 [ 15] 。
植物的内源激素作为生长发育的调节物质 ,通过影响蛋白质的合成从而影响了蛋白质种类 、数量 、出
现时间的变化[ 16] 。该研究中所分析的几种激素与几种可溶性蛋白的关系 ,应进一步进行探讨 。
[ 　参　考　文　献　]
[ 1 ] 许晓岗.楸子 、垂丝海棠扦插生根机理研究 [ D].南京:南京林业大学 , 2006.
[ 2 ] 陈建爱,王为名 ,陈未京 ,等.木霉可溶性蛋白电泳分析 [ J] .中国生物防治 , 1999, 15(2):77-80.
[ 3 ] 王可玢.从凝胶电泳上洗脱收集叶绿素蛋白质复合体的再电泳 [ J] .植物学通报 , 1991, 8(4):56-57.
[ 4 ] TournaireC.AthiolproteaseandanAnionicperoxidaseareinducedbyloweringcytokininsduringcalusgrowthinPetunia[ J] .PlantPhysiol,
1996, Ⅲ :159-168.
[ 5 ] LIJunhua, XUYunyuan, CHONGKang.AnalysisoftransgenictobaccowithoverexpressionofArabidopsisWUCHELgene[ J] .植物学报 ,
2004, 46(2):224-229.
[ 6 ] 江　玲 ,周　燮.外源生长素和细胞分裂素对莴苣幼苗侧根原基发生和内源激素含量的影响 [ J] .南京农业大学学报 , 2000, 23(1):19
-23.
[ 7 ] 宋葆华,李法曾 ,贺新强 ,等.107种植物叶蛋白产量及其蛋白质含量比较 [ J] .植物资源与环境, 1999, 8(4):52-54.
[ 8 ] SeravitzDM.Thediferentialexpressionofwound-induciblelipoxygenasegenesinsoybeanleaves[ J] .PlantPhysiol, 1996, 110:287-299.
[ 9 ] TaipalensunJ.Awoundandmethy1jasmotate-inducibletranscripcodingforamyrosinase-associatedproteinwithsimilaritiestoanearlynodulin[ J].
PlantPhysiol, 1996, 110:483-491.
[ 10] 许晓岗 ,汤庚国 ,童丽丽.海棠果插穗扦插生根过程解剖学观察 [ J] .南京林业大学学报:自然科学版 , 2006, 30(4):77-80.
[ 11] VenisMA.Molecularanalysisofauxin-specificsignaltransduction[ J] .PlantGrowthRegul, 1996, 18:1-6.
[ 12] KulaevaON.Cytokininsignalingsystems[ J] .PlantGrowthRegul, 1996, 18:29-37.
[ 13] 冯　亮.G-蛋白与植物细胞信号转导[ J] .植物生理学通讯 , 1996, 32(2):215-223.
[ 14] 白吉刚 ,王秀娟 ,尹谦逊 ,等.生长素结合蛋白基因转化黄瓜的研究 [ J] .中国农业科学 , 2004, 37(2):263-267.
[ 15] 李　茵 ,黄上志 ,傅家瑞.不同品种花生种子蛋白质的电泳分析 [ J] .植物学报 , 1998, 40(6):534-541.
[ 16] 谷瑞升 ,刘群录 ,陈雪梅 ,等.木本植物蛋白质提取和 SDS-PAG分析方法的比较和优化 [ J] .植物学报 , 1999, 16(2):171-177.
(责任编辑　郑琰燚)
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