全 文 ：大麻药中两个新异戊烯基黄酮的高速逆流色谱分离制备
彭金咏＊　许丽娜　韩旭　许有威　齐 艳　徐奇玮
(大连医科大学药学院 ,大连 116027)
摘　要　应用高速逆流色谱分离制备大麻药的化学成分 ,以石油醚∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1.2∶1.2∶1, V/V)为
两相溶剂系统 , 上相为固定相 ,下相为流动相 , 流速 2.0 mL/min,主机转速 800 r/min, 分离温度 30℃, 检测波
长 280 nm。以此分离条件经一步洗脱从 400 mg大麻药粗提物中制备得到 95.3mg和 84.5 mg的两个单体化
合物 , 经理化反应和光谱分析分别鉴定为 (2S)-5, 2′, 6′-三羟基-8-异戊烯基-6, 7-(3-异戊烯基-2, 2-二甲基-
1-酮-环己二烯)-二氢黄酮 (1)和 (2S)-5, 2′, 6′-三羟基-8-异戊烯基-6, 7-(3-异戊烯基-2, 2-二甲基吡喃)-
3′, 4′-(2, 2-二甲基-1-酮 -环己二烯)-二氢黄酮 (2)。所得的化合物 1和 2均为新化合物。
关键词　大麻药 , 异戊烯基二氢黄酮 , 高速逆流色谱
　 2007-02-06收稿;2007-04-17接受
＊ E-mail:jinyongpeng2005@163.com
1　引　言
大麻药 [ Dolichostenuicaulis(Baker)Craib]系豆科多年生草本植物 ,分布于我国云南 、四川和广西
等地 ,有活血化瘀 、促进骨细胞再生 、抗肿瘤和抗病毒等作用 [ 1, 2] 。大麻药化学成分的研究尚未见报道。
采用传统的天然产物分离制备方法 ,如硅胶柱色谱法 、聚酰胺层析和制备液相色谱等 ,不仅费时费
力 、污染环境 , 而且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用 。高速逆流色谱(high-speedcounter-curent
chromatography, HSCCC)是一种液液分配色谱技术 [ 3] ,它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分
离方法对样品的不可逆性吸附作用 ,因而样品回收率高 ,同时还具有应用范围广 、仪器操作简单 、分离量
大等优点 ,被广泛应用于天然产物的分离制备中[ 4 ～ 8] 。
本研究采用 D101大孔吸附树脂从大麻药中制备得到粗提物 ,以此粗提物进行高速逆流色谱分离
纯化 ,经一步洗脱分离得到纯度高于 99%的两个单体化合物 ,分别被鉴定为(2S)-5 , 2′, 6′-三羟基 -8-异
戊烯基-6, 7-(3-异戊烯基-2, 2-二甲基-1-酮 -环己二烯)-二氢黄酮 (1)和 (2S)-5, 2′, 6′-三羟基-8-异戊
烯基-6, 7-(3-异戊烯基-2, 2-二甲基吡喃)-3′, 4′-(2, 2-二甲基 -1-酮 -环己二烯)-二氢黄酮 (2)。该分
离纯化方法不仅简便 、快速 、制备量大 ,而且所得化合物 1和 2均为新化合物 。目前 ,还未见 HSCCC用
于大麻药化学成分分离的相关报道。
2　实验部分
2.1　仪器与试剂
TBE-300A高速逆流色谱仪(深圳同田生化技术有限公司);聚四氟乙烯管缠绕在 3个水平轴上形
成螺旋管(管直径 1.6mm,分离体积 260mL), 20mL进样圈。该 HSCCC还配备了柱塞式泵(S系列 ,北
京圣益通技术开发有限公司), 8823B型检测器(北京环宇科技有限公司)和 HX-1050恒温循环器(北京
博医康实验仪器有限公司);高效液相色谱仪(美国 Waters公司),包括 2487检测器 、5215泵 、20 μL定
量圈;所用数据记录和处理系统均为 N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);D101型大孔
吸附树脂(南开大学化工厂)。
大麻药购自云南千草源中药材有限公司 ,经大连医科大学田燕副教授鉴定为 Dolichostenuicaulis
(Baker)Craib的干燥根。石油醚 、乙酸乙酯 、正己烷 、氯仿 、乙醇 、正丁醇 、甲醇及冰乙酸均为分析纯(沈
阳沈联化学试剂公司);高效液相色谱分析用乙腈和甲醇均为色谱纯(美国天地公司);水为自制重蒸馏
第 35卷
2007年 10月　　　 　　　　　　　　
分析化学 (FENXIHUAXUE)　研究报告
ChineseJournalofAnalyticalChemistry 　　　　　 　　　　　　
第 10期
1444 ～ 1448
水 ,并经微孔滤膜过滤 。
2.2　实验方法
2.2.1　样品制备 　将药材适当粉粹 ,称取粗粉 1000 g,加 8000 mL90%乙醇 ,回流提取 2次 , 每次
2.0h。过滤 ,合并滤液 ,减压回收乙醇 ,得浸膏 。取浸膏加适量水混悬后 ,过装有 1000 g预处理过的
D101型大孔吸附树脂的层析柱(80 cm×6.0cmi.d.),静止吸附 1.0 h后 ,依次用水 、60%乙醇和 95%
乙醇洗脱 ,接收 95%乙醇洗脱物 ,减压浓缩至浸膏后真空干燥(60℃),得浅黄色粉末(4.28 g),冰箱保存。
2.2.2　高速逆流色谱制备条件　在分液漏斗中配制石油醚-乙酸乙酯 -乙醇-水(1∶1.2∶1.2∶1, V/V)两相
溶剂系统 ,充分振摇后静止分相。上相为固定相 ,下相为流动相 ,主机转速为 800 r/min,流动相流速
2.0mL/min,分离温度 30℃,检测波长 280 nm,上样量 400mg,用等量上下相(各 8mL)溶解后进样。
2.2.3　高效液相色谱条件　LichrospherC18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)(大连中汇达有限公
司);流动相为 V(乙腈)∶V(水)∶V(冰醋酸)=65∶35∶1,流速 1.0mL/min,检测波长 280nm,柱温为室温 ,
进样量 20 μL。
3　结果与讨论
3.1　样品制备及其 HPLC分析
本研究中采用大孔吸附树脂柱层析对大麻药的乙醇提取物进行粗分 ,不同浓度乙醇梯度洗脱 ,
HPLC跟踪检测。其中水和 60%乙醇洗脱物均未见明显的色谱峰 , 95%乙醇洗脱流分则主要含有两个
分离良好的色谱峰(见图 1),并在 280 nm处有较强的紫外吸收 ,适合于 HSCCC分离制备。
　图 1　大麻药粗提物 HPLC色谱图
Fig.1　HPLCchromatogramofthecrudesample
fromDolichostenuicaulis(Baker)Craib
3.2　高速逆流色谱分离条件选择和纯度检测
在高速逆流色谱中 ,合适的溶剂系统是逆流色谱分离
的关键 。本研究中根据所分离化合物的极性 ,考察了正己
烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶0.5∶0.5∶1、1∶1∶1∶1、1∶1.5∶1.5∶1,
V/V)、氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2, V/V)、石油醚∶乙酸乙酯∶乙醇
∶水(1∶0.6∶0.6∶1、1∶1∶1∶1、1∶1.2∶1.2∶1、1∶1.5∶1.5∶1,
V/V)和乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1∶3, V/V)9种不同溶剂体
系 ,并依据文献 [ 9]计算分配系数和分离度 ,以此来优选最
佳分离溶剂体系 。结果表明 ,溶剂系统正己烷∶乙酸乙酯;
甲醇∶水(1∶0.5∶0.5∶1、1∶1∶1∶1, V/V)、石油醚∶乙酸乙酯∶乙
醇∶水(1∶0.6∶0.6∶1、1∶1∶1∶1, V/V)和乙酸乙酯∶正丁醇∶水
(2∶1∶3, V/V)对化合物 1和 2的分配系数均大于 3;而溶剂系统氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2 , V/V)对化合物 1
和 2的分配系数小于 0.2。虽然溶剂系统正己烷∶乙酸乙酯;甲醇∶水(1∶1.5∶1.5∶1, V/V)对化合物 1和
2有着较为合适的分配系数(K1 =1.34, K2 =1.45),但是两化合物间的分离度则小于 1.5,二者不能达到
完全分离。最终选择石油醚∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1.2∶1.2∶1, V/V)为分离色谱峰 1和 2的两相溶剂体系。
在逆流色谱中 ,影响分离的因素还有分离温度 、主机转速和流动相流速等。其中分离温度能影响固
定相保留率和组分的分配系数 。在考察不同温度(15℃、20℃、25℃、 30℃和 35℃)后 ,分离温度选择
30℃;流动相流速主要影响分离时间长短。本实验中流动相流速设定为 2.0 mL/min;主机转速也能影
响固定相保留率 ,转速高则固定相保留率高 ,但分离管易损坏 ,因此主机转速设定为 800r/min。结果在
此分离条件下固定相保留率为 61%,分离时间少于 6h, HSCCC色谱图见图 2。根据色谱图接收两个流
分 ,即 “Ⅰ ”和 “Ⅱ ”。
制备所得各流分减压挥去溶剂并用甲醇溶解后进行 HPLC分析 ,结果表明 ,所得流分 Ⅰ和 Ⅱ在不同
检测波长下均为单一色谱峰。同时也在不同 TLC条件下对各流分进行分析 ,结果 Ⅰ和 Ⅱ也均为单一斑
点 。表明分离所得流分Ⅰ和Ⅱ均为单体化合物 。
1445第 10期 彭金咏等:大麻药中两个新异戊烯基黄酮的高速逆流色谱分离制备 　　
　图 2　大麻药粗提物高速逆流色谱图
Fig.2　Highspeedcountercurrentchromatogam
(HSCCC)ofthecrudesamplefrom Dolichos
tenuicaulis(Baker)Craib
3.3　化合物 2的结构鉴定
化合物 2(流分 Ⅱ):白色粉末 , mp:187 ～ 189℃,易溶于
甲醇 、氯仿和丙酮 ,不溶于水 。盐酸镁粉反应阳性 ,示为黄
酮类。 ESIMS给出分子量为 583.2 [ M-H] -,其分子式经
HREIMS确定为 C36 H40 O7 (584.2748 [ M] +), 与 FTMS
(584.277404 [ M] +)测定结果一致 。13C和 DEPTNMR显
示 该 化 合 物 含 有 8 个 甲 基 、 3 个 亚 甲 基 、
7个叔碳和 18个季碳 。IR显示结构中有 OH (3414
cm-1), C O(1660 cm-1)和苯环(1608和 1468 cm-1)。
UV显示该化合物在 340、294和 220 nm处有最大吸收。二
氢黄酮的母核结构可从 13CNMR信号 [ δ71.3(C-2), 39.4
(C-3)和 198.1 (C-4)]和 1HNMR信号 [ δ2.47 (dd, J=
17.0, 4.0 Hz, H-3e), 3.91(dd, J=17.0, 14.0 Hz, H-3a)和 5.81 (dd, J=14.0, 4.0Hz, H-2)]得
到证实 。1HNMR谱中 , δ12.27 (1H, brs)为 5-OH信号。从 1HNMR信号 [ δ3.17(2H, d, J=7.0 Hz,
H-21), 5.38(1H, m, H-22), 1.50(3H, s, H-24), 1.64(3H, s, H-25);3.13(2H, d, J=8.0 Hz,
H-11), 5.14(1H, m, H-12), 1.57(3H, s, H-14), 1.42(3H, s, H-15)]和13CNMR信号 [ δ28.2
(C-21), 122.6(C-22), 130.2(C-23), 18.8(C-24), 25.6(C-25);21.5(C-11), 122.8(C-12), 129.8
(C-13), 18.5(C-14), 24.8(C-15)]提示该结构中含有两个异戊烯基的结构片断。也可以推断出该化
合物结构中还含有一个二甲基吡喃环和一个二甲基环己二烯酮环 ,前者可从相关质子信号 [ δ1.35,
1.38(s, each3H, CH3 ×2), 6.15(1H, brs, H-20)]和碳原子信号 [ δ77.6(C-16), 25.8(C-17), 26.4
(C-18), 139.1(C-19), 112.5(C-20), 103.5(C-6)和 159.4(C-7)]推测出来;后者可被相关 1HNMR信
号 [ δ1.41(3H, s, 28-Me), 1.47(3H, s, 29-Me), 6.35(1H, d, J=10.0Hz, H-30), 6.11(1H, d, J=
10.0Hz, H-31)]和13CNMR信号 [ δ199.4(C-26), 45.8(C-27), 21.4(C-28), 23.7(C-29), 131.6
(C-30), 119.3(C-31), 107.5(C-3′)和 138.7(C-4′)]证实。化学位移为 6.78(1H, brs, H-5′)的氢原
子信号为 B环上的一个芳氢信号 ,整个氢谱中未见其它芳氢信号 ,这表明该化合物的 B环为单一未取
代苯环 。以上数据表明化合物 2结构中含有一个二氢黄酮的母核结构 、三个羟基 、两个异戊烯基 、一个
二甲基吡喃环和一个二甲基环己二烯酮环 。在 HMBC谱中 ,可以看出化学位移为 δ12.27的单质子信
号与碳原子 。信号 δ157.1(C-5)相关;一组双质子信号 δ3.13(2H, d, J=8.0 Hz, H-11)与碳原子信
号 [ δ159.4(C-7)和 157.2(C-9)]相关;另一组双质子信号δ3.17(2H, d, J=7.0Hz, H-21)和碳原子
信号 [ δ77.6(C-16)和 112.5(C-20)]相关 ,表明两个异戊烯基分别与 C-8和 C-19相连 。二甲基吡喃环
连接在 C-6和 C-7位上 ,这可从碳氢相关信号 [ δ6.15(H-20)和 C-5、C-6和 C-7(δ157.1、103.5、
159.4)]得到证实。而从 1H– 13C远程相关信号 [ H-5′(δ6.78)和 C-31(δ119.3);H-30(δ6.35)和 C-4′
(δ138.7)、C-31(δ119.3);H-31(δ6.11)和 C-5′(δ104.3)]可以看出二甲基环己二烯酮环与 B环的
C-3′和 C-4′相连 。从 C-2和 C-3位质子间的偶合常数(J2, 3 =14.0 Hz)并结合 NOESY谱中的相关性 ,暗
示这两质子是 a a键相关 ,从而可以表明 H-2是以 a键与 C-2相连 , B环是以 e键与 C-2相连;结合该
化合物负的旋光性特性 , [ α] 25D -200(c.0.80 , CH3OH)和该黄烷类化合物中只有一个手性碳原子
(C-2)的特点 ,并参照文献 [ 10]确定 C-2为 S构型 。综合分析 1HNMR、13CNMR、HMQC、HMBC、NOE-
SY、ESI-MS及 HR-EI-MS等波谱数据 ,确定化合物 2的结构为(2S)-5, 2′, 6′-三羟基 -8-异戊烯基-6, 7-
(3-异戊烯基-2, 2-二甲基吡喃)-3′, 4′-(2, 2-二甲基-1-酮-环己二烯)-二氢黄酮。结构式及主要的 HMBC
和 NOESY关系见图 3。1H和 13CNMR信号归属见表 1。
3.4　化合物 1的结构鉴定
化合物 1(流分 Ⅰ):白色粉末 , mp:195 ～ 197℃,易溶于甲醇 、氯仿和丙酮 ,不溶于水 。盐酸镁粉反
应阳性 ,示为黄酮类 。其分子式经HREIMS确定为C31H34O6 (502.2456, [ M] +),与FTMS(502.235521
1446　　 分 析 化 学 第 35卷
图 3　化合物 1和 2的化学结构式 、HMBC和 NOESY偶合关系
Fig.3　Chemicalstructures, heteronuclearmultiplebondconnectivity(HMBC)andnuclearover-
hauseefectspectroscopy(NOESY)correlationsofcompounds1 and2
表 1　化合物 1和 2的 NMR数据 (500MHz, inDMSO)
Table1　NMRspectradataofcompounds1 and2 (500MHz, indimethylsulfoxide)
原子序号No.
化合物 2碳化学位移δC2
化合物 2氢化学位移δH2
原子序号No.
化合物 1碳化学位移δC1
化合物 1氢化学位移δH1
2 71.3 5.81dd(14.0, 4.0) 2 71.6 5.76dd(13.0, 3.0)
3 39.4 2.47dd(17.0, 4.0) 3 3.91 2.43dd(17.0, 3.0)
3.91dd(17.0, 14.0) 3.87dd(17.0, 13.0)
4 198.1 - 4 198.4 -
5 157.1 12.27brs 5 158.6 12.41brs
6 103.5 - 6 111.8 -
7 159.4 - 7 139.4 -
8 104.6 - 8 125.3 -
9 157.2 - 9 159.6 -
10 102.1 - 10 113.2 -
11 21.5 3.13d(2H, 8.0) 11 25.2 3.18d(2H, 7.0)
12 122.8 5.14m 12 124.2 5.36brs
13 129.8 - 13 131.7 -
14 18.5 1.57s 14 19.4 1.71s
15 24.8 1.42s 15 26.4 1.64s
16 77.6 - 16 199.2 -
17 25.8 1.35s 17 48.5 1.38s
18 26.4 1.38s 18 22.4 1.43s
19 139.1 - 19 24.6 -
20 112.5 6.15brs 20 159.1 0.12brs
21 28.2 3.17d(2H, 7.0) 21 112.4 3.12d(2H, 8.0)
22 122.6 5.38m 22 28.7 5.34brs
23 130.2 - 23 122.1 -
24 18.8 1.50s 24 131.2 1.51s
25 25.6 1.64s 25 18.4 1.68s
26 199.4 - 26 25.2 -
27 45.8 - 1′ 110.4 -
28 21.4 1.41s 2′, 6′ 157.2 6.37d(8.0)
29 23.7 1.47s 3′, 5′ 107.4 6.94t(8.0)
30 131.6 6.35d(10.0) 4′ 129.6
31 119.3 6.11d(10.0)
1′ 114.2
2′ 159.4
3′ 107.5
4′ 138.7 -
5′ 104.3 6.78brs
6′ 160.5
　
[ M] +)测定结果相符。13C和 DEPTNMR显示该化合物含有 6个甲基 、3个亚甲基 、7个叔碳和 15个季
碳 。IR显示结构中有 OH (3432 cm-1), C O(1665 cm-1)和苯环(1618和 1474 cm-1)。 UV显
示该化合物在 338、294和 228nm处有最大吸收 。从 1DNMR和 2DNMR中 ,可以推断出该化合物含有
与化合物 2相同二氢黄酮的母核结构 、两个异戊烯基 、一个二甲基环己二烯酮环 、5位羟基和 C-2的
1447第 10期 彭金咏等:大麻药中两个新异戊烯基黄酮的高速逆流色谱分离制备 　　
S构型 ,并且通过相关谱可以显示两个异戊烯基分别与 C-8和 C-20相连。但在化合物 1的 1HNMR谱
中有 3个明显的芳氢信号 [ δ6.37(d, 2H, J=8.0Hz, H-3′, 5′)和 6.94 (t, 1H, J=8.0 Hz, H-4′)] ,
表明该二氢黄酮的 B环是一个 3、4、5未取代苯环 。同时二甲基环己二烯酮环与 C-6和 C-7相连 ,这与
化合物 2不同 ,并且在化合物 1中也没有二甲基吡喃环的结构片断。综合分析 1HNMR、13CNMR、
HMQC、HMBC、NOESY、ESI-MS及 HR-EI-MS等波谱数据 ,化合物 1被鉴定为(2S)-5, 2′, 6′-三羟基-8-
异戊烯基-6, 7-(3-异戊烯基-2, 2-二甲基 -1-酮 -环己二烯)-二氢黄酮 (1)。结构式及主要的 HMBC和
NOESY关系见图 3, 1H和 13CNMR信号归属见表 1。
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SeparationofTwoNewPrenylatedDihydroflavonoidsfrom
DolichosTenuicaulis(Baker)CraibbyHigh-Speed
Counter-CurrentChromatography
PengJin-Yong＊ , XuLi-Na, HanXu, XuYou-Wei, QiYan, XuQi-Wei
(SchoolofPharmacy, DalianMedicalUniversity, Dalian116027)
Abstract　TheseparationandisolationofchemicalconstituentsfromDolichostenuicaulis(Baker)Craibby
high-speedcounter-currentchromatography(HSCCC)wereachioved.Thesolventsystemcomposedofpetrole-
umether∶ethylacetate∶ethanol∶water(1∶1.2∶1.2∶1, V/V)wasselectedtopurifythecompounds, theupper
phasewasusedasthestationaryphase, thelowerphasewasusedasthemobilephaseataflowrateof
2.0mL/min, andtheapparatuswascontroledat800r/minand30℃, andtheefluentwasmonitoredat280
nm.Undertheoptimizedconditions, twopurecompoundswiththeamountsof95.3 mgand84.5 mgwere
producedfrom400mgcrudesampleonlyinonerun, andthechemicalstructuresofthetargetswereelucidated
as(2S)-5, 2′, 6′-trihydroxy-8-prenyl-6, 7-(3-prenyl-2, 2-dimethyl-1-keone-cyclohexadiene)-flavanone(1)
and(2S)-5 , 2′, 6′-trihydroxy-8-prenyl-6, 7-(3-prenyl-2, 2-dimethylpyrano)-3′, 4′-(2, 2-dime-thyl-1-keone-
cyclohexadiene)-flavanone(2)byphysico-chemicalpropertiesandspectradata.Thissepara-tionmethodwas
simple, andthecompounds1 and2 werenewcompounds.
Keywords　Dolichostenuicaulis(Baker)Craib, prenylateddihydroflavonoid, high-speedcounter-curent
chromatography
(Received6February2007;accepted17 April2007)
1448　　 分 析 化 学 第 35卷