全 文 ：生 物 技 术 2014 年 24(3)
gen production from corn stalk by anaerobic fermentation using response sur-
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业科学，2011，23:97 － 99.
牡丹花多酚提取优化与抗氧化性
朱素英
(菏泽学院生命科学系，山东 菏泽 274015 )
摘要:目的:为探明牡丹花多酚提取的最佳工艺以及多酚的抗氧化性。方法:在单因素的基础上采用响应曲面法的中心组合
设计以牡丹花为材料，并利用 DPPH自由基清除法研究牡丹花多酚的抗氧化性。结果:牡丹花多酚提取的最佳条件为提取温度
70℃，提取时间 44min、乙醇浓度 48. 7%，在此试验条件下多酚实际得率可达 130. 672mgGAE /mL。抗氧化性试验表明牡丹花多酚
的 DPPH自由基清除率大于 BHT，小于 Vc。结论:该最佳提取条件提高牡丹花多酚得率，且多酚具有较强的抗氧化性。
关键词:牡丹花;多酚;响应曲面;DPPH自由基
中图分类号:Q946. 8 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2014． 03． 0069
Optimised Extraction and Antioxidant of Polyphenols from Peony Flowers
ZHU Su － ying
(Department of Life Science，Heze University，Heze 274015，China)
Abstract:Objective:In order to investigate the optimum polyphenols extraction conditions and examine the antioxidant of polyphenols
from peony flowers. Method:Based on the single factor experimental analysis，the central composite design combined with response sur-
face methodology was applied to optimise polyphenols extraction and the DPPH free radical scavenging was used to determine the antioxi-
dant. Ｒesult:The optimal conditions were extraction temperature of 70 ℃，extraction time of 44min and ethanol concentration of 48. 7%
. Under the optimized experimental conditions，the actual yields of polyphenols reached 130. 672 mgGAE /mL. DPPH free radical scaven-
ging were stronger than BHT，weaker than Vc. Conclusion:The optimum extraction conditions can improve the yield of polyphenols from
peony flowers and the polyphenols have strong antioxidant activity.
Key words:Peony flowers;polyphenols;response surface methodology;DPPH free radical
收稿日期:2014 － 02 － 11;修回日期:2014 － 05 － 18
资助项目:菏泽学院植物生物学重点实验室建设项目资助
作者简介:朱素英(1980 －)，女，山东单县人，硕士，讲师，研究方向:
中草药的活性成分提取与利用，Email:zhu_suying@ 126． com。
0 引言
牡丹(Paeonia suffruticosa )具有极高的经济价值，牡丹花
雍容华贵，素有“花中之王”之称，有富贵吉祥的象征，观赏价
值高，牡丹根皮又称“丹皮”为传统中药，有清热、凉血、镇痛和
消瘀等功效［1］，牡丹主产山东菏泽，河南洛阳，尤以菏泽品种
最多，牡丹作为观赏植物花期较短，虽然牡丹花在食品、化妆
品有所应用，但开花期仍造成大量的鲜花浪费，急需对牡丹花
进一步的深加工。
多酚类化合物广泛存在于植物中，含有酚类化合物的不
同群体，包括简单的酚类、酚酸、花青素、羟基肉桂酸衍生物，
黄酮类化合物等［2］。具有较强的抗氧化性、抗衰老活性［3］。
目前，多酚类物质作为天然抗氧化剂，已成为天然化合物的一
个研究热点，已经从多种药用植物［3 － 5］及多种植物花［6 － 7］中
提取，花中含有丰富的花色素苷为多酚中的一种，因此花中多
酚类物质较为丰富，在牡丹花中，郭传琦等［8］研究了浅色系
牡丹花多酚的含量与生物活性，史国安等［9］研究牡丹花不同
发育时期的总多酚含量，但对牡丹花多酚的优化目前仍未见
报道。因此，本研究对牡丹花总多酚进行提取优化，并考察其
清除 DPPH自由基的能力，为牡丹花进一步深加工和再利用
提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料:牡丹花于 4 月下旬，采自山东菏泽牡丹区
百花社区。采回的牡丹花(经菏泽学院植物学实验室鉴定为
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr. )品种“银红巧对”的花，洗净，
滤纸檫干水分，放入真空干燥箱 60℃干燥至恒重，粉碎机粉
碎，备用。
1. 1. 2 试剂与仪器:2，6 －二叔丁基对甲酚(BHT)，国药集团
上海试剂公司;Folin － Ciocalteu 试剂，上海荔达有限公司;二
苯代苦味酰基自由基(DPPH)为美国 Sigma 公司生产;没食
子酸，乙醇等均为分析纯。
1. 1. 3 仪器设备:DZF － 6050 型真空干燥箱，上海博讯实业
公司;FW － 100 型高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器
厂;HH －8 数显恒温水浴锅，江苏省金坛市江南仪器厂;TU －
1810 型 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任
公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 牡丹花总多酚的提取:取已粉碎牡丹花粉末 2g，置于
50mL的锥形瓶中，保鲜膜封口，水浴锅中按照各提取条件对
牡丹花的多酚进行提取、过滤，重复 2 次，合并 3 次提取液，定
容至 30mL，备用。每个实验处理 3 个平行样。
1. 2. 2 牡丹花总多酚含量测定:福林酚法测定多酚含量［10］:
称取没食子酸 0. 01g，溶解转移至 100mL 容量瓶中，定容。分
别取 0mL、0. 2mL、0. 4mL、0. 6 mL、0. 8 mL、1. 0mL、1. 2 mL 至
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10ml容量瓶中，分别依次加入 1mL Folin － Ciocalteu(稀释 10
倍)，4mL 7. 5% Na2CO3 溶液，最后用乙醇溶液定容。暗光处
理 2h，以加入 0mL没食子酸的配制溶液为标准比色溶液，测
定在 765nm下吸光值。绘制以没食子酸为标准品的标准曲
线:y = 0. 7522x － 0. 0001 Ｒ2 = 0. 9886，x 为没食子酸的浓度
(mg /mL)，y为不同浓度的没食子酸的吸光值。
牡丹花多酚含量的测定，不同条件提取的牡丹花 1mL，操
作方法与上述相同。
牡丹花总多酚得率的计算方法:牡丹花多酚测定的吸光
度值，代入没食子酸标准曲线，即得牡丹花总多酚的没食子酸
当量浓度 (mgGAE /mL)，根据下式可计算总多酚的得率:牡丹
花总多酚的得率(mgGAE /g)=(牡丹花总多酚浓度 ×提取液
定容后体积)/牡丹花粉末质量。
1. 2. 3 实验设计:在响应曲面设计之前，先要选择合适的因
素，及其实验范围，因此先要进行单因素实验设计，研究料液
比(10:1 ～ 60:1)、提取温度(10℃ ～90℃)、提取时间(10min ～
90min)、乙醇浓度(10% ～100%)等单因素对牡丹花总多酚提
取的影响。数据用 Excel 2007 作图，SPSS19. 0 进行统计分析。
在单因素实验的基础上，采用 Design Expert 软件以提取
温度(A，℃)、提取时间(B2，min)、乙醇浓度(C，%)作为变量
利用设计三因素三水平中心组合实验方案(CCD)，实验结果
数据用 Design Expert分析。试验设计的因素水平如表 1。
表 1 牡丹花中多酚提取因素与水平表
Table 1 The factors and leves of Central Composite Design for the extrac-
tion of polyphenols from peony flower
因素 Factors 编号 Code
水平 leves
－ α(－1. 682) －1 0 1 + α(+1. 682)
提取温度(℃)
Extraction temperature
A 16 30 50 70 84
提取时间(min)
Extraction time
A 20 30 45 60 70
乙醇浓度(%)
Ethanol concentration
C 21 35 55 75 89
1. 2. 4 抗氧化性测定:取牡丹花干粉 10g，在最佳提取条件进
行浸提，过滤，重复 3 次，合并 3 次提取液，旋转蒸发仪蒸发至
干，得 2. 95g粗提物，将粗提物配置成不同浓度，利用 DPPH清
除率法［4］来测定其抗氧化性:移取不同浓度粗提物 1mL，再加
入 1mL 的 0. 1mmol /L DPPH(溶剂为无水乙醇)，充分摇匀，室
温下反应 40min，517nm测其吸光值，相同浓度的维生素 C 和
BHT作对照，3 个平行样，计算清除率的公式为:
自由基的清除率(%)= ［1 －(As– Ab)/ A c］ × 100
As牡丹花粗提物不同浓度溶液与 DPPH 混合后的吸光
度;Ab样品液不加 DPPH 吸光度;AcDPPH 溶液的空白吸光值
(不加样品液 )。
2 结果与分析
2. 1 单因素对牡丹花多酚得率的影响
2. 1. 1 液料比对牡丹花多酚得率的影响:取 2g 牡丹花干粉，
在不同液料比、温度 50℃、30min条件下以 60%乙醇作为溶剂
提取，不同液料比对每克干粉中多酚的得率影响，结果如图 1，
方差分析显示，液料比 10:1 与后三者之间具有显著性差异(P
＜ 0. 05)，液料比 20:1、30:1、60:1 之间无显著差异。多酚类物
质在水醇混合物中溶解度高［11］，在液料比 20:1，基本已经将
多酚溶解完全，因此后继实验选用 20:1 液料比。
图 1 液料比对牡丹花多酚得率的影响
Figure 1 Effect of the solvent － to － solid ratio on the yield of the total
phenolics from peony flower
2. 1. 2 提取温度对牡丹花多酚得率的影响:取 2g 牡丹花干
粉，以 10℃、30℃、50℃、70℃、90℃作为提取温度，在液料比
20:1、30min，60%乙醇的条件下，研究提取温度对牡丹花多酚
得率的影响，如图 2，温度增加，增大分子的扩散系数，降低黏
度系数，多酚得率增加，50℃达到最大 126. 36 mgGAE /g。90℃
与 70℃差别不大，且略有下降。温度过高导致部分热敏感性
多酚成份破坏［12 － 13］因此提取温度必须低于某一限度，因此选
择 30℃ ～70℃作为响应曲面设计的温度范围。
图 2 提取温度对牡丹花多酚得率的影响
Figure 2 Effect of the extraction temperature on the yield of the total phe-
nolics from peony flower
2. 1. 3 提取时间对牡丹花多酚得率的影响
酚类化合物从植物组织中溶出需要一定的时间，溶出时
间的长短与多酚的得率有关，选取提取时间 15min、30min、
45min、60min、75min，固定条件:液料比 20:1，提取温度 75℃，
60%乙醇，重复 2 次，结果如图 3。
随着提取时间的延长，多酚溶出率增加，45min 时多酚溶
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生 物 技 术 2014 年 24(3)
出得率达到最大(从 20. 37 mgGAE /g到 129. 22 mgGAE /g)，时
间超过 60min，多酚得率不再增加，并稍有下降。说明提取时
间过长，会导致多酚的破坏［14］。因此选 30 ～ 60min 作为多酚
的提取温度范围。
图 3 提取时间对牡丹花多酚得率的影响
Figure 3 Effect of the extraction time on the yield of the total phenolics
from peony flower
2. 1. 4 乙醇浓度对牡丹花多酚得率的影响
水醇混合物常用于酚类化合物的提取［15］，取 2g牡丹花干
粉，以 15%、35%、55%、75%、95%乙醇浓度作为提取条件，在
液料比 20:1，75℃水浴，浸提 60min，重复 2 次，结果如图 4。
图 4 乙醇浓度对牡丹花多酚得率的影响
Figure 4 Effect of the ethanol concentration on the yield of the total
phenolics from peony flower
从图 4 可以看出，随着乙醇浓度从 15%增加到 55%，多酚
得率从 78. 356 mgGAE /g 增加至 129. 75 mgGAE /g 达到最大，
乙醇浓度达到 75%，多酚得率开始下降，95%乙醇时多酚得率
只有 122. 23。当用 95%的乙醇提取多酚时，乙醇浓度高，同时
会有一些脂类物质溶出，影响多酚类物质的提取［16］。因此选
择 35% ～75%的乙醇浓度作为多酚提取的条件。
2. 2 牡丹花多酚的提取优化
牡丹花多酚的提取试验结果如表 2，利用 Design Expert软
件对多酚得率与三个变量之间进行多元回归，得牡丹花多酚
得率(Y)与提取温度(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)二次多
元回归模型方程:
Y = － 157. 48428 + 2. 69333 A + + 6. 39540 B + 2. 33616
C － 0. 026097 AB － 0. 0069AC － 0. 00309 BC － 0. 00878A2 －
0. 050724 B2 － 0. 017633 C2
从该回归方程的方差分析结果，模型 p ＜ 0. 0001，极显著，
失拟项 p = 0. 2581 ＞ 0. 05 不显著;相关系数 Ｒ2 = 0. 9888，矫正
系数 Ｒ2Adj = 0. 9851，接近 1 说明回归拟合度较好。说明该方程
能很好的用于分析和预测牡丹花多酚的提取优化。
表 2 牡丹花多酚提取的中心组合设计与结果
Table 2 Central Composite design and result of the total phenolics extrac-
tion from peony flower
实验序号 A B C 多酚得率(mgGAE /g)
1 1 － 1 1 109. 59
2 0 0 1. 682 110. 214
3 0 0 － 1. 682 111. 553
4 0 0 0 131. 118
5 1 1 － 1 116. 142
6 1 1 1 104. 91
7 0 － 1. 682 0 90. 324
8 0 1. 682 0 106. 782
9 － 1 1 1 114. 426
10 － 1 － 1 － 1 87. 36
11 1 － 1 － 1 120. 198
12 － 1 － 1 0 90. 87
13 1. 682 0 0 130. 104
14 0 0 0 128. 778
15 － 1. 682 0 0 111. 696
16 0 0 0 128. 629
17 － 1 1 － 1 117. 702
18 0 0 0 131. 742
表 3 回归模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance of the regression model
变异来源
Source
平方和
Sum of Squares
自由度
df
均方 Mean
Square
F值
F Value
P值
p － value
显著性
significant
模型 3298. 66 9 366. 52 78. 40 ＜ 0. 0001 ＊＊
A 373. 71 1 373. 71 79. 94 ＜ 0. 0001 ＊＊
B 388. 51 1 388. 51 83. 11 ＜ 0. 0001 ＊＊
C 41. 68 1 41. 68 8. 92 0. 0174 *
AB 490. 38 1 490. 38 104. 90 ＜ 0. 0001 ＊＊
AC 60. 91 1 60. 91 13. 03 0. 0069 ＊＊
BC 6. 86 1 6. 86 1. 47 0. 2602
A2 156. 01 1 156. 01 33. 37 0. 0004 ＊＊
B2 1647. 59 1 1647. 59 352. 45 ＜ 0. 0001 ＊＊
C2 629. 29 1 629. 29 4 134. 62 ＜ 0. 0001 ＊＊
残差
Ｒesidual
37. 40 8 4. 67
失拟项
Lack of Fit
29. 76 5 5. 95 2. 34 0. 2581
净误差
Pure Error
7. 64 3 2. 55
总离差
Cor Total
3336. 06 17 Ｒ2 = 0. 9888 Ｒ2Adj = 0. 9762
注:＊＊ 表示 p ＜ 0. 01水平极显著，* 表示 p ＜ 0. 05水平显著。
Note:“＊＊”，“* ”Marked as significant difference at p ＜ 0. 01 and p ＜ 0. 05.
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2014 年 24(3) 生 物 技 术
图 5 提取温度(A，℃)、提取时间(B，min)、乙醇浓度(C，%)因素之间的交互效应对牡丹花多酚提取的响应曲面
Figure 5 Ｒesponse surface for the interaction effect beween extraction temperature(A，℃)，extraction time(B，min) ，and ethanol concentration(C，%)on
extraction of polyphenols from peony flower
从表 3 统计结果看出，A、B、AB、AC、A2、B2、C2 这些项 p
值均小于 0. 01，说明这些因素对牡丹花多酚的得率影响极显
著;C的 p ＜ 0. 05，说明乙醇浓度对牡丹花多酚的提取影响显
著。提取时间与乙醇浓度之间的交互作用(BC)影响不显著。
剔除不显著项，可以得到更为优化的模型:
Y = － 157. 48428 + 2. 69333A + 6. 39540B + 2. 33616C －
0. 026097AB － 0. 0069AC － 0. 00309 BC － 0. 00878A2 －
0. 050724B2 － 0. 017633 C2
通过 Design Expert软件，在其中一项固定的情况下，分析
两项间的交互作用，绘制响应曲面图与等高线图，最大值出现
在登高线的中心，等高线越扁，交互效应对多酚提取影响越
大，等高线越圆，影响越小［17］。AB 之间的等高线最扁，BC 之
间最圆，说明 AB 之间的交互效应对牡丹花多酚得率影响最
大，BC之间最小。从曲面图可以看出，提取时间对多酚的影
响最为显著，曲线最为陡峭，其次是提取温度，乙醇浓度，影响
均为显著。
优化验证:对多元回归方程进行回归，得到最佳优化条件
为提取温度 69. 69℃、提取时间 43. 45min、乙醇浓度 48. 69%，
多酚得率:132. 703 mgGAE /mL。由于该优化试验条件不在设
计的 18 组实验中，需对实验条件进行优化，为便于操作，实验
条件简化为提取温度 70℃，提取时间 44min、乙醇浓度
48. 7%，重复 3 次，在该条件下，牡丹花多酚的得率为
130. 672mgGAE /mL，占预测值得 98. 47%与预测值接近。说明
该回归模型是合适有效的。
2. 3 牡丹花多酚抗氧化性
表 4 牡丹花多酚提取物对 DPPH自由基清除作用比较
Table 4 DPPH scavenging abilities of polphenols extracts from peony flower
浓度
Concentration(mg·mL － 1)
粗提物
Crude extract(%)
Vc
(%)
BHT
(%)
0. 002 4，77 2. 18 2. 18
0. 01 13. 6 20. 38 7. 72
0. 05 47. 8 56. 7 42. 58
0. 1 61. 8 89. 33 49. 72
0. 5 79. 6 96. 2 62. 74
从表 4 可以看出，牡丹多酚粗提物 DPPH清除率具有浓度
依赖性增长的特性，当浓度达到 0. 5 mg·mL － 1对 DPPH 的清
除率可达 79. 6%，同时以常用抗氧化剂抗坏血酸 Vc 和 BHT
做阳性对照显示，牡丹多酚粗提物的 DPPH 清除率大于 BHT，
小于 VC，说明牡丹花多酚具有较强的抗氧化性。
3 讨论
在不同条件下，牡丹花多酚测的含量相差较大，从
20. 376 达到最大值 130. 672 mgGAE /mL，说明在多酚提取中，
各种提取条件的影响较大，“银红巧对”为红色系牡丹品种，
最佳条件下多酚得率大于浅色系花瓣的多酚含量［8］，花色素
也为多酚中的一种，可能红色系含花色素较多的缘故。另外
也稍大于大于两个红色系牡丹品种，“藏枝红”与“洛阳红”［18］
可能与品种、产地、提取条件没有优化有关。通过响应曲面的
中心组合设计优化，得到最佳优化条件在最佳优化条件下，提
取温度 70℃，提取时间 44min、乙醇浓度 48. 7%，该优化条件
下牡丹花多酚的实际得率可达 130. 672mgGAE /mL，高中心组
合设计的最高值，说明对牡丹花多酚的提取优化的必要性。
亦可看出，牡丹花多酚含量较高，牡丹主要用途为根皮药用，
花用于观赏，但花期较短，多酚类物质提取优化为牡丹花资源
的再利用提供科学依据。
人工合成的抗氧化剂如 2，6 －二叔丁基对甲酚(BHT)、叔
丁基羟基茴香醚(BHA)因其致癌性［19］，人们将目光越来越转
向天然抗氧化剂，多酚类物质为植物的次生代谢物质，是一种
天然的抗氧化剂［20］。牡丹花多酚抗氧化性高于人工合成抗
氧化剂 BHT，小于 Vc，结果与冯志文等［18］研究结果类似，说明
利用牡丹花多酚作为一种天然的安全无毒的抗氧化剂，应用
于食品和化妆品是可行的，牡丹花多酚可作为一种天然抗氧
化剂资源，可提高牡丹的种植的经济附加值。
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酵母中海藻糖提取的响应曲面优化及纯化工艺
张丽杰，王昌科，韩雪，赵天涛*
(重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400054)
摘要:目的:针对现有技术存在的步骤复杂、环境污染和效率不高等问题，探索干酵母中海藻糖的高效提取纯化新工艺。方
法:以提取温度、提取时间和氧化钙浓度为考察因素，以海藻糖浓度为响应值，采用响应曲面法优化海藻糖的干酵母热纯水提取
工艺。以硫酸锌为絮凝基质，以氢氧化钡为 pH 调节剂，考察了硫酸锌浓度对一步法过滤纯化的影响。结果:当提取温度为
78℃、时间为 1. 3 h、氧化钙浓度为 12. 6 g /L 时，得到了海藻糖最大提取浓度为 0. 238 g /g 干酵母。当硫酸锌浓度为 35. 71 g /L
时，蛋白质脱除率达到 99. 1%，溶液电导率减小至 569 us /cm，更有利于后期结晶。结论:整个过滤纯化工艺的海藻糖损失率仅为
7. 7%，远低于传统提取工艺。
关键词:响应曲面;海藻糖;干酵母;絮凝剂
中图分类号:TS201. 2 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2014． 03． 0070
Optimization on Extraction Process of Yeast Trehalose
by Ｒesponse Surface Method and Purification Technology
ZHANG Li － jie，WANG Chang － ke，HAN Xue，ZHAO Tian － tao*
(College of Pharmacy and Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400050，China)
Abstract:Objective:In view of existing in the prior art complex，environmental pollution and low efficiency question，the new extraction
and purification process of trehalose from dry yeast were explored. Method:To study the effects of extraction time，extraction temperature
and calcium oxide concentration on the extraction rate of trehalose，response surface method was used for the optimization of hot pure water
extraction of dry yeast trehalose. Subsequently，to explore the effect of zinc sulfate flocculating agent and barium hydroxide pH regulator on
purification of yeast trehalose. Ｒesult:At the extraction temperature of 78℃，extraction time of 1. 3 h and calcium oxide concentration of
12. 6g /L，the maximum extraction concentration of trehalose was 0. 238g /g dry yeast. The removal rate of protein reached 99. 1% when the
zinc sulfate concentration was 35. 71g /L. In addition，the conductivity of solution cut down 569 us /cm ，much lower than control group and
favor later crystallization. Colclusion:The loss percentage of trehalose was only 7. 7% in whole process，much lower than the traditional
extraction process.
Key words:Ｒesponse surface method (ＲSM);Trehalose;Dry yeast;Flocculating agent
收稿日期:2013 － 11 － 01 修回日期:2014 － 04 － 14
作者简介:张丽杰(1975 －)，女，河北廊坊人，硕士研究生，副教授，
研究方向:生物分离工程和生物反应工程，发表论文 20 多篇。* 通讯
作者:赵天涛(1976 －)，男，河北沧州人，博士，教授，从事生物化工
技术研究，发表论文 40 多篇。
0 引言
海藻糖是一种在医疗卫生、食品加工、化妆品及保健品中
应用广泛的非还原性双糖［1 － 6］，因其非特异性保护生命物质
如大分子蛋白质的功能，享有“生命之糖”的称号［7 － 8］。
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