全 文 ：西北农业学报　2006 , 15(3):69 ～ 74
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
高效苜蓿根瘤菌的筛选*
钟文文1 ,张小平2 , K ristina Linds trom 3
(1.临沂师范学院 ,山东临沂　276001;2.四川农业大学资源环境学院 ,四川雅安 　625014;
3 ,芬兰赫尔辛基大学应用化学与微生物系 ,芬兰赫尔辛基　FIN-00014)
摘　要:旨在利用 celB 基因标记技术从土著根瘤菌中筛选出与盛世苜蓿品种相匹配的有效性高 、竞争性强
的高效苜蓿根瘤菌株。从四川雅安 、重庆北碚 、万州采集野生苜蓿根瘤 , 采用平板划线法分离纯化获得 93 株
纯菌株 ,通过与盛世品种在无氮水培液中进行结瘤试验和有效性分析并结合菌株的地理来源 , 初筛出了与对
照相比有效性较高的 4 株苜蓿根瘤菌 ,分别为 Y6-1-1 、BB1-8-1-1 、BB2-2-1-1和WZ-6-2-2。进一步利用 celB 基
因标记技术对这 4 株菌进行竞争性研究 ,通过供体大肠杆菌 HAMBI2356 与根瘤菌接合的方法成功地将 celB
基因导入 4 个菌株中 , 对标记基因可能会对标记菌株产生的影响进行检测 , 结果表明标记基因在标记菌株内
能稳定传代 ,而且对标记菌株的生长 、竞争性及有效性都没有显著影响 , 从而证明 celB 基因标记技术可以作
为一种简便 、直观而又有效的检测手段用于追踪根瘤菌株在土壤中的竞争性。进一步通过田间试验比较分析
标记菌与土著菌的竞争结瘤能力和固氮有效性 , 结果表明 Y6-1-1 、BB2-2-1-1、WZ-6-2-2 与对照相比在占瘤率 、
瘤重 、总瘤数上差异显著 , 占瘤率都在 72%以上 , 显著提高了植株的干重 、叶绿素含量 、全氮量和产量 , 其中
WZ-6-2-2 的有效性最高 、竞争性最强 ,可以用于苜蓿盛世品种的接种。
关键词:苜蓿;根瘤菌;筛选;celB 基因;竞争性;有效性
中图分类号:S154. 39　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2006)03-0069-06
Selection of Highly Effective Rhizobial Strains for Alfalfa
ZHONG Wen-wen1 , ZHANG Xiao-ping2 and Kristina Lindstrom 3
(1. Linyi Norm al Universi ty , Linyi Shandong　276001 , China;2.C ollege of Resources and En vi ronmen t Science ,
Sichuan Agricul tu ral Universi ty , Yaan S ichu an　625014 China;3. Departmen t of Applied C hemist ry
and Microbiology , University of Helsinki , Helsin ki　Fin-00014 , Finland)
Abstract:The aim of this e xperiment w as to select highly compet itive and ef fective rhizobial st rains
w hich we re compa tible w ith Shengshi alfalfa cul tivar by using marker g ene technique. The nodule s
f rom alfalfa were collected f rom Yaan in Sichuan , and Beibei ,Wanzhou in Chongqing. 93 st rains w ere
isolated and purified. These st rains were then inoculated to on the sheng shi o f alfalfa by po t experi-
ment in Jensen′s N-f ree solut ion. By analy sis o f the result , 4 st rains Y6-1-1 , BB1-8-1-1 , BB2-2-1-1
and WZ-6-2-2 were relatively mo re ef fective. These st rains w ere selected for further study of compet i-
tiveness w ith soil indigenous rhizobia by using celB marker g ene technique. By conjugation wi th Esch-
erichia co li HAMBI2356 which contains the celB gene , the celB gene w ere successfully int roduced into
the four st rains respectively . The stabi li ty and impact of the insert celB gene on the rhizobial st rains
were evaluated by determination of gene ration time , pot inoculation test . The resul ts show ed that the
marke r gene w as highly stable , and had no significant ef fect on the g row th , compet itiveness and sym-
biot ic effectiv eness of the rhizobial st rains. So the celB gene marker technique can be used as a perfect
means to t rack the competi tion o f the rhizobial strains in soil. The selected four st rains w ere further
* 收稿日期:2005-11-23　　修回日期:2006-01-06
基金项目:国家“ 973”项目(2001CB108905);芬兰赫尔辛基大学资助项目。
作者简介:钟文文(1978-),女,硕士 ,讲师 ,研究方向为有益微生物的利用。
assessed fo r their competi tiveness and effectiveness under soil conditions in f ield experiment. The re-
sults showed that three strains Y6-1-1 , BB22-1-1 , WZ6-2-2 among the four significant ly increased the
nodule w eight , to tal nodule numbe r , plant shoo t dry weight , to tal nit rogen content , chlorophy ll con-
tent and yield in comparison w ith the non-inoculation control. Thei r nodule occupancy w as more than
72%. The best strain w as WZ6-2-2 , that could be used as inoculant fo r alfalfa sheng shi cult ivar.
Key words:Rhizobium;Alfalfa;Selection;celB marker gene;Competi tion;Effectiv eness
　　根瘤菌豆科牧草共生体系是生物固氮中最有
效的成员 ,苜蓿作为一种豆科牧草 ,营养价值高 、
适口性好 ,是大面积种植的饲料作物[ 1] 。研究表
明 ,接种根瘤菌可以显著地提高苜蓿的产量 ,增加
土壤肥力[ 2] 。以往对高效根瘤菌的筛选主要以有
效性高作为最为重要甚至唯一的指标[ 3] ,以此筛
选出的所谓高效根瘤菌应用到田间试验中时却发
现有一些并不能充分发挥出其应有的共生固氮潜
能[ 4 , 5] ,原因主要是土壤中存在大量有效性差的
土著根瘤菌 ,人工选育的菌株尽管固氮有效性很
高 ,但如果比土著菌的竞争性弱 ,就不能侵染结
瘤 ,接种效果就不明显 ,可见接种根瘤菌是否有效
很大程度上取决于接种菌株竞争能力的强弱 [ 6] 。
如何对接种根瘤菌的竞争性进行直观检测及跟
踪 ,标记基因技术为解决这个问题提供了有效途
径[ 7] ,其中 celB 基因标记技术在目前根瘤菌竞争
性研究中应用广泛 ,与其他标记技术相比 , celB
标记基因所特有的高度热稳定性使内源酶热变性
后 ,没有背景活性 ,分析进行起来简单快速;另外 ,
用于检测 celB 基因的反应底物价格低廉[ 8 , 9] 。根
瘤菌菌株对品种是有选择性的 ,特别是苜蓿根瘤
菌的寄主专一性尤强 ,因此只有筛选与品种相匹
配的高效菌株进行人工接种 ,才能达到增产的目
的[ 10] 。盛世苜蓿品种是美国近年来选育出的新
品种 ,其适应性强 、喜温暖 、潮湿的气候[ 11] ,比较
适合于西南地区的环境条件 ,已在四川开始推广
种植 ,但目前还没有相匹配的优质根瘤菌剂 ,筛选
与之匹配的高效根瘤菌株用于人工接种 ,对于苜
蓿的高产和优质栽培具有重要意义 。
1　材料与方法
1. 1　材 料
根瘤　采自四川雅安(Y)、重庆北碚(BB)、万
州(WZ)。供试苜蓿品种(盛世)、分离用培养基
(YEMA 刚果红培养基)、水培液(Jensen′s N-f ree
solut ion)、链霉素(50 、75 、100 、150 、175 、200 和
250 μg /mL)、基因标记用培养基(TY培养基 、LB
培养基 、BD 培养基[ 12] )、celB 标记检测试剂
[ (1 000 mL染色缓冲液配方:50 mL 1 mol /L 磷
酸钠缓冲液(pH =7), 2 mL 0. 5 mol /L EDTA ,
10 mL10%Sa rko syl (w /v), 10 mL 10%Triton
X-100 ,5 mL 10%SDS;50 mg /mL X-gal(储存浓
度)] 、供试土壤(四川农业大学农场用地土壤)。
1. 2　方 法
1. 2. 1　分离纯化与鉴定 　分离纯化与鉴定参考
文献[ 13 ]的方法进行。
1. 2. 2　回接试验　以不接种为对照 ,将分离纯
化出的菌株与盛世苜蓿品种做结瘤试验(3个重
复)。以植株结瘤数和干重作为测定根瘤菌的侵
染性和有效性的指标 。
1. 2. 3　基因标记　将苜蓿根瘤菌株在 TY 培养
基中 28℃培养 1 ～ 2 d ,取 1. 5 mL 菌液于离心管
中离心 ,再用 1. 5 mL TY 液洗 2次 ,倾去 TY液 ,
用 0. 75 mL T Y液混匀;将含 celB 基因质粒的大
肠杆菌 HAMBI2365 在含有 25 μg /mL Amp 的
LB 培养基中 28℃培养 1 d ,取 1 mL 菌液于离心
管中离心 ,再用 1. 5 mLTY 液洗 2 次 ,倾去 TY
液 ,用 1. 5mLT Y液混匀;各取 100 μL 在 T Y平
板上混合涂抹 , 28℃培养至单个菌落出现。用
2 mL 0. 9%NaCl液体洗涤制成菌悬液 ,然后转入
1. 5 mL 离心管 ,稀释成 10-1 、10-2 、10-3 三个稀释
度 ,每个稀释度各取 100 μL 在含有 250 μg /mL
链霉素的选择性平板上涂抹 ,重复 2次 ,28℃培养
至单菌落出现。挑取单菌落至硝酸纤维膜上 ,
70℃下处理 1 h ,冷却至室温 ,放入含有 200 μg /
mL X-gal的检测试剂中28℃培养3 ～ 5 h ,若菌落
周围变蓝 ,则表明此菌落中的根瘤菌已成功导入
了 celB 基因 。
1. 2. 4　标记菌株与出发菌株的代时测定　分别
吸取等量的标记菌株和出发菌株加入到等量的新
鲜 YMB培养液中 28℃摇床培养 ,然后分别于 0 、
1. 5 、5 、10 、20和 30 h ,对标记菌与出发菌取样 ,设
3个重复 ,用分光光度计测定吸光度 A 值 ,以 A
值为纵坐标 ,不同取样时间为横坐标绘制出生长
70 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
曲线 。以在纵坐标上代表光密度为二倍的两点所
对应的横坐标上的两点的时间差为世代时间[ 13] ,
计算出代时。
1. 2. 5　稳定性检测 　在传代次数分别为 10 、
20 、50和 100 h下取样 ,用 celB 标记基因检测试
剂检测其是否变蓝。
1. 2. 6　水培试验 　以出发菌株为对照 ,分别取
等量标记菌株(每个标记菌选 4株)和出发菌株与
供试苜蓿品种作回接试验 ,设 3个重复 ,测定试管
内植株的蓝白瘤数 、干重 、叶绿素含量和全氮含量
等指标。
1. 2. 7　田间试验 [ 14] 　设接种和不接种两种处
理 ,每种处理 3个重复。结瘤后 ,对每一处理随机
采样 ,测定瘤重 ,蓝白瘤数 ,干重 ,叶绿素含量 ,全
氮含量 ,鲜草产量等指标 。
1. 2. 8　数据测定与分析方法　植株干重的测定:
将收获的新鲜植株在靠近茎基部剪去根系 ,先在
85℃条件下烘 10 min ,再在 65℃条件下烘干至恒
重。叶绿素含量的测定:参见文献 [ 15 , 16]的方
法。植株全氮含量的测定:用 H2 SO 4-H 2O 2 消
煮 ,奈氏比色法测定[ 17] 。标记菌根瘤占瘤率检
测:方法参见文献[ 18] 。用 Excel 和 SPSS 统计
软件对试验数据进行统计分析 。
2　结果与分析
2. 1　分离纯化和回接试验结果
经菌落形态鉴定 、革兰氏染色镜检和回接试
验 ,获得纯菌株 93 株。以瘤数和干重为指标 ,选
出了 4株结瘤能力和有效性都较高的菌株 ,分别
为:Y6-1-1 、BB18-1-1 、BB22-1-1和 WZ6-2-2。其
平均瘤数 、干重和对照的比较见表 1。
表 1　所选菌株与对照之间有效性的比较
Table 1　Comparing the nitrogen fixing efficiency
of the selected strains with the contrast
菌株
S t rain s
瘤数 /个
Nodule
num ber
植株干重
/ g
Dry w eigh t
MD Sig
Y6-1-1 21. 5 0. 0259 0. 01850** 0. 001
BB18-1-1 22 0. 02685 0. 01945** 0. 001
BB22-1-1 19 0. 0207 0. 01330** 0. 009
WZ6-2-2 16 0. 0226 0. 01520** 0. 005
CK 0 0. 0071
注:sig<0. 01和“ **”表示差异极显著。
Note:sig<0. 01 and “ **” indicatin g th at the dif ference is ex-
t remely signifi can t betw een marked and parental st rain s.
从表 1可看出 ,供试菌株的平均结瘤数都在
16个以上 ,结瘤能力较强 ,从干重分析有效性 , 4
个菌株与对照相比 , sig 值都远远小于 0. 01 ,说明
干重都有极显著的增加。
2. 2　基因标记
2. 2. 1　基因标记结果　将 4 个出发菌株 Y6-1-
1 、BB1 8-1-1 、BB2 2-1-1 和 WZ6-2-2 进行基因标
记 ,对平板上长出的菌落进行颜色反应的检测 ,反
应为蓝色即为标记成功 ,最后每个菌株挑取 4个
标记成功的菌落分别记为 c1-1 、c1-2 、c1-3 、c1-4;
c2-1 、c2-2 、c2-3 、c2-4;c3-1 、c3-2 、c3-3 、c3-4;c4-
1 、c4-2 、c4-3 、c4-4 ,其颜色反应见图 1。
图 1　标记菌株颜色反应
Fig. 1　Color reaction of the marked strains
表 2　标记菌株与出发菌株的代时比较
Table 2　Comparing the generation time of the marked
strains with the parental strains
菌株
S t rain s
代时 /h
Generat ion
tim e
菌株
St rains
代时 /h
Generation
t ime
c1-1 3. 08ns c2-1 4. 27ns
c1-2 3. 12ns c2-2 4. 26ns
c1-3 3. 14ns c2-3 4. 16ns
c1-4 3. 09ns c2-4 4. 23ns
Y6-1-1 3. 12 BB18-1-1 4. 19
c3-1 2. 95ns c4-1 3. 71ns
c3-2 3. 01ns c4-2 3. 69ns
c3-3 2. 96ns c4-3 3. 75ns
c3-4 2. 95ns c4-4 3. 67ns
BB22-1-1 2. 98 WZ6-2-2 3. 73
注:“ ns”表示标记菌株与出发菌株相比差异不显著。
Note:“ ns” indicating that the di fference is not signif icant between
marked an d parental st rains. The same b elow .
2. 2. 2　标记基因在标记菌株内的稳定性及对标
记菌株生长影响的检测　对表 2进行分析可以看
出 ,标记菌株与出发菌株相比 ,其代时差异都不显
著 ,也就是说标记基因导入根瘤菌后对其生长没
有产生显著的影响。
通过在传代次数分别为 10 、20 、50 、100下进
行取样 ,用 celB 标记基因检测试剂进行检测后 ,
71 3 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　钟文文等:高效苜蓿根瘤菌的筛选
所有供试菌株仍然呈阳性反应 ,说明标记基因在
标记菌株内能稳定传代。
2. 2. 3　水培试验结果分析　标记基因对标记菌
株竞争结瘤能力的影响的检测结果:根据 celB 标
记菌株在根部形成的根瘤能够和 celB 的底物反
应显蓝色这一特点(图 2),通过测定蓝瘤和总瘤
的数目就可以直观 、简便的得知蓝瘤占瘤率 ,即标
记菌株的竞争能力。
从表 3可看出 ,在相同条件下同时接种等量
出发菌株和标记菌株 ,蓝瘤占瘤率与 50%相比 ,
没有显著差异 ,对只接种出发菌株和同时接种等
量的出发菌株和标记菌株后植株的总瘤数进行比
较 ,差异也不显著 ,说明出发菌株和标记菌株在竞
争结瘤能力上没有显著差异 ,即标记基因导入根
瘤菌后对其竞争性没有产生显著影响。 sig 值越
大 ,说明与 50%相比差异越小 ,也就是和出发菌
株的竞争能力越接近 ,通过比较各个标记菌株的
sig 值 ,可以得出在竞争性上和出发菌株最接近的
各标记菌株分别为:c1-3 、c2-2 、c3-1 、c4-1。
图 2　水培试验中标记菌与出发菌
根瘤分布及有效性比较
Fig. 2　Comparing nodule distribution and the
ef fectiveness of the marked strains and the parental
strains in N-free solution pot experiment
表 3　标记菌株竞争结瘤能力
Table 3　Competitiveness of the marked strains
菌株
S t rain s
瘤重 / g
Nodule
weight
蓝瘤数 /个
Blue n odu le
numbers
白瘤数 /个
White nodule
numbers
总瘤数 /个
Total nodu le
numbers
蓝瘤占瘤率
Rate of blue
nodule n umbers
与 50%差异
C om pared w i th
50%(sig)
c1-1 0. 02053 7. 67 7 14. 7ns 0. 5227 0. 496
c1-2 0. 02093 7. 33 7. 67 15ns 0. 4889 0. 838
c1-3 0. 02140 8. 00 8 16ns 0. 5000 0. 947
c1-4 0. 02107 7. 00 7. 33 14. 3ns 0. 4884 0. 819
Y6-1-1 0. 02137 15. 7
c2-1 0. 01833 5. 67 6 11. 7ns 0. 4857 0. 645
c2-2 0. 01883 6. 67 6. 33 13ns 0. 5128 0. 786
c2-3 0. 01907 6. 00 5. 33 11. 3ns 0. 5294 0. 344
c2-4 0. 01920 6. 33 7 13. 3ns 0. 4750 0. 424
BB1-8-1-1 0. 01843 12. 7
c3-1 0. 02307 9. 00 9 18ns 0. 5000 0. 969
c3-2 0. 02347 9. 33 9. 33 18. 7ns 0. 5000 0. 949
c3-3 0. 02293 9. 00 8. 67 17. 7ns 0. 5094 0. 815
c3-4 0. 02330 9. 67 8. 67 18. 3ns 0. 5273 0. 433
BB2-2-1-1 0. 02343 18. 3
c4-1 0. 02473 10. 67 10. 7 21. 3ns 0. 5000 0. 981
c4-2 0. 02490 10. 33 10. 3 20. 7ns 0. 5000 0. 898
c4-3 0. 02520 11. 00 12 23ns 0. 4783 0. 551
c4-4 0. 02523 10. 67 11. 3 22ns 0. 4848 0. 662
WZ-6-2-2 0. 02530 22. 3
注:ns , sig>0. 05表示差异不显著。
Note:n s , sig>0. 05 indicating that the di fference is not signi ficant betw een marked and parental s trains. T he same below .
　　标记基因对标记菌株共生固氮有效性影响的
检测结果:从表 4可看出 ,接种菌株的植株和对照
相比在干重 、全氮含量和叶绿素含量上都有极显
著差异 ,说明供试菌株的固氮有效性都是比较强
的;接种标记菌株与接种相应出发菌株的植株相
比 ,在干重 、全氮含量和叶绿素含量上都没有显著
差异 。从图 2也可直观地看出 ,同时接种标记菌
株和出发菌株的植株与只接种出发菌株的植株在
生长情况上无显著差异 ,说明标记基因对标记菌
株的固氮有效性无影响。通过综合比较各指标的
sig 值 ,可得出在固氮有效性方面和各出发菌株最
接近的标记菌株也为 c1-3 、c2-2 、c3-1 、c4-1。
2. 3　田间试验结果
2. 3. 1　标记菌与土著菌竞争结瘤能力比较结果
　从表 5 可以看出 , 4个供试菌株 c1-3 、c2-2 、c3-
1 、c4-1接种到田间后对植株的瘤重和总瘤数都有
明显增加 ,与对照相比差异显著且菌株之间也有
显著差异 ,其中 c4-1和 c1-3在瘤重的比较上差异
不显著 ,而和其它两个菌株均有显著差异。从蓝
瘤占瘤率来看 ,4 个菌株都在 50%以上 ,其中有 3
72 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
个菌株在 72%以上 ,说明与土著菌相比 , 4个菌株
有更强的竞争结瘤能力 ,总的来说 , 4个菌株按竞
争结瘤能力的高低排列顺序为 c4-1> c1-3> c3-
1> c2-2 。
表 4　标记菌株共生固氮有效性
Table 4　Effectiveness of the marked strains
菌株
S t rain s
植株干重 / g
Dry w eigh t
sig
植株全氮 /(m g g - 1)
Content of the wh ole N
sig
叶绿素含量 /(mg g - 1 FW - 1)
C on tent of chlo roph yll
sig
c1-1 0. 0219** 0. 199 25. 587 ** 0. 272 1. 4330 ** 0. 369
c1-2 0. 0215 ** 0. 091 25. 437 ** 0. 193 1. 4183 ** 0. 113
c1-3 0. 0232 ** 0. 845 25. 873 ** 0. 491 1. 4603 ** 0. 619
c1-4 0. 0220 ** 0. 212 24. 910 ** 0. 069 1. 4220 ** 0. 156
Y6-1-1 0. 0231 ** 26. 337 ** 1. 4507 **
c2-1 0. 0201 ** 0. 424 23. 020 ** 0. 920 1. 3123 ** 0. 710
c2-2 0. 0207 ** 0. 908 22. 850** 0. 624 1. 3223 ** 0. 990
c2-3 0. 0204 ** 0. 672 23. 043 ** 0. 963 1. 3167 ** 0. 828
c2-4 0. 0208 ** 0. 969 23. 183 ** 0. 782 1. 3347 ** 0. 666
BB18-1-1 0. 0208 ** 23. 063 ** 1. 3227 **
c3-1 0. 0248 ** 0. 882 27. 480 ** 0. 476 1. 4730 ** 0. 852
c3-2 0. 0250 ** 0. 843 27. 190 ** 0. 753 1. 4840 ** 0. 488
c3-3 0. 0244 ** 0. 463 26. 570 ** 0. 586 1. 4570 ** 0. 578
c3-4 0. 0242 ** 0. 288 26. 260 ** 0. 337 1. 4390 ** 0. 178
BB22-1-1 0. 0249 ** 26. 963 ** 1. 4690 **
c4-1 0. 0267 ** 0. 795 29. 850** 0. 964 1. 6743 ** 0. 791
c4-2 0. 0257 ** 0. 074 28. 433 ** 0. 078 1. 6380 ** 0. 110
c4-3 0. 0266 ** 0. 931 29. 730 ** 0. 906 1. 6843 ** 0. 817
c4-4 0. 0261 ** 0. 240 29. 673 ** 0. 845 1. 6657 ** 0. 491
WZ6-2-2 0. 0266 ** 29. 817 ** 1. 6797 **
CK 0. 0117 13. 520 0. 9537
表 5　标记菌的竞争结瘤能力
Table 5　Competitiveness of the marked strains
菌株
S t rain s
瘤重 / g
Nodu le w eigh t
蓝瘤数 /(个 /10株)
Blue nodule num bers
白瘤数 /(个 /10株)
White nodule n umbers
总瘤数 /(个 /10株)
Total n odu le numbers
蓝瘤占瘤率
Rate of blue nodu le num bers
c1-3 0. 33867A 148. 67 55. 67 204. 33 B 0. 7276
c2-2 0. 20067C 55. 00 50. 67 105. 67D 0. 5205
c3-1 0. 31767B 139. 67 51. 33 191. 00C 0. 7313
c4-1 0. 35167A 173. 67 42. 67 216. 33A 0. 8028
CK 0. 17867D 74. 00 E
注:字母不同表示差异显著 ,字母相同表示差异不显著。Note:The dif feren t let ters indicat ing th at the dif ference is signifi cant am ong
st rain s , the sam e let ter indicatin g that the dif ference is n ot signif icant among st rains. T he same below .
表 6　标记菌的共生固氮有效性
Table 6　Effectiveness of the marked strains
菌株
S t rain s
植株干重
/(g /10株)
Dry w eight
与对照相比增加 /%
Increased
b y com pared
w i th CK
植株全氮
/(mg g - 1)
Content of the
w hole N
与对照相比增加 /%
Increased by
compared w ith CK
叶绿素含量
/(m g g - 1
FW - 1)
Content of
chlorophyll
与对照相比增加 /%
In creased by
compared
w ith CK
鲜草产量
/(kg 100 - 1
m - 2)
Yield
与对照相比增加 /%
Increased by
com pared
wi th CK
c1-3 2. 5550AB 150. 56 25. 8400B 54. 79 1. 7290B 40. 95 381A 87. 7
c2-2 1. 0230C 0. 32 20. 4033C 22. 22 1. 2563D 2. 41 210C 3. 4
c3-1 2. 4017B 135. 53 24. 3433B 45. 83 1. 6193C 32. 00 316B 55. 7
c4-1 2. 8400A 178. 51 29. 6067A 77. 36 1. 8153A 47. 98 397A 95. 5
CK 1. 0197C 16. 6933D 1. 2267D 203C
2. 3. 2　标记菌与土著菌固氮有效性的比较结果
　从表 6 可看出 , c4-1 、c1-3 、c3-1与对照相比 ,
在植株干重 、全氮 、叶绿素含量和鲜草产量上都有
明显增加 ,差异达到显著水平且菌株之间也存在
显著差异 ,其顺序为 c4-1> c1-3> c3-1;菌株 c2-
2与对照相比 ,只在全氮上差异显著 ,但增加幅度
与其它 3个菌株相比并不大 ,仅为 22. 22%,而在
植株干重 、叶绿素含量及鲜草产量上差异都不显
著 ,有效性不高。由此得出供试菌株中固氮有效
性高的菌株为 c4-1 、c1-3 、c3-1。
3　讨论
接种根瘤菌存在一个和土著菌竞争的问题 ,
在试验室条件下有效性高的菌株应用到田间时与
土著菌相比其竞争性并不一定高 ,为了充分发挥
根瘤菌在生产上的应用 ,要求筛选的菌株不仅有
效性高而且竞争性强。采用一种方便 、快速的技
术对供试菌株的竞争性进行检测是必要的 。celB
73 3 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　钟文文等:高效苜蓿根瘤菌的筛选
标记基因以其具有的没有背景活性 ,检测试剂低
廉 ,检测方法简便 、直观等优点目前被广泛应用于
根瘤菌竞争性的研究 。
利用转基因技术来研究微生物生态时都必须
考虑引入的基因对受体的影响 。检测结果表明本
实验所采用的 celB 基因在标记菌株内能稳定传
代 ,对标记菌株的生长 、竞争性以及有效性都没有
显著影响 ,完全可以作为一种方便 、直观而又有效
的检测菌株竞争结瘤能力的手段用于高效根瘤菌
株的筛选 。同时通过比较各个出发菌株和相对应
的 4个标记菌株的竞争性和有效性 ,选出了与各
出发菌株最接近的标记菌株 ,分别为 c1-3 、c2-2 、
c3-1 、c4-1。
通过田间试验对标记菌和土著菌的竞争性和
有效性进行比较 , c1-3 、c3-1 、c4-1 这 3 个菌株的
占瘤率都在 72%以上 ,说明与土著菌相比有更强
的竞争结瘤能力 ,与对照相比 ,在瘤重 、总瘤数上
差异也都达到显著水平 ,且显著提高了植株的干
重 、叶绿素含量 、全氮量和鲜草产量 ,其中 c4-1在
每一项指标上都是表现最优 ,其增幅分别达到
178. 51%、47. 98%、77. 36%、95. 5%;c2-2的占瘤
率为 52. 05%,虽然大于 50%,但据文献报导 ,只
有当接种根瘤菌根瘤占有率不低于 66%时才能
显著提高产量 ,这可能也是导致其在植株干重 、叶
绿素含量及鲜草产量上差异都不显著的原因 。
通过对田间试验和水培试验结果相比较 ,可
以发现 c2-2在水培试验中侵染性和有效性相比
对照都较高 ,差异达到显著水平 ,表现为高效菌
株 ,但是在田间试验条件下无论是在结瘤能力上
还是对植株的产量和质量都没有显著的提高 ,分
析其原因 ,主要是因为水培条件比较单一 ,影响因
子较少 ,而土壤环境条件和影响因子要相对复杂
的多 ,根瘤菌接种剂施入到土壤中后 ,要与土著根
瘤菌竞争土壤营养 、生存空间及宿主植物等 ,因此
会得到不同的试验结果。这与很多文献报道的结
果一致 ,即在人工控制的温室条件下所测定的菌
株的结瘤能力与该菌株在田间占瘤率表现并不完
全一致 ,在实验室获得的结瘤能力可能并不能够
提供该菌株在田间的真实占瘤率信息[ 18] 。在筛
选菌株时 ,通过田间试验来检测供试菌株与土著
菌的竞争能力是必需的。本试验筛选出了 3个高
效菌株 ,分别为 Y6-1-1 、BB2-2-1-1 和 WZ-6-2-2 ,
其中WZ-6-2-2的有效性最高 ,竞争性最强 ,可用
于苜蓿盛世品种的人工接种。
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74 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷