全 文 ：文章编号:1001-764X(2011)05-354-04 ·基础实验诊断研究·
作者简介:韩晓红，1972 年生，女，副教授，博士研究生，主要从事肿瘤病理的研究。
通信作者:邵世和，教授，博士，博士研究生导师，E-mail:shaoshihe2006@ 163． com。
重组苦瓜叶蛋白 MAP30 诱导人食管癌细胞株 EC-1． 71
凋亡的实验研究
韩晓红1a，邵世和1b，薛延军1c，陈德玉2，黄河1b，李先茜3，许化溪4(1．江苏大学基础医学与医学技术学院 a．病
理学教研室，b．微生物学教研室，c．人体解剖学教研室，江苏镇江 212013;2．江苏大学附属医院肿瘤科，江苏
镇江 212001;3．上海中医药大学附属普陀医院肿瘤实验室，上海 200062;4． 江苏大学检验医学研究所，江苏
镇江 212013)
摘要:目的 探讨用重组苦瓜蛋白 MAP30 (Momordica anti-HIV protein of 30 ku)诱导人食管癌细胞株 EC-1． 71 细胞凋亡状况。
方法 MAP30 诱导 EC-1． 71 细胞后，透射电镜观察细胞凋亡的形态特征;JC-1 荧光探针检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)变化;
ELISA法检测细胞培养上清液中细胞色素 c(Cytc)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;免疫细胞化学法检测细胞 ERK1 /
PERK1，AKT /PAKT和 NF-κB表达;荧光微板阅读仪检测细胞 caspase-12 活性。结果 MAP30 诱导可以使 EC-1． 71 细胞固缩，
核膜扭曲，核染色质聚集成块并靠近核膜，内质网高度膨胀、扩张;ΔΨm 水平下降;Cytc 和 TNF-α 含量增加;胞质中 ERK1、
AKT表达增强而胞核中 PERK1、PAKT表达降低，NF-κB活性降低，caspase-12 活性增强。结论 MAP30 可以诱导 EC-1． 71 细
胞凋亡。
关键词:重组苦瓜蛋白 MAP30;食管癌;EC-1． 71 细胞;凋亡
中图分类号:R735． 1 文献标志码:A
Experimental study of recombinant MAP30-induced apoptosis of human esophageal carcinoma EC-1． 71 cells
HAN Xiao-hong1a，SHAO Shi-he1b，XUE Yan-Jun1c，CHEN De-yu2，HUANG He1b，LI Xian-qian3，XU Hua-xi4(1． a． Department of
Pathology，b． Department of Microbiology，c． Department of Human Anatomy，School of Medical Science and Laboratory Medicine，
Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu;2． Department of Oncology，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang
212001，Jiangsu;3． Laboratory of Cancer，Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai
200062;4． Institute of Clinical Laboratory Medicine of Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China)
Abstract:Objective To investigate the effects of recombinant MAP30 (Momordica anti-HIV protein of 30 ku)on apoptosis of human
esophageal carcinoma EC-1． 71 cells． Methods Following the treatment with MAP30，the ultrastructural and morphologic changes of
EC-1． 71 cell apoptosis were observed by electron microscope． The level of mitochondria membrane potential (ΔΨm)was displayed by
JC-1 fluorescent probe assay． The cytochrome C (Cytc)and TNF-α were determined by ELISA． The expression of ERK1 /PERK1，
AKT /PAKT and NF-κB protein were showed by immunocytochemical stain． The activity of caspase-12 was measured by fluorometric
assay． Results The nuclear fragmentation，chromosome condensation，abnormalities of mitochondrial cristae and shrinkage of the ap-
optotic cell were visible． The endoplasmic reticulum swelled and expanded． The level of ΔΨm decreased and the contents of Cytc and
TNF-α increased in supernatant． The expressions of ERK1 and AKT in cytoplasm increased but PERK1and PAKT in cell nucleus de-
creased． NF-κB protein translocated from nucleus to endochylema which was identified by immunocytochemical stain． The increased
activity of caspase-12 was showed in time-and dose-dependent manner by fluorometric assay． Conclusion The recombinant MAP30
could induce the EC-1． 71 cell apoptosis．
Key words:recombinant Momordica anti-HIV protein of 30 ku;esophageal carcinoma;EC-1． 71 cell;apoptosis
苦瓜来源丰富，价廉，毒性低，如能作为安全有
效的天然药物，意义重大。本研究对重组苦瓜蛋白
MAP30 诱导人食管癌 EC-1． 71 细胞凋亡进行了探
讨，为将其用于肿瘤预防及治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1． 1 试剂及仪器 EC-1． 71 细胞由江苏大学附属
医院陈德玉教授惠赠;原核表达载体 pET-28a 和
BL21(DE3)由江苏大学检验医学研究所保存;RPMI
1640 培养基、小牛血清购自 Gibco 公司;ERK1 /
PERK1、AKT /PAKT、NF-κB和 TNF-α单克隆抗体购
自 Sigma 公司;JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒，
·453· 临床检验杂志 2011 年 8 月第 29 卷第 5 期 Chin J Clin Lab Sci，Aug． 2011，Vol． 29，No． 5
DOI:10.13602/j.cnki.jcls.2011.05.042
caspase-12 荧光检测试剂盒购自 BioVision 公司;人
细胞色素 c(Cytc)ELISA 试剂盒购自 R＆D 公司;
JEM-2000 EXI 型电子显微镜(美国 JEC 公司) ;
Nikon eclipse TE300 型荧光显微镜;FLX800T 型荧
光微板阅读仪(美国 BioTek 公司)。
1． 2 苦瓜 MAP30 基因的克隆表达及其重组蛋白质
的纯化 取新鲜的苦瓜叶片，用十六烷基三甲基溴
化铵(CTAB)法提取基因组 DNA。用 primer premier
5． 0 软件设计引物，上游 5-ATGAATTCATGGATGTT
AACTTCGATTTGTC-3，下游 5-ATCTCGAGTCAATT
CACAACAGATTCC-3，酶切位点分别为 EcoR I 和
Xho I。PCR扩增反应体积为 20 μL，包括:2． 0 μL 10
× PCR buffer，1． 0 μL dNTP Mix (10 mmol /L) ，上、下
游引物(10 μmol /L)各 0． 4 μL，1． 0 μL DNA 模板，
0． 2 μL Taq DNA 聚合酶，去离子水 15 μL。反应条
件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s、65 ℃ 40 s、72 ℃ 90 s，共
35 个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物用 10 g /L琼
脂糖凝胶电泳分析。将其 TA克隆和双酶切鉴定，测
序分析，构建重组表达载体 pET28a-MAP30，转化到表
达菌 BL21(DE3)中，经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖
苷(IPTG)诱导，用 NTA-Ni2 +树脂分离纯化所表达的
MAP30 融合蛋白，并通过 SDS-PAGE鉴定。
1． 3 细胞培养 EC-1． 71 细胞用含 10%胎牛血清
的 RPMI 1640 培养基(pH 7． 2 ～ 7． 4，含青霉素 100
U /mL及链霉素 100 μg /mL) ，置 37 ℃、5% CO2 培
养箱培养，传代。
1． 4 电子显微镜观察细胞形态 将 2 × 105 /mL 的
EC-1． 71 细胞接种于 50 mL 培养瓶中，实验组细胞
以 20 μg /mL MAP30 处理 48 h，对照组细胞不经
MAP30 处理，各组均设 3 瓶，PBS洗涤 2 次，2． 5%戊
二醛 4 ℃固定过夜，PBS 洗涤 2 次，锇酸固定，树脂
包埋，染色，电子显微镜下观察。
1． 5 JC-1 荧光探针检测细胞的线粒体膜电位
(ΔΨm)变化 将 7 × 104 /mL 的 EC-1． 71 细胞接种
于 24 孔板，待细胞贴壁后加入 20 μg /mL MAP30，同
时以不加 MAP30 的 EC-1． 71 为阴性对照组，以解耦
联剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)作用组为阳性对
照组，每组 3 孔，分别继续培养 6、12、24、36、48 h，按
照 JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒说明书操作，荧光
显微镜下观察。
1． 6 ELISA 法检测细胞培养上清 Cytc 和TNF-α的
变化 将 8 × 104 /mL 的 EC-1． 71 细胞接种于 96 孔
板，待细胞贴壁后分别加入 20、30 μg /mL MAP30，
同时设空白孔，并以不加 MAP30 细胞作为阴性对
照，每组设 3 个复孔，培养 6、12、24、48、72 h，取细胞
上清液按照 Cytc检测试剂盒说明书操作，于酶联仪
450 nm波长检测吸光度(A)值。检测TNF-α的变化
时，细胞贴壁后加入 20 μg /mL MAP30，继续培养
24、48 h，取细胞上清液 200 μL加入反应板(预先用
抗 TNF-α单克隆抗体 4 ℃过夜包被) ，37 ℃温育 1
h，洗涤 3 次，加入酶标记抗鼠 IgG 抗体 200 μL，37
℃温育 1 h，洗涤 3 次，加入底物溶液后 37 ℃温育
0． 5 h，加入终止剂，检测 A450。
1． 7 免疫细胞化学 同 1． 4 方法处理细胞后，收集
细胞，离心弃上清，留少许 PBS 加入 2 滴鸡蛋清使
细胞重悬，中性甲醛4 ℃固定过夜。常规石蜡包埋
切片，滴加生物素化的一抗，链霉亲合素-过氧化物
酶法染色检测细胞的 ERK1 /PERK1、AKT /PAKT 和
NF-κB表达，中性树脂封片，光学显微镜下观察。
1． 8 荧光微板阅读仪检测细胞的 caspase-12 活性
将 2 × 105 /mL 的 EC-1． 71 细胞接种于 50 mL 培
养瓶中，实验组细胞以 20、30 μg /mL MAP30 分别处
理 48、72 h，对照组细胞未经 MAP30 处理，每组设 3
瓶，按 caspase-12 荧光检测试剂盒说明书操作，荧光
微板阅读仪于激发波长(400 nm)、发射波长(505
nm)处进行检测。
1． 9 统计学分析 用 SPSS 13． 0 统计软件进行。
结果以 珋x ± s 表示，多样本比较用单因素方差分析;
各组间两两比较用 q检验，组间比较用 t 检验，P ＜
0． 05 为有统计学意义。
2 结果
2． 1 MAP30 基因的克隆表达及重组蛋白的纯化
纯化的 MAP30 蛋白经 SDS-PAGE鉴定，相对分子量
(Mr)约为 30 000，与预测一致。MAP30 蛋白产生的
最佳诱导浓度为 0． 5 mmol /L IPTG(图 1) ，最佳诱导
时间为 4 ～ 5 h(图 2)。
注:M，蛋白质分子量 marker;1，BL21(DE3) ;2，pET-28a /BL21
(DE3) ;3 ～ 9，IPTG诱导组(0、0． 3、0． 5、0． 8、1． 0、1． 5、2． 0 mmol /L)
pET-28a-MAP30 转化的 BL21(DE3)。
图 1 不同浓度 IPTG诱导 4 h MAP30 蛋白的表达
·553·临床检验杂志 2011 年 8 月第 29 卷第 5 期 Chin J Clin Lab Sci，Aug． 2011，Vol． 29，No． 5
注:M，蛋白质分子量 marker;1，BL21(DE3) ;2，pET-28a /
BL21(DE3) ;3 ～ 8，IPTG 诱导组(0、1、2、3、4、5 h)pET-28a-MAP30
转化的 BL21(DE3)。
图 2 0． 5 mmol /L IPTG诱导不同时间 MAP30 蛋白的表达
2． 2 细胞形态学变化 MAP30 处理 48 h后可见细
胞固缩、核膜扭曲、核染色质聚集成块并靠近核膜等
凋亡细胞特征，并可见内质网(ER)高度膨胀、扩张。
2． 3 细胞线粒体膜电位(ΔΨm)变化 MAP30 可
以使细胞的 ΔΨm水平下降，呈现绿色荧光，并且荧
光强度随作用时间延长而加强。
2． 4 细胞培养上清液中 Cytc和 TNF-α的变化 见
表 1。
2． 5 免疫组化染色检测 ERK1 /PERK1、AKT /PAKT
和 NF-κB表达 MAP30 可以使胞质中 AKT、ERK1
表达增强，胞核中 PAKT、PERK1 表达降低，NF-κB
活性降低(由胞核转到胞浆) ，见图 3。
2． 6 EC-1． 71 细胞 caspase-12 活性变化 细胞经
20、30 μg /mL MAP30 处理 48、72 h 后，caspase-12 活
性增强，见表 2。
表 1 MAP30 对 Cytc和 TNF-α的影响(n = 3，珋x ± s)
MP30 作用
时间(h)
Cytc
对照组 实验组(20 μg /mL) 实验组(30 μg /mL)
TNF-α
对照组 实验组(20 μg /mL)
6 5． 462 ± 1． 849 6． 479 ± 0． 633 7． 061 ± 1． 332 － －
12 7． 569 ± 0． 719 13． 407 ± 0． 510 15． 248 ± 1． 745 － －
24 10． 912 ± 0． 719 19． 753 ± 0． 167* 21． 351 ± 0． 550* 0． 151 ± 0． 008 0． 164 ± 0． 004
48 6． 843 ± 1． 130 12． 147 ± 1． 097 14． 763 ± 0． 755 0． 156 ± 0． 006 0． 221 ± 0． 033▲
72 4． 154 ± 0． 411 5． 849 ± 1． 733 8． 417 ± 1． 236 － －
注:与对照组比，* ，P ＜ 0． 01;▲，P ＜ 0． 05。
图 3 EC-1． 71 细胞经 MAP30 处理前后 NF-κB、ERK1、AKT
表达(× 200)
表 2 MAP30 处理 EC-1． 71 细胞的 caspase-12 活性变化(n
= 3，珋x ± s)
组别 48 h 72 h
对照组 5 248 ± 180 8 288 ± 556
实验组(20 μg /mL) 6 687 ± 216* 13 717 ± 608*
实验组(30 μg /mL) 7 796 ± 383＊▲ 16 702 ± 433* #
注:与对照组比，* ，P ＜ 0． 01;与 20 μg /mL组比较，#，P ＜ 0． 01;
▲，P ＜ 0． 05。
3 讨论
目前已知主要有 ER途径、死亡受体途径、线粒
体途径和一些其他信号转导通路来调控细胞凋亡。
当 ER应激过强或过久时会诱导凋亡［1］。在 ER 应
激时，ER 未折叠蛋白反应(unfolded protein re-
sponse，UPR)被激活，提高线粒体对促凋亡因子的
敏感性［2］，导致 Cytc 释放到胞浆，启动细胞凋亡。
caspase-12 是 ER应激介导细胞凋亡的一个主要因
素，激活的 caspase-12 可引发细胞凋亡［3］。NF-κB
对细胞凋亡的影响存在促进和抑制 2 种不同的观
点，但一般认为 NF-κB 活化会抑制细胞凋亡［4］。
TNF-α能启动细胞凋亡机制，诱导细胞凋亡的同时
可激活 NF-κB途径，NF-κB 活化能抵抗 TNF-α 引起
的细胞凋亡［5］。细胞外调节蛋白激酶(extracellular
regulated protein kinases，ERK)平时以失活状态位于
胞浆内，通过磷酸化激活后转位到核内而介导 NF-
κB的转录活化，产生抗凋亡作用［6］。丝氨酸 /苏氨
酸蛋白激酶 AKT 是 PI3K 重要的下游调节因子，磷
酸化的 AKT(p-AKT)可以增加 NF-κB 的转录活性，
增加肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的侵袭和转
移［7］。不同凋亡途径间构成一个极其复杂的网络
结构，各信号通路之间相互作用、相互影响。
·653· 临床检验杂志 2011 年 8 月第 29 卷第 5 期 Chin J Clin Lab Sci，Aug． 2011，Vol． 29，No． 5
本实验研究结果表明 MAP30 可以诱导EC-1． 71
细胞凋亡，其可能通过降低 ΔΨm水平，使 Cytc 释放
而启动 ER途径(线粒体 /Apaf-l 依赖途径) ，也可能
通过促进 caspase-12 活化而启动 ER 途径(caspase-
12 活化途径)而诱导细胞凋亡。电镜检测也显示细
胞凋亡时 ER高度膨胀、扩张。MAP30 也可通过抑制
ERK1、AKT活化从而抑制 NF-κB通路活性而促进细
胞凋亡，但 TNF-α 诱导细胞凋亡的同时也可激活
NF-κB途径。可以此为基础深入研究 MAP30 诱导
EC-1． 71细胞凋亡的机制，为 MAP30 成为一种治疗人
食管癌的新药物提供实验基础及理论依据。
4 参考文献
［1］Szegezdi E，Fitzgerald U，Samali A． Caspase-12 and ER-stress-mediated
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alpha to TRAIL-mediated tumor regression［J］． Cancer Cell，2004，6
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［7］Mitsiades CS，Mitsiades N，Koutsilieris M． The Akt pathway:molec-
ular targets for anti-cancer drug development［J］． Curr Cancer Drug
Targets，2004，4(2) :235．
(收稿日期:2011-02-28，修回日期:2011-05-30)
(本文编辑:许晓蒙，陈维忠)
文章编号:1001-764X(2011)05-357-01 ·病例报告·
急性粒细胞白血病致 A、H抗原减弱 1 例
赵玲，李健，杨春晴，李敏(潍坊市红十字中心血站，潍坊市血液研究所，山东潍坊 261041)
关键词:急性粒细胞白血病;A抗原;H抗原;减弱
中图分类号:R733． 7 文献标志码:B
1 病历摘要
患者，男，25 岁，2009 年 5 月入住山东省诸城市人民医
院，经检查确诊为急性粒细胞白血病(M2a型)。该患者曾于
2005 年 6 月在本血站献血 400 mL，ABO血型为 A型，正反定
型相符。医院输血科在检查血型时发现正定型 O型，反定型
A型，遂送检本实验室。
2 血型血清学检查
2． 1 试剂与方法 单克隆抗 A、抗 B(长春博德公司，批号:
20080418) ，抗 A，B和抗 H(上海血液生物医药公司，批号分
别为 20070802、20080730) ，A、B、O 型红细胞悬液(各型选 3
等份混合)及人源抗 A、抗 B 血清(均为 3 等份混合)为本站
自制。ABO血型鉴定、吸收放散试验、H 抗原鉴定参照中国
输血技术操作规程［1］。
2． 2 ABO血型鉴定 正反定型不相符合，患者红细胞与抗
A，B明显凝集，可能存在弱 A或 /和 B抗原。见表 1。
表 1 ABO血型正反定型结果
抗 A 抗 B 抗 A，B A细胞 B细胞 O细胞
室温 － － 2 + － 4 + －
4 ℃ － － 3 + － 4 + －
2． 3 吸收放散试验 用患者红细胞吸收抗 A 血清，放散液
与 A细胞呈 4 +，与 B、O 红细胞均不凝集;而用患者红细胞
吸收抗 B血清，放散液与 A、B、O红细胞均不凝集，证明该患
者红细胞上存在 A抗原。
2． 4 H抗原鉴定 患者红细胞与抗 H 血清反应为弱凝集，
而正常 A、O红细胞与抗 H血清反应分别为 1 +、4 +，证明该
患者红细胞 H抗原减弱。
3 讨论
本例患者血型鉴定正反定型不符，经吸收放散试验才能检
出 A抗原。经鉴定，A抗原与 H抗原同时减弱，可能机制是 H
转移酶不活化，导致 H物质减少，从而引起 A和 H抗原均减少。
因疾病造成的血型抗原的减弱是暂时的、一过性的，随
着病情的缓解，血型抗原可恢复原状态［2］。临床对于正反
定型不相符者，应通过吸收放散试验或进行 ABO 分子生物
学试验确定血型。
4 参考文献
［1］中华人民共和国卫生部． 中国输血技术操作规程［S］．天津:天津
科学技术出版社，1997．
［2］黄旭颖，杨丽艳，李剑平． 骨髓增生异常综合征致 B 抗原减弱 1
例分析［J］． 中国误诊学杂志，2010，10(28) :7039-7040．
(收稿日期:2010-11-20，修回日期:2011-01-14)
(本文编辑:许晓蒙，陈维忠)
·753·临床检验杂志 2011 年 8 月第 29 卷第 5 期 Chin J Clin Lab Sci，Aug． 2011，Vol． 29，No． 5