全 文 ：第3 1卷 第 1期
一 9 9 1年 2月
中 国 医 学 科 学 院 学 报
AC C E T A A A D MI E A MEIC DI E I N A S NIC AE
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19 9 1
岩参诱发 N IH 小鼠微核 、 人类染色体
畸变和 S C E 频率的实验研究
蔡有余 郭维广 ’ 徐三福 ’ * 王 生
(医学实验动物研究所 , 北京 )
岩参 ( B er , in a p盯 p ur as o en s ) 又名岩白菜 , 为虎耳草科植物 , 主产于西南地区 , 生长在海拔 1。。。
~ 3。。。二背阴面岩坡上0 , . 按中药炮制加工工艺将岩参制成药片 , 在四川省阎中 、 盐亭两县对食管癌高发
区的食管上皮细胞增生和上消化道炎症患者 1 万多人进行长达 5 年多的治疗观察 0 ) , 治愈率达 8 8 . 7肠 , 表
明岩参对上消化道炎症疗效显著 , 是一种具有开发前景的新药 . 作者在对岩参进行了一系列急 、 慢性毒性
实验的羞础上 , 进行微核试验 、 染色体畸变、 S C E 频率和 D N A 合成抑制实验 , 为岩参的进一步开发应用
提供了理论依据 .
材 料 与 方 法
一 、 材料 N IH 小鼠 50 只 , 体重 2 0 9 左右 , 由本所饲养场提供 . 健康正常人外周血由实验室人员贡
献 , RPM I x e一。 为日本 J R S e i e n t i f i e l。 。 出品 . 小牛血清购自天津生化试剂厂 . 辅酶 I 和 G . P , 均为
is 卿 a 产品 . 5 。 为本院肿瘤研究所程书钧教授提供 , 蛋白质含 t 为 32 m盯m 1. P H A 为广州医 学工 程研
究所产品 。 岩参粉由四川省阁中县肿瘤防洽工作队提供。
二 、 方法
1
. 岩参液的制备 . 按中药炮制加工工艺 , 取 1 009 岩参粉置清洁的 1 o 0 m l烧杯内 , 加双蒸水 4。。m l,
置 65 ’ C水浴锅内隔水加热过夜 , 取上层液备用 . 因岩参中某些成份如岩白菜索不易溶于水 , 故再取岩 参
粉 1。。 g 浸于甲醇 . ( G R )液中常温浸提 4h , 将其上层液相与水浸液相合并 , 用普通滤纸过滤去值 , 再里
65
’
C 水浴浓缩至 1 0 !n 1, 用 G 6 漏斗过谁除菌冷藏 . 实验时采用原液 , 原液稀释 10 及 1 0 倍 3 个药物剂
盘。
2
. 动物分组和微核标本的制备 : 实脸共分 6 组 , 每组 10 只 N I H 小鼠 , 雌雄兼半 . 1 、 2 和 3 组分别 为
高 、 中、 低 3 个药物剂里组 , 分别按 25 以k g 、 2 . 5盯k g 和 。 . 2 5 9 / k g 灌胃给药 . 4 和 5 组分别为阳 性 和 阴
性对照组 . 给药 2让后处死动物 , 分别剥离股骨和胫骨 , 剪断近心端 , 用含 。 . s ml 血清的 l m l 注射器 (带
5 号针头 ) 将骨位冲洗入锥形离心管内 , 在混匀器上混匀 , 1 。。。 r/ m in 离心 10 二 in , 去上清 , 制成浓缩细
胞悬液 , 涂片后晾干 , 甲醇固定 15 、 20 过抽 ,再用 1 : 8 的姬姆萨磷酸缓冲液 ( p H 6 . s) 染色 1 5 nI in , 冲去
多余的染料 , 室温晾干 , 里油镜下计数嗜多染红细胞中的微核数 .
3
. 人外周血细胞培养 、 染色体标本制备和染色体畸变分析 : 参照文献 3 . 设实验组及对照组 . 实验组
分加与不加 .s 两类 , 加与不加 .s 均分别以高 ( 20 om g ) . 中 ( 40 二 g ) 、 低 ( 4m g ) 3 种岩参剂量处理 . 对照
组中以平阳霉素作阳性对照 , 剂 t 按 ,0 二以 k` 计算 , 阴性对照包活生理盐水 ( 50 闪 ) 和 S。 50 闪 两种 .
所使用的 5 . 混合液组成为 : 5 . 1 0 0卜1+ 磷酸级冲液 ( a皿二 0 1/ L M g C I: , 3 s m o o l / L K C I : s m m o l / L G 6 P ,
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l m o V L N助 H P O一 N a H , PO ` , p H 7 . 峨) , 0 0卜1 . 每个剂最组在油镜下计数 一0 0个中期
细胞 。
本文于 19 89 年 3 月 6 日收到 , . 四川省抽用市卫生防度站 , . , 四川省阁中县肿痛防治工作队
倪 中了国 医 学 料 学 院 学 报 招 卷
4
.染色单体分化染色和计数 :参照文献 4方法 .实验组包括加与不加 5 .两类 , 两者均分别以高 ( 20
。 g ) 、 中 ( 4。。 g ) 、 低 ( 4m g ) 3 个岩参剂量处理 . 以 M M C ( l阿 /瓶 ) 作阳性对照 , 阴性对照设空白 (不
加任何药物 ) 、 生理盐水 ( 50 叭 /瓶 ) 和 S。 ( 5。时 /瓶 ) 3 种对照 . 分别计数 20 或 25 个中期细胞 .
5
.
s H一 T d R 参入试验 : 按文献 5 方法稍加改良。 人外周血培养 24 h , 按实验组 、 对照组分别给药。 实
验组包括加与不加 .s 两类 , 其分别以高 、 中 、 低 3 个岩参剂量处理 (同前 ) , 同时加入 . H 一 T d R (终浓度
l 一卜C i / m l ) 3 7 ’ C 继续培养 2 4 h . 阴性对照组设空白 (双蒸水 5 0卜 l ) 和 5 . ( 5 0卜l/ m l ) 对照 , 阳性对照组
包括平阳霉素 ( 4 0 0 9 / k g ) 和 M M C ( 2 0二g / k g )对照 , 同时加入 . H 一 T d R (终浓度 l卜C i / nr l ) 3 7 ’ C 继续
培养 24 h . 经上述处理的各组培养物均以生理盐水洗涤 2 次以去除细胞外 . H一 T d R . 再用抽滤法将细胞移
至玻璃纤维纸上 (上海红光造纸厂 , 型号 4的 , 依次用蒸馏水 、 5肠 三抓醋酸 、 10 帕 乙醇 (均为 10 m l) 破
坏细胞 。 去蛋白 、 固定 D N A , 37 ’ C 烘干 , 将纸片移置闪烁侧量杯内 ( B ac k m an 公司产品 ) , 用均相液体
闪烁测且法测定放射活性 . 闪烁液组成为 P P O o . 3 g 、 P O P O P o . 03 g 、 甲苯 1 0 m l , 每个测量杯中加闪烁
液 6 m l .
结 果
一 、 岩二发 NI H 小吸二橄核分析 岩参高 、 中 、 低各剂量组间的微核率虽有差异 , 但无统计学意义 ( P > 。 . 05 ) . 高、 中 、 低剂 t 组分别 与阳 、 阴性对照组微核率比较 , 前者差异非常显著 ( P < 。 . 0 01 ) , 后
者差异则不明显 ( P > 。 . 2 , 表 1 ) .
裹 1 岩参诱发 N IH 小鼠骨盆微核的分析
T a b l e 1 A n a l了5 1 5 o f N I H m o u s e b o n e m a r r o w m i e r o n u e l e i
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衰 2 岩参对人外周血细胞染色体数目和结构畸变的影响
T . b le 2 o b s e r v a t i o n o f h u m a n e h r o 位o s o m e a b e r r a t i o n
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岩参诱发 N IH 小鼠微核 、 人类染色体畸变和 S C E频率的实验研究
二 、 岩今对人外月应细旅级色体. 目和摘构崎变的形晌 除 阳注对照平阳霉素组二倍体细胞数占总细
胞数的 0 8帕外 , 其余两对照组及加与不加 S 。 磷酸缓冲液实验组的二倍体细胞数均分别占各自总细胞数的
92 肠 以上 , 统计学分析无显著性差异 ( P > 。 . 05 ) . 实验组仅发现 1个断裂和 3 个裂隙染色体 ,平阳霉素对
照组有 3 个双着丝粒染色体 、 2 个断裂染色体 (表 2 ) .
三 、 岩 , 加与不加 S。 成 . 一冲液 , 发人 S C E的级率分析 阳性对照组与各实脸组和各对照 住 S C E频
率比较 , 均有非常显著性差异 ( P < 。 . 0 1) , 其余各对照组与各实验组 S C E频 率比较 , 均 无显 著性 差异
( P> 0
.
0 5
, 表 s ) .
四 , 岩 , 对人外 . 血细脸 ON A合成的抑制作用 加与不加 S。 磷酸缓冲液活化岩参 , 人外周血细 胞放
射活性 ( 3 H 一 T d R 摄入量 ) 均随岩参浓度增加而减少 . 当岩参浓度增大到 20 o m g布 nI l 时 , 其放射活 性 降
低至 42 ~ 5 6 c p m , 比平阳霉素对照组还低 , 表明 D N A 合成几乎处于抑制状态 (表 4 ) .
农3 岩参加和不加 .s 磷酸缓冲液诱发人 S C E频率分析
T a七l e 3 A n a l了5 15 o f il随 au S C E i n d u e e d b y B e r g e n i a p u r p u r a s e e n s
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衰 4 岩参对人外周血细胞D N A合成的抑制作用
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讨 论
徐三福等用岩参药片对四川省阂中、 盐亭两县食管癌高发区的食管上支细胞增生和上消化道炎症患者
l 万多人 , 长达 5 年为治序观察结果表明 , 洽愈承达 、 8 . ,肠 . 在盐亭 。 〕用岩参 (4 6 例 ) 与维生素 人 ( 3
例 ) 治疗食管上皮细胞重度增生患者的研究结采表明 . 服药 l 个疗程 ( 6个月 ) , 岩参组从重度增生转为轻
度增生或正常者 ( 80 . 4肠 ) 优于维生素人组 ( “ . 6肠 ) , 炎性细 胞消 失前 为 9 6 . 2务 , 后 为 23 肠 . 跟踪
观寮表明 , 岩参组无 l 例演化成癌症 , 维生素 A 组 .lJ 出现 2 例 , 充分证明岩参不仅对上消化道 患者 疗效
显着, 而且有防癌作用 . 疗效优于维生幸人 , 是很有发展前景的新药之一 本实验通过岩参诱发微核 、 染
76 中 国 医 学 科 学 院 学 报 昭 卷
色体畸变和 C E S频率的观察. 证实岩参不 会引起微核率 、 染色体结构和数目及 C E S频率的升离 , 提示岩
参是 1种安全 、 无毒、 无诱变作用的药物 .
70 年代 , S c ih m id 。 ,首先提出染色体断片和有丝分裂纺锤体被破坏是形成微核的基础 ,故微核形成可
反映细胞染色体的损伤效应 . 目前 , 微核方法在国内外巳广泛用于辐射防护 、 环境监测 、 化工农药 、 医药
及环境三致化合物的筛选工作中. 据报道 , 对不同小鼠骨盆细胞自发微核率进行比较分析的结 果 表 明 ,
N IH ( 1
.
0 5 ) < C , H (一。 s ) < C A ( 2 . 5 5 ) < ` 1 5 (5 . 55 ) < C 5 7B L ( 6 . 5 5 ) < 昆 明 ( 5 . 0 0 ) . N IH 小
鼠自发微核率最低 , 昆明小鼠自发微核率最高 , 二者差异显著 ( P < 。 . 05 ) `” , 因此 , 选用 N I H 小鼠进行
微核试验 , 是目前较为理想的动物材料之一
岩参剂 t . 成人一般按 5 0k g 计算 , 每日口服 4g , 换算后 20 9 动物应服 1 . 6m g . 浓缩的岩参液每 l m l
含 lg 岩参 . 稀释 10 倍 . 其浓度为 1。二 g / 。 1. 术实验低剂里组体重 2 09 的动物灌胃稀释 10 倍的岩参液
。 . 5 m l (相当于 ` m g ) , 相当于成人服药量的 3 . 1 25 倍 ,中剂量组灌胃稀释 10 倍的岩参液 , 相当于成人服药
妞的 3 1 . 25 倍 ,高剂且组灌胃 。 . ` m l 原液 . 相当于成人服药最的 3 1 2 . 5 倍 . 为进一步证时本实验选择的药
物剂经是否合理 , 用液闪法测最 . H 一 T d R标记的细胞的放射活性 ( c p m ) . 结果空白对照组与不加 s . 4 m g /
6 m l低剂且组的 c p m 相近 , 分别为 5 7 2。 和 6 1 4 5 c p m ,对细胞几乎无抑制作用 ,当药物浓度升高为 2 0 m g /
s ml 时 , 。 p m 值急剧下降为 56 , . H 一 T d R 摄 入量比空白对 照组 c p m 低 102 . 2 倍 . 表明 4 m g 和 20 m g /
低 , 高剂量的选择是合适的 .
, 考 文 做
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5 7
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S e il i m i d W
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E x Pe r im e n t a l S t u di e s w i t h B e r g e n ia
t he F r e q u e n cy o f M ie r o n u c le u s in
P u rP u r a s c e n s
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1 期 岩参诱发 N I H 小鼠微核 、 人类染色体畸变和 C E S频率的实验研究 ”
Pa Li e n ts wi t h e沁 p l a g ea l ep i t h el i a l e el l p r o l i f r a eLi o na nd i nf l a m m a ti o nf o r
f i v ey a er s i nL a ng
.
Z ho n` a nd y 县 n` r i ng C o u n ti es , S i e h u a n P r o v i n e e , a e u r e
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.
7肠 w a s a e h i e v e d , d e吐 o t s t r a t i n g t h a t B o r ` e n i a p u r p u r a s e e n s i s a
n e w a 几 d p r o ,n i s i n g d r u g
.
H o w e v e r
,
i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t
l o n g P e r i o d o f a d m i n i s t r a t i o n w i l J i n d u e e m u t a g e n e s i s e a r e i n o g e n e s i s
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o u t m i e r o n u e l e u s
, e h r o m o s e m a l a b e r r a t i o n a n d s i s t e r e h r o m a t i d e x 一
e h a n g e f r e q u e n e y t e s t s
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T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e d r u 吕 n e i th e r二i n d u e e s tn i e r o -
n u e l e j s f o r m a t i o n n o r e h r o :n o s o m a l a b e r r a t i o n a n d S C E
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T h e r e f o r e
,
w e e o n -
e l u d e t h a t t h i s d r u g 15 s a f e a n d w i t h
o u t t o x i e s i d e e f f e e t s
.
c ONA探针在 O cu h . n n . 肌曹养不良症荟因诊断中的应用 (简报 )
基础医学研究所 储 文明 . 张俊武
刘敬忠 赵艳君
吴冠芸 吴 沪生…
卞美璐二
孙念怡二
吴玉珍二 宁 杨 二
D u c五e u e 脏营养不良定( D M D )是男性最常见 X ~连锁致死性遗传病 ,新生男婴中的发生率为 1 / 3 5。。 .
D M D 墓因是巳知基因中的最大者 . 长达 2 3。。k b , 故该病基因诊断较困难 . 以往采用基因组克隆 探 针 , 结
果缺失型 D M D 检出率较低 . 1 9 87 年 K oe i此 等完成总长 14k b 的 D M D c D N A 全克隆 . 这一 c D N A 探针
的应用大大提高了 D M D 缺失型的检测率 . 本文选择缺失 热 ,点 区 的 c D N A片 段 l b一 a2 ( 1 . o k b) 、 b5 一 7
( 2
.
sk b) 和 C S (。 . g k b ) 为探针 , 应用限制性内切醉及 S 。诚 h o r 。 印迹杂交技术检测缺失型 D M D . 用 lb
一 Z a 探针在 3s 例 D M D 患者中检测到 5例缺失 , 占 14 肠 : 用 s b刁 探针在 8 例患者中检测到 3 例缺失 , 占
37 肠 , 用 C S探针在 “ 例患者中检测到 6例缺失, 占 43 肠 . 目前共检出 13 例缺失型 D M D (附图 ) . 其巾
一例用 l b一a2 及 s b一 均能检测到 D N A 顺序峡失 , 表明缺失约长达 6。。 k b .
目前 , 作者正在进行更多病例的研究及将 c D N A 探针检测 D M D 基因缺失用于产前诊断 . 由于 D M D
基因的巨大长度 . 及由新突变导致的 D M D 惠者占患者总数的三分之一 ,故用限制性内切酶片段长度多态性
( R F L P ) 连锁分析进行产前诊断的准确性较低 . 而应用 c D N A 探针可提高缺失型 ’ D M D 的检测率 , 故有
利于该病产前准确诊断 .
0 1 2 3 4 5 6 7 8 14 ( kb )
阮益丁一一一 .一一一万杯下七而十一
附. DM D cD N 人探针及 ls 例缺失型 D M D 的缺失位 !
实线示 D N A 片段缺失相对子 c D N A 的位里 , 虚线示缺失端点尚不明确
本文于 19肠华招月 2 1 日收到 , .砚土研究生 , 二协和医院 , …北京市儿童医院