全 文 ：中西医结合杂志 1 9 8 8年第 8卷第 4期 3 21
蛇毒对人食管癌细胞作用的研究
河南省林县食管癌防治研究所 张 中兴 薄献生
内容提婆 本 文以体外长期培养的 E ca 一 10 9 细胞 系为实验材抖 , 以分裂指数 、 集落 形
成 、 生成 曲 线 、 3 H一胸腺嗦咬核普标记为观寨指标 , 研究 了中药蛇毒在体 外对人食管癌细 饱
的生长 、 分 裂、 增 殖 、 再繁殖能 力和 D N A 合成的影响 。 结 果表明 , 蛇毒水提取 物 相 当 于
s m g / m A
、
1 o m g / m l
、
15 m g ` m l 时 , 对细 胞生长有较强的抑伟.!效应 ; 蛇毒 1 5 m g / m l 作用 4 8
小时可使细胞完全丧失再繁殖能力 。 蛇毒 10 m g / m J 、 15 m g / m 孟作用 4 8, 卜时对细 胞有 丝分裂
的抑制率分别 为 46 % 和 49 % , 但对细胞 D N A 合成仅呈轻度抑制效应 。
蛇 落 〔D “ e he s ” e a : ” d 滋e a ( A n d r ) F o e k幻 系蔷薇
科植物 , 其 味苦性寒 , 为清热解毒 、 治疗咽喉肿痛的
中药 . 亦用于治疗癌肿和凛病 (1 ) 。 林县食管癌防治研
究所曾将蛇 每与 龙葵等药联合应用于食管癌 、 责门癌 ,
观察到有缓解症状 、 延长存活时间的作用《 2) 。 我们在
对 6 0种 中草药的粗筛中 , 也观察到蛇毒的抗癌作用较
强 a() 。 本研究的 目的旨在探讨蛇每对体外人食管癌细
胞系的作用及其机理
天 。 药物作用后 48 小时换入常规培养液 。 观察各种浓
度作用下细胞生长或死亡的动态改变 , 计算药物对细
胞生长的抑制率 , 描绘生长曲线 。
抑制率 = 对照组 一实验组对照组 x 1 00 叭
材料与方法
一 、 细 胞及其培养 : E ca 一 10 9 细 胞系 t4) 从中国医
学科学 院肿瘤研究所获得 , 常规培养于含20 % 小牛血
清的 1 9 9 培 养液 内 , 每 6 天传代一次 。
二 、 药物 : 蛇蓦 由本所在当地采集 , 阴干后称全
草 2 09 , 切成 .0 sc m长 的节段 , 粉碎后加水煮沸提取 4
次 , 去渣 , 将 4 次提取液混合浓缩至 20 0m l , 母毫升
含生药 I OOm g , 滤纸过滤后 , 分装小瓶 , 高压灭菌 ,
4
“
f 保存备用 。 5 氟尿嗒咤 (5 一 F u) 为上海十三制药厂
生产 的注射针剂 , 在本实验中用作药物对照 。 仁述两
药用时都 光以培养液稀 释至 高浓度 , 再依次 二倍稀释
至低浓 度 。 先 以蛇毒的不同浓 度作用十细胞 , 观察各
个浓度的作 用 , 然后选择 3 个合适的浓度用于实验 。
根据 我们过去的实验 , 于 F u 使用 0 . 1m g/’ m 1的浓度。
三 、 实验方法及观察指标
1
. 形态观察及分裂指数 : 在细胞接种前 , 培养瓶
内预先放入小玻片 , 分别于药物作用 24 、 48 小时后取
片 , 甲醇固定 , iG e m sa 染 色 , 显 微镜下观察细胞形
态和结构的变化 , 并计数 100 0个细胞所含分裂相 , 求
出分裂指数与对照组 比较 。
2
. 生长曲线 : 将细胞定量接种 , 40 万 /瓶 , 于 细
胞接种后 48 小时 , 计数细胞数 , 然后换入含不同浓度
药物的培养液 , 继续培养并逐 日计数细 胞 数 连 续 4
3
. 集落形成试验 ( e o l o n y f o r m i n : t e s t ) : 用来观
察蛇毒作用后细胞的再繁殖能力 。 各组细胞经药物作
用后两天 , 弃去培养液 , 消化计数 , 按 2 0 00细胞 ` 。 m
的密度接种于培养瓶内 (瓶底面积 9 c m 艺 ) 一 周后 ’
甲醇固定 , iG e m ga 染色 , 镜下计数集落形成 数 , 凡:
个细胞以上算一个集落 。
4
. 刁H 一胸腺嗜吮核普护H 一 T d R , 参入实验 : 用来观
察药物对细胞 D N A合成的影响 , 按 细胞培 养同位素自
显影术进行 。 分别于药物作用后 2雌、 4 8 、 7 2小时 , 神
入含 “ H 一 T dR ( 2杯e i /m l )的培 养液 , 3 7 “ C培 养 6 小时 ,
取片 , 以生理盐水捌洗 3 次 , 以去除未参入阴 “ H 一 T d R ,
然后以甲醇固定 1 天 , 晾干后在暗室涂布核 I v 乳胶 ,
曝光 4 天 , D一 76 显影液显影 15 分钟 , 定影10 分钟 ,
iG
e
m as 染色 , 树胶封固 , 在显微镜下计数 1 00 0 个细
胞 , 观察 “ H 一 T d R 参入细胞核的情 况 , 得 出百分比 ,
与对照组进行 比较 。
结 果
一 、 蛇墓的不同浓度对细胞的作用
先以蛇墓 0 . l m g 、 0 . s m g 、 Zm g 、 s m只、 10m g /位 l
作用于细胞 , 发现 0 . l m g 、 0 5 m g 、 Zm g / m l对细胞生
长仅有轻度抑制作用 , 浓度达 s m g / m l 时 , 抑制作用
才比较明显 , 因此 , 本实验选择蛇 苟 s m g 、 10 m g 、 15
m g
/ m l作 为实验使用浓度 , 与不加药的正常对照作比
较 。
二 、 形态观察与分裂指数
1
. 形态观察 : 对照组 细胞轮廓清楚 , 间隙分明 ,
2幼 毋澳咨
细胞密集 , 核仁 2 、 3 个 , 核内结构清晰可见 , 分裂
相较多 。 实验组细胞较对照组差 , 分裂相少 , 结构不
如对照组清晰 , 少数细胞有轻微固缩 。
2
. 分裂指数 : 如表 1 所示 , 蛇墓 s m g /m l对细胞
分裂的抑制不明显 , 10 m g 、 15 m g / m l 对 细胞分裂的
抑制率分别为46 % 和 49 % 。
裹 1 各组细胞分裂指数及细胞集落形成情况
五 、 3 H一 T d R参入实验 : 如表 2 所示 , 蛇葛 1 00 .9
15 m g / m l 对 E o a 一 10 9 细胞的 D N A 合成抑制不明显 ,
蛇幕 15 m g / m l 作用 7 2 小时后 , 抑制率仅为29 % , 但
蛇蓦作用过的细胞参入的 “ H 一 T d R 颗粒不如对照组浓
密。
讨 论
组 别 分裂指数 抑制率 (% ) 集落形成数 抑制率 (% )
一- 一一 `一州 - . 一一 - - ` -一 . - - - - 一~ 一 - ~ ~ 一目一 ~对 一 1 7 5 n“卜J山今八UnU八八Qén, .,玉OJ工匕入口一.月勺注ù5 一 F u o . l m g /也 1 3 3蛇毒 s m g / m l 39
蛇薄 1 0m g / m l 2 2
蛇毒 15m g /。 1 2 1
注 : 表内数据为三次实验结果平均值
三 、 生长曲线 : 从附图可见 , 蛇毒 s m g 、 10 m g/ ln
对细胞生长均有较强的抑制 。 蛇毒 s m g 、 10 m g / m l作
用 48小时的抑制率分别为 39 % 和52 % 。
从生长曲线的结 果 看 , 蛇 毒 s m g 、 10 m g / m l 对
E
c a 一 1 0 9细胞的生长均有较强的抑制 ,而且 以 10 m g / m i
为曝 , 这与葛铭等` 3)对60 种中草药的粗筛结果相似。
上述情况在形态观察和集落形成实验中得到了进一步
证明 , 蛇毒作用后 的 E ca 一 1 09 细胞密度降低 , 结构模
糊 ; 蛇菜 s m g 、 10 m g / m l 作用 48 小时对细胞集落形成
的抑制率分别为 85 %和 92 % , 至 1 5m g /m l时 , 可使细
胞完全丧失再繁殖能力 。 这些都说 明 , 蛇毒 s m g 、 10
m g
,
1 5m g/ m l对 cE a 一 109 细胞的生长 、 增殖均有一定
的抑制作用 , 而且 浓度愈大 , 作用愈强 。
蛇毒 l o m g 、 15 m g / m l 作用 4 8小时后 , 对细胞分
裂指数的抑制率分别为 46 %和 4 9% , 这表明蛇毒对细
胞分裂有影响 , 但不是全部阻止细胞 分 裂 。 芯H 一 T d R
标记实验表明 , 蛇 毒 10 m g 、 1 5m g / m l对 E e a 一 10 9细胞
的 D N A合成有轻度抑制作用 , 1 5m g / m l作用 7 2小时的
抑制率为 29 % 。 这说明蛇毒对细胞 的作用可能主要通
过抑制细胞分裂和 D N A合成这两个途径。
从我们过去的实验看出 (4) , 药物对细胞的作用受
其浓度、 作用时间 、 细胞数量等因素的影响 , 本实验
中蛇荀抑制细胞生长增殖所需浓度较大 , 可能与药物
提取过程中成份丢失和接种细胞数量较多 有 一 定 关
系 。 虽然蛇燕 s m g 、 1 0 m g、 15m g / m l对 E e a ~ 10 9细胞
的生长 、 分裂有较强的抑制 , 但所需浓度较大 , 因此 ,
提取其有效抗癌成分 , 对于降低用药量 、 减少毒性 ,
提高疗效 , 均是必要的 。
(本文承中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学 系
章静波主任审阅 , 特此致谢 )
乞Tx戴契毓
(天 )
四 、 集落形成试验 : 三次实验结果表明 , 蛇幕 15
m g/ ml 和 5一 F u .o l m g/ m l 均不能形成集落 , 而蛇毒在
s m g
.
10 nI g 时仍可有少量集落成形 (表 1 ) 。
参 考 文 献
裹 2 蛇每作用后 E ca 一 10 9细胞的 “ H 一 T d R标记率
细胞 名H一 T d R 标记率 (编 )
2吐h 4 8 h 7 2 h
崎
l鸟ù口八匕一了n几乙」于、JO口-刁,1占OUǎb八U.跪碑这`通ù八月d曰才八心一了9自J吸d皿通ō对照
蛇聋 1 0 m g / m l
蛇毒 15 m g / m l
1
. 江苏新医学 院编 。 中草药大辞典下册 。 第一版 。 上海 : 上
海人民出版社 , 内7 : 2 1 1.6
2
. 林县食管癌防治研究所 。 中医中药治疗 21 例食管癌 、 责门
癌随访小结 , 食管癌防治研究 19 76 ; :1 4 .7
3
. 葛 铭 , 等 。 用食管癌 10 9细胞株筛选 60 种中草药 、 8 种
复合药的初步小结 。 河南医学院学报 19 81 ; 16 ( 4:) 了。
4
. 葛 铭 , 等 。 冬凌草甲素和 乙素对人肝癌 B EL 一7 4 02 细胞
株杀伤作用的研究 。 药学通报 19 8 1 , 1 6( 5 ) : 2 6 .2
197
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