全 文 ：山 地农 业生 物学 报　28(1):18 ～ 2 3 , 2 009
Journal of Mountain Agriculture and Biology
影响刺梨花药愈伤组织诱导因素的研究＊＊
张绿萍1, 2 ,陈　红 1＊
(1.贵州大学 喀斯特山地果树资源研究所 , 贵州 贵阳　550025;
2.贵州省果树研究所 , 贵州罗甸　550100)
摘　要:以贵农 1号 、2号 、5号 、6号 、7号刺梨为材料 , 研究不同基因型 、不同取材时间 、小孢子发育时期 、基本培
养基 、糖源 、生长调节物质 、培养条件等刺梨花药愈伤组织诱导的影响。结果表明;以刺梨盛花期(5月份)且小
孢子发育为单核中后期的贵农 1号花药为试材;Ms为基本培养基;3%的蔗糖为糖源;1.0mg·L-1 6-BA+2.0
mg·L-1NAA+0.5mg·L-1 2、4-D+1.0mg·L-1KT为激素组合 , 在黑暗条件下培养最有利于刺梨花药愈伤组织
的诱导。
关键词:刺梨;花药培养;愈伤组织诱导
中图分类号:S661.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1008-0457(2009)01-0018-06
StudyofInfluentialfactorsonanthercalusinductionofRosaroxbuighilTratt
ZHANGLv-ping1, 2 , CHENHong1(1.ResearchInstituteforFruitResourcesofKarstMountainRegionofGuizhou
University, GuiyangGuizhou550025, China;2.ResearchInstituteforFruitofGuizhouProvince, LuodianGuizhou
550100, China)
Abstract:ToobtainanthercalusofRosaroxburghiiTrat, fivegenotypesincludingGuinong1, Guinong2, Guinong5,
Guinong6, andGuinong7wereemployedtocarryoutvariousinductionexperimentsinthepresentinvestigation.There-
sultsdemonstratedthatseveralfactors, includinggenotype, developmentalstageofmicrospore, basalmedium, carbonic
source, plantgrowthregulator(PGR), aswelasincubatingconditionmayhavediverseeffectsonthecallusformation.
AntherofGuinong1obtainedatful-blossomstage, whosedevelopmentisaroundmid-anaphaseofuninucleatemicro-
spore, wasproventobethebestfortheinduction.MurashigeandSkoog(MS)basalmedium, supplementedwiththe
combinationof1.0mg.L-16-BA, 2.0 mg.L-1NAA, 0.5mg.L-1 2, 4-D, 1.0 mg.L-1KT, and3% sucrose
gavetheoptimalresponse.Additionally, theculturesincubatedindarkconditionsomewhatshowedimprovedefecton
calusinduction.
Keywords:RosaroxburghiiTrat;Antherculture;Calusinduction
刺梨 RoseroxburghiTrat属蔷薇科 Rosaceae蔷薇属 Rose多年生落叶小灌木 ,是我国特有新兴水果 ,素
有 “维生素 C之王”的美誉 [ 1] ,具有高营养 、高药用 、多利用价值 。但现有刺梨品种种子多而硬 ,可食率较
低 ,对加工有不利影响;鲜食存在口感差 ,刺多等不良性状 。因此 ,有必要进行少核或无核 、无刺等优良性
状刺梨新品种的选育与开发。采用常规方法培育无核 、无刺等新品种很难凑效 ,利用花药离体培养可诱导
单倍体植株 ,经加倍后可迅速得到纯系材料 ,并缩短育种年限 [ 2-3] 。此外 ,花药诱导分化过程中 ,还可能产
生其他多倍体植株 ,如三倍体 、四倍体等 [ 4] ,这在果树上有很高的利用价值。
近 30年来 ,利用花药培养产生单倍体植株的技术已被广泛应用到 10个科 , 24个属 , 34个种的 250多
＊ 收稿日期:2008-10-21;修回日期:2008-11-12
基金项目:贵州省科学技术基金项目 [黔科合 J字(2007)2054号 ] 、贵州省省长基金项目资助 [黔科教办(2007)03号 ]和贵州大学引进人才
科研项目资助(X060039)
作者简介:张绿萍(1982-),女 ,浙江东阳人 ,在读研究生 ,主要从事果树生物技术研究.
＊通讯作者:
种植物上[ 5] 。对刺梨的研究主要集中在刺梨的栽培技术 、生理生化 、分子生物学 、加工 、快繁等方
面 [ 1, 6-11] ,对刺梨新品种的选育和生物技术育种的研究较少。本研究以刺梨花药为试材对影响刺梨花药
愈伤组织诱导的关键因子进行了初步探索 ,为刺梨单倍体植株的获得奠定理论和技术基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
以贵州大学试验农场 ,品种为 “贵农 1号 、2号 、5号 、6号 、7号”的刺梨花药为材料。
1.2　方法
1.2.1　小孢子发育的细胞学观察　用卡诺固定液(3份 95%乙醇∶1份冰醋酸)固定 24h,转入 70%乙醇
保存 , 采用醋酸洋红染色 -花药涂抹制片法压片 ,显微镜观察刺梨小孢子发育时期 。
1.2.2　花药消毒与培养　将 4℃低温预处理 3d的新鲜花蕾用自来水冲洗干净 ,在 70%酒精中消毒
30s,无菌水冲洗 2 ～ 3次转至 0.1%升汞中消毒 10 ～ 15min,无菌水冲洗 4次 ,用无菌滤纸吸干表面水分
后 ,剥出花药并接种于三角瓶中 ,每瓶接种 25粒花药 ,于(25±2)℃条件下暗培养 30d,然后转入光培养 。
1.2.3　培养基　以 Ms、1/2Ms或 B5为基本培养基 ,附加不同配比的生长调节剂 ,研究不同小孢子发育
时期 、不同取样时间 、不同基因型 、不同基本培养基 、不同糖源 、不同激素组合 、不同培养条件对刺梨花药愈
伤组织诱导的影响;培养基均添加 6g·L-1琼脂 , pH值 5.8 ～ 6.0。
1.2.4　统计方法　花药在诱导培养基上培养 30d后统计愈伤组织诱导率 。愈伤组织诱导率 =(产生愈
伤组织花药数 /接种花药数)×100%。数据用 Excel处理后 , DPS进行方差分析和极差分析 , R= ki-kj ,
其中 ki、kj分别是该因子不同水平平均试验值中的最大值和最小值;R为极差分析法中的平均极差 。
2　结果与分析
2.1　刺梨花药愈伤组织的形成
刺梨花药接种 4 ～ 6d,其体积明显膨大 ,膨大的程度和快慢与培养基成分有关 ,少数花药花丝远端出
现水珠状分泌物;8d后部分花药开始变褐;12d左右变褐的花药逐渐失水萎缩 ,其颜色由黄褐色转至褐
色;20d左右部分花药在花丝远端形成白色 、致密 、颗粒状愈伤组织(见图 1);30d左右部分褐色或黑褐色
的干瘪花药裂开 ,侧面及腹分线产生白色 、疏松 、颗粒状的愈伤组织(见图 2)。
图 1　接种 20d后刺梨花药形成的白色致密愈伤组织 图 2　接种 32d后刺梨花药形成疏松颗粒状愈伤组织
Fig.1　WhitedensecallusinducedfromRosaroxburghi Fig.2　LooseparticlecalusderivedfromRosa　　
Tratantherafter20dincubation 　roxburghiTrattafter32 dincubation
2.2　小孢子发育时期对刺梨花药愈伤组织诱导的影响
将贵农 5号刺梨的花药接种于添加 1.0mg·L-1 6-BA、2.0mg·L-1NAA的 Ms培养基上 ,研究小孢子不
19第 1期　 张绿萍 ,等:影响刺梨花药愈伤组织诱导因素的研究
同发育时期愈伤组织诱导试验 ,结果见表 1。由表 1可见 ,单核中后期的愈伤组织诱导率显著高于其他时
期 ,为 26.15%,与双核期花药的诱导率存在显著差异。
表 1　小孢子不同发育时期对愈伤组织诱导的影响
Tab.1　Effectofdifferentdevelopmentalstagesofmicrosporeoncalusinduction
小孢子发育时期 花药颜色 愈伤组织开始形成时间(d)接种数(枚)愈伤组织诱导率(%) 愈伤组织颜色 愈伤组织形态
四分体至单核早期 淡绿色 32d 630 12.96abA 黄绿色 疏松颗粒状
单核中后期 淡黄色 28d 660 26.15aA 黄绿色 疏松颗粒状
双核期 黄色 33d 630 6.85bA 黄绿色 疏松颗粒状
注:不同大写字母表示 1%差异极显著水平;小写字母表示 5%差异显著水平 ,相同字母表示不显著。下表同。
2.3　不同基因型对愈伤组织诱导的影响
将不同基因型(贵农 1号 、2号 、5号 、6号 、7号)刺梨花药 ,接种于添加 1.0mg·L-1 6-BA、2.0mg·L-1
NAA的 B5培养基上 ,结果见表 2。由表 2可见 ,不同基因型对刺梨花药愈伤组织诱导率影响明显 ,其中贵
农 1号诱导率最高 ,为 41.58%,与贵农 2号存在极显著差异。另外 ,不同基因型小孢子发育时期为中后
期的花蕾和花药形态特征有一定的差异。
表 2　不同基因型对愈伤组织诱导的影响
Tab.2　EffectofdiferentgenotypesRosaroxburghiTrattoncalusinduction
基因型 花蕾形态特征花蕾大小(纵 cm×横 cm) 花瓣颜色 　
花药形态特征
整体状态 颜色 　
愈伤组织诱导率(%)
重复 1 重复 2 重复 3 平均
贵农 1号 (1.51 ～ 1.78)×(1.05 ～ 1.18)　 粉红 紧密 乳黄色 42.67 48.19 33.89 41.58aA
贵农 2号 (1.26 ～ 1.48)×(1.02 ～ 1.13)　 粉红 松驰 黄色 5.33 12.22 10.00 9.19bB
贵农 5号 (1.44 ～ 1.73)×(1.12 ～ 1.40)　 紫红 松驰 黄色 35.20 39.17 29.72 34.70aA
贵农 6号 (1.46 ～ 1.64)×(1.15～ 1.45)　 粉红 紧密 黄色 32.67 30.97 27.50 30.38aA
贵农 7号 (1.48 ～ 1.75)×(1.04 ～ 1.22)　 粉红 松驰 黄色 47.33 33.06 27.22 35.87aA
2.4　基本培养基对愈伤组织诱导的影响
将贵农 5号花药接种于添加 1.0mg·L-16-BA、2.0mg·L-1NAA的 Ms、B5 、1/2Ms3种培养基上 ,结果见
表 3。由表 3可见 ,以 B5为基本培养基花药愈伤组织诱导率最高 ,为 47.68%,且 3种培养基的诱导率呈极显
著差异。另外 ,以 B5为基本培养基诱导的愈伤组织质地致密 ,转至光培养下白色愈伤组织可转为乳黄色 ,增
殖快;而以 Ms、1 /2Ms为基本培养基诱导的愈伤组织质地疏松 ,转至光培养下转为黄绿色 ,增殖慢 。
表 3　基本培养基对花药愈伤组织诱导的影响
Tab.3　Efectofdifferentbasalmediaoncalusinduction
基本培养基 愈伤组织形成时间(d)
愈伤组织诱导率(%)
重复 1 重复 2 重复 3 平均
愈伤组织
颜色
愈伤组织
形态
MS 22d 36.36 35.83 37.00 36.40bB 黄绿色 疏松颗粒状
1/2MS 24d 30.00 34.17 25.83 30.00cB 黄绿色 疏松颗粒状
B5 27d 48.33 47.50 47.2 47.68aA 乳黄色 致密颗粒状
2.5　糖源种类及浓度对花药培养愈伤组织诱导的影响
以 Ms为基本培养基 ,添加 1.0mg·L-16 -BA、2.0mg·L-1NAA及不同浓度糖源 ,结果见表 4。由表 4
可见 , 1% ～ 7%的蔗糖 、葡萄糖 、可溶性淀粉均能成功诱导刺梨花药愈伤组织的形成 ,但不同糖源及浓度影
20 山 地 农 业 生 物 学 报 　2009年
响花药愈伤组织的诱导率 ,启动时间及颜色质地。 3%蔗糖和葡萄糖 ,均于第 14d后就开始形成愈伤组
织 ,而可溶性淀粉于第 25d才开始形成愈伤组织 。各处理中 , 3%蔗糖的诱导率最高 ,为 59.69%。转入光
培养 10d后 ,不同处理诱导的愈伤组织质地和颜色呈现差异 ,其中较高浓度的蔗糖 、葡萄糖及淀粉诱导形
成的愈伤组织生活力较强 。
表 4　不同糖源种类与浓度对愈伤组织诱导的影响
Tab.4　 Effectofcarbonicsourcesandconcentrationsoncalusinduction
糖　源 浓　度(%)
愈伤组织诱导率(%)
重复 1 重复 2 重复 3 平均
愈伤组织开始
形成时间(d)
愈伤组
织颜色
愈伤组
织形态
蔗　糖 1 65.00 57.50 48.89 57.13aA 16 乳黄色 疏松颗粒状
3 67.14 60.83 51.11 59.69aA 14 黄绿色 致密颗粒状
5 33.00 30.00 26.67 29.89bB 17 黄绿色 致密颗粒状
7 28.00 25.83 23.33 25.72bB 17 黄绿色 致密颗粒状
葡萄糖 1 45.00 38.33 35.56 39.63bA 18 乳黄色 疏松颗粒状
3 48.33 42.50 44.44 45.09aAB 14 黄绿色 致密颗粒状
50.33 45.83 48.89 48.52aA 16 黄绿色 致密颗粒状
7 21.25 18.33 14.44 18.01cB 20 黄绿色 致密颗粒状
可溶性淀粉 1 10.00 7.50 7.78 8.43bBC 25 乳黄色 疏松颗粒状
3 17.50 13.33 14.44 15.09aA 26 乳黄色 疏松颗粒状
5 15.00 11.67 10.00 12.22aAB 26 黄绿色 疏松颗粒状
7 7.50 5.83 5.56 6.30bC 25 黄绿色 疏松颗粒状
2.6　不同激素配比对花药培养愈伤组织诱导的影响
以 B5为基本培养基 ,添加不同浓度(0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、2.0mg·L-1)的激素(6-BA、NAA、2、4-D、
KT)进行正交试验(见表 5),从表 5可以看出 , 4种激素的极差大小依次为 NAA>KT>6-BA>2、4-D,各
激素的最优组合及水平为 6-BA1.0mg·L-1、NAA2.0mg·L-1 、2、4-D0.5mg·L-1 、KT1.0mg·L-1 ,诱导率为
30.75%。
表 5　不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
Tab.5　Effectofdifferentplantgrowthregulatorsoncalusinduction
处理号 6-BA NAA 2, 4-D KT 愈伤组织诱导率(%)重复 1 重复 2 重复 3 平均 愈伤组织形态
1 0.5 0.5 0.5 0.5 18.00 15.56 25.38 19.65ab 疏松颗粒状
2 0.5 1.0 1.0 1.0 20.00 22.67 23.08 21.92ab 致密颗粒状
3 0.5 2.0 2.0 2.0 20.00 37.50 16.92 24.81ab 致密颗粒状
4 1.0 0.5 1.0 2.0 16.67 21.33 20.77 19.59ab 疏松颗粒状
5 1.0 1.0 2.0 0.5 20.67 22.86 23.07 22.20ab 致密颗粒状
6 1.0 2.0 0.5 1.0 36.00 19.33 36.92 30.75a 疏松颗粒状
7 2.0 0.5 2.0 1.0 13.33 25.83 27.69 22.28ab 疏松颗粒状
8 2.0 1.0 0.5 2.0 25.33 15.00 13.08 17.80b 疏松颗粒状
9 2.0 2.0 1.0 0.5 30.67 24.67 35.38 30.24a 致密颗粒状
k1 22.13 20.51 22.73 24.03
k2 24.18 20.64 23.92 24.98
k3 23.44 28.60 23.10 20.73
R 2.05 8.09 1.19 4.25
21第 1期　 张绿萍 ,等:影响刺梨花药愈伤组织诱导因素的研究
2.7　培养条件对花药愈伤组织诱导的影响
将花药接种于添加 1.0mg·L-1 6-BA、2.0mg·L-1NAA的 B5培养基 ,分别进行光培养和暗培养 ,结果
见表 6。表 6表明 ,刺梨花药愈伤组织在黑暗条件下的诱导率是光条件下的 3倍 ,为 23.25%,与光培养存
在极显著差异 ,且早 11d开始形成愈伤组织 ,愈伤组织增殖速度快 ,表明暗培养有利于刺梨花药愈伤组织
的诱导 。
表 6　不同培养条件对愈伤组织诱导的影响
Tab.6　Efectofcultureconditiononcalusinduction
培养条件 接种花药数(枚) 愈伤组织形成时间(d) 愈伤组织诱导率(%) 愈伤组织颜色 愈伤组织形态
光培养 1025 32d 7.49bB 乳黄色 疏松颗粒状
暗培养 1350 21d 23.25aA 白　色 致密颗粒状
2.8　不同取材时间对花药愈伤组织诱导的影响
将不同时间采取的小孢子发育时期为中后期花药接种于添加 1.0 mg·L-1 6-BA、2.0mg·L-1NAA的
Ms培养基 ,结果见表 7。由表 7可见 ,愈伤组织开始发生的时间和诱导率有一定的差异 , 5月 24日采集的
花药 ,接种后 15d开始形成愈伤组织 ,且诱导率最高 ,为 48.89%。因此 ,尽管刺梨花期较长 ,由于不同时
间的花药对愈伤组织发生有明显的影响 ,故最适宜选择刺梨的盛花期(5月份)的花药。
表 7　取材时期对愈伤组织诱导的影响
Tab.7　Effectofsamplingdataoncalusinduction
时间(月 /日) 接种花药数(枚) 愈伤组织开始形成时间(d) 愈伤组织诱导率(%) 愈伤组织颜色 愈伤组织形态
4/24 175 22d 25.14 黄绿色 疏松颗粒状
4/30 180 23d 31.11 黄绿色 疏松颗粒状
5/6 180 18d 37.89 黄绿色 疏松颗粒状
5/12 180 18d 41.00 黄绿色 疏松颗粒状
5/18 180 15d 48.22 黄绿色 疏松颗粒状
5/24 180 15d 48.89 黄绿色 疏松颗粒状
5/30 180 17d 34.22 黄绿色 疏松颗粒状
6/5 180 20d 17.78 黄绿色 疏松颗粒状
6/11 180 23d 16.67 黄绿色 疏松颗粒状
6/17 180 25d 11.67 黄绿色 疏松颗粒状
6/23 180 25d 8.89 黄绿色 疏松颗粒状
6/29 180 30d 6.11 黄绿色 疏松颗粒状
7/18 600 36d 3.5 黄绿色 疏松颗粒状
3　讨论
3.1　通过对影响刺梨花药愈伤组织形成的各因子的研究 ,筛选出了各影响因素的最佳组合:以刺梨品种
贵农 1号盛花期且小孢子发育为单核期的花药为试材 , Ms为基本培养基 , 3%的蔗糖为糖源 , 1.0mg·L-1
6-BA+1.0mg·L-1 KT+2.0mg·L-1NAA+0.5mg·L-1 2、4-D为激素组合 ,置于黑暗条件下培养最有
利于刺梨花药愈伤组织的诱导 。
3.2　本试验中 ,刺梨花药培养的最佳诱导时期为单核期 ,这是因为大多数园艺作物的花粉处于单核期时
积累的淀粉少 ,有利于花粉愈伤组织或胚状体的诱导 [ 12 -13] 。已有研究表明 ,不同的基本培养基对植物花
药培养影响较大 ,改良 B5培养基适宜葡萄花药愈伤组织的诱导和植株再生 [ 14] , 而适宜枣树花药培养的
基本培养基为 Ms[ 15] ,而本研究以 B5为基本培养基有利于刺梨花药愈伤组织的诱导 ,但在该基本培养基
中诱导的愈伤组织 ,在转至光下后 ,愈伤组织不转绿 ,缺少活力 ,这一现象可能是 B5高浓度的有机物利于
22 山 地 农 业 生 物 学 报 　2009年
刺梨花药愈伤组织的诱导 ,而其低浓度的无机盐不利于刺梨花药愈伤组织的转绿 ,也可能是由于 B5和 Ms
培养基中硝态氮和氨态氮的不同比例及含量所引起 [ 16-17] 。本试验以淀粉为糖源的诱导率低 ,启动时间
慢 ,这可能是由于淀粉是大分子化合物 ,不能被培养细胞直接吸收利用 ,必须先分解形成可供细胞吸收利
用的小分子化合物葡萄糖和果糖;也或许因刺梨花药所含酶的种类和活力也不太利于淀粉的有效分解 ,因
此用淀粉作为糖源存在滞后期 。另外 ,较高浓度糖源诱导形成的愈伤组织具有较强活力 ,可能是因为较多
的糖含量 ,使培养基到培养后期依然含较愈伤组织生长所需的营养 。
3.3　尽管通过本试验建立了愈伤组织诱导技术体系 ,但要想获得刺梨单倍体植株或育种新材料 ,还必须
进行花药愈伤组织的起源 、分化以及倍性检测等的进一步研究。
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