全 文 ：长白山三种赤杨根瘤内 Frankia 基因
多样性的 REP分析＊
唐晓萌1 　代玉梅1　熊　智2　曹　军1＊＊
(1 中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016;2西南林学院 ,昆明 650224)
摘　要　利用 REP-PCR方法研究了长白山不同海拔处 3 种赤杨根瘤内 Frankia 菌基因多样
性。结果表明 , 赤杨根瘤内 Frankia 菌存在丰富的基因多样性。宿主和海拔因素共同影响长白
山赤杨属 Frankia 菌的基因多样性:东北赤杨 Frankia 菌的宿主专一性很强 ,西伯利亚赤杨和
色赤杨的 Frankia 菌的有较近的亲缘关系。 不同海拔的同种宿主共生的 Frank ia 菌基因类型
不同 , 相同海拔的西伯利亚赤杨和色赤杨的 Frankia 菌出现宿主混乱现象。
关键词　基因多样性 , 赤杨 ,海拔 , Frankia , REP
中图分类号　S182　　　文献标识码　A　　　文章编号　1000-4890(2004)03-0068-04
Genetic diversity analysis of Frankia strains in nodules of three Alnus species from Changbai
Mountain by REP fingerprinting.TANG Xiaomeng 1 , DAI Yumei1 , XIONG Zhi2 , CAO Jun1＊＊
(1 Institute of Applied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang 110016 , China;2Southwest
Forestry College , Kunming 650224 , China).ChineseJournal of Ecology , 2004 , 23(3):68～ 71.
The genetic diversity of the Frankia strains in the nodules of Alnus tinctoria , A.mandshurica and
A .sibirica growing at different altitude in Changbai Mountain w as studied by REP-PCR fingerprint-
ing.The REP-PCR fingerprint patterns revealed that uncultured Frankia strains tested had a high
genetic diversity.Host and altitude factors influenced the genetic diversity.Frank ia strains from A .
mandshurica showed g reater specialization toward the host , and Frankia stains from A .sibirica and
A .tinctoria had a closer affinity.The Frankia stains from the same alder distributing at different al-
titude belonged to different REP patterns , and the Frankia stains from A .sibirica and A.tinctoria
at the same altitude showed promiscuity.
Key words　genetic diversity , Alnus , altitude , Frankia , REP.
＊国家重点基础研究发展规划项目(NO.001CB1089)、中国科学院
沈阳应用生态研究所创新项目(C11AG-SCXZY0106)及中国科学
院长白山森林生态系统定位研究站资助。
＊＊通讯作者
收稿日期:2003-04-30　　改回日期:2003-07-02
1　引　言
Frankia 菌是一类可与 8 科 24 属 200 多种非
豆科植物共生结瘤固氮的放线菌[ 3] 。Frankia 菌基
因多样性与宿主植物之间的关系是近几年Frankia
菌研究的热点之一 ,了解二者之间的关系将有助于
揭示 Frank ia菌的起源 ,进化及系统发育 。但目前
关于赤杨与 Frankia 菌基因多样性的关系的研究多
处在宿主属的水平上 ,鲜有在宿主种水平上的相关
报道 。
东北长白山有多种赤杨分布[ 1] ,从而为在赤杨
种的水平上研究 Frankia 菌的基因多样性提供了便
利条件。本文以长白山不同海拔处 3种赤杨根瘤内
Frankia 菌为研究对象 , 利用 REP-PCR(REP ,
Repetitive Extragenic Palindromic)方法分析了宿主
及海拔对 Frankia 菌多样性的影响。
2　研究地区与方法
2.1　采集地自然概况
长白山位于吉林省东南部 ,属于受季风影响的
温带大陆性山地气候 ,有明显的垂直气候变化带。
年均气温在-7 ～ 3 ℃之间 ,年日照时数不足 2 300
h ,无霜期 100 d左右。长白山地貌为典型的火山地
貌区域 ,随海拔自下而上主要由玄武岩台地 、玄武岩
高原和火山锥体三大部分构成 。区内海拔高差近 2
000m 。其气候 、土壤 、植被等环境因子呈明显的垂
直带谱分布 。本文所研究的样品采自于长白山北坡
生态学杂志 Chinese Journal of Ecology　2004 , 23(3):68 ～ 71　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　
DOI :10.13292/j.1000-4890.2004.0083
的各典型带谱内 。
2.2　实验材料
采集东北赤杨 、西伯利亚赤杨及色赤杨的根瘤
样品 21个(表 1)。样品晾干后于-20 ℃保存备用 。
表 1　根瘤样品
Tab.1　Samples of nodules
样品代号 海拔(m) 宿主 纬度 经度
Am01 2034 东北赤杨 42°03′ 128°04′
Am02 2023 东北赤杨 42°03′ 128°04′
Am03 2023 东北赤杨 42°03′ 128°04′
Am04 1920 东北赤杨 42°02′ 128°04′
Am05 1928 东北赤杨 42°02′ 128°04′
Am06 1922 东北赤杨 42°03′ 128°04′
Am07 1707 东北赤杨 42°04′ 128°04′
Am08 1274 东北赤杨 42°08′ 128°08′
Am09 1270 东北赤杨 42°08′ 128°08′
As01 755 西伯利亚赤杨 42°24′ 128°06′
As02 1699 西伯利亚赤杨 42°04′ 128°04′
As03 1699 西伯利亚赤杨 42°04′ 128°04′
As04 1045 西伯利亚赤杨 42°14′ 128°10′
As05 1262 西伯利亚赤杨 42°08′ 128°08′
At01 1700 色赤杨 42°04′ 128°04′
At02 1038 色赤杨 42°14′ 128°10′
At03 1040 色赤杨 42°14′ 128°10′
At04 1262 色赤杨 42°08′ 128°08′
At05 1287 色赤杨 42°08′ 128°08′
At06 748 色赤杨 42°24′ 128°06′
At07 749 色赤杨 42°24′ 128°06′
Am:东北赤杨(Alnus mandshur ia), As:西伯利亚赤杨(Aln us sibri-
ca), At:色赤杨(Alnus t inctor ia).
2.3　实验方法
DNA的提取和纯化:采用 CTAB法[ 4] 。取-20
℃冷藏的根瘤 3 ～ 5个 ,洗涤干净后 ,用 75%乙醇表
面消毒 10 min。将根瘤磨碎 ,加入 CTAB提取液 1
mL ,65 ℃孵育 2 h。离心后 ,上清液用氯仿:异戊醇
(24∶1)抽提 2次 , 1/10体积乙酸钠和 1倍体积冰乙
醇沉淀 DNA。DNA 沉淀用 70%、80%、100%的乙
醇洗涤 3 次后去离子水溶解。小量胶回收试剂盒
(上海华舜公司)纯化 DNA 粗提物 ,纯化后的 DNA
-20 ℃储存备用。
PCR 扩增:引物为 DRIR 5′-GCGGCAACG-
GCGGCAACGGCGG-3′[ 5] 。50μl反应体系中含 10
×PCR Buf fer 5 μl , 250 μmol·L-1MgCl2 , 200μmol·
L -1 dN TP ,引物 2 μmol·L-1 , TaqDNA 聚合酶 2U
(TaKaRa公司),DNA模板 2μl ,2.5μl瘤DMSO ,补
充水到 50μ1。在 PCR扩增仪(Whatman 公司的梯
度扩增仪)上 95 ℃预变性 6 min 后 , 94 ℃变性 1
min , 52 ℃退火 1 min , 65 ℃延伸 8 min ,共 35个循
环 ,最后在 65 ℃下延伸 15 min。PCR产物-20 ℃
储存备用。
丙烯酰胺凝胶电泳:采用 7.5%聚丙烯酰胺凝
胶垂直电泳 ,凝胶银染[ 4] 。
电泳图谱的数值分析:用软件 Cross Checker
2.91转化为二元性状编码距阵。用 PHYLIP3.0软
件处理距离距阵 ,构建非加权配对算术平均法[ 4]树
状图。用软件 TREEV IEW转化为图形 。
3　结果与分析
3.1　电泳图谱
利用特异引物 DRIR对采集的 Frankia 菌基因
组进行 PCR扩增 ,得到重复性好 、稳定清晰 、分子量
在 700 ～ 2500 bp的 REP 指纹条带(图 1)。
图 1　赤杨共生 Frankia菌 REP指纹图谱
Fig.1　REP fingerprint patterns of Frankia in the nodules of Alnus
M 为 100bp ladder DNA:3000 , 2000 , 1500 , 1030, 900 , 800 , 700 , 600 , 500 , 400 , 300 , 200 , 100bp.1～ 21分别为样品 Am01 ,Am02 , Am03 ,
Am04 , Am05 , Am06 ,Am07 , Am08 , Am09 , As01 , At01 , As02 , As03 , As04 , At02 , At03 , At04 , As05 , At05 , At06 , At07.Lane M , 100 bp DNA ladder
Marker 3000 , 2000 ,1500 , 1030 , 900 , 800 , 700 , 600 , 500 , 400 , 300 , 200 , 100bp.The pat tern in lane 1 ～ 21is samples Am01 , Am 02 , Am 03 , Am04 ,
Am05 , Am06 , Am07 ,AM08 , Am 09 ,As01 , At01 , As02 , As03 , As04 ,At02 ,At03 ,At04 ,As05 , At05 , At06 , At07.
69唐晓荫等:长白山三种赤杨根瘤内 Frankia 基因多样性的 REP分析
3.2　电泳谱带的聚类分析
用PHYLIP3.0软件分析电泳图谱(图 1)得到
的聚类分析树状图(图 2)。
电泳图谱表明各 Frankia 菌图谱带型相似率平
均为 0.4左右。低的相似性表明这些菌间有显著遗
传差异 ,长白山赤杨 Frankia 菌存在丰富的基因多
样性 。为了便于分析 ,以相似性 72%作为界定线 ,
将样品分为 5个基因类型组(表 2)。
图 2　Frankia菌 REP-PCR 的 UPGMA树状图
Fig.2　UPGMA based on the REP fingerprint patterns of Frankia
表 2　赤杨 Frankia菌的 REP组
Tab.2　Distribution of Alnus-infective Frankia REP groups
组 宿主 样本数
Ⅰ 西伯利亚赤杨 4
色赤杨 6
Ⅱ 东北赤杨 3
Ⅲ 西伯利亚赤杨 2
Ⅳ 东北赤杨 4
Ⅴ 东北赤杨 2
3.3　宿主与 Frank ia菌多样性的关系
REP 图谱显示 ,所有样品在 980 bp处出现共有
带 ,为侵染赤杨属 Frankia 菌的特征带。东北赤杨
Frankia 菌被分为 3组 ,各组在 680 bp 、1 400 bp 处
享有共有带 ,这些带视为东北赤杨 Frankia 菌的特
征带 。色赤杨与西伯利亚赤杨的 Frank ia菌享有相
似 REP 图谱 , 在 920 bp 处出现共有带 。色赤杨
Frankia 菌的特征带约为 1 250 bp。西伯利亚
Frankia 菌 ,特征带约为 700 bp ,分为 2 组 ,其中的 I
组的 Frankia菌与色赤杨的Frankia 菌共同享有大
多数的条带 ,显示了较近的亲缘关系。
树状图分析显示 , 所有侵染东北赤杨的
Frankia菌的 3个组(Ⅱ 、Ⅳ、Ⅴ)中不包含侵染色赤
杨与西伯利亚赤杨的 Frankia 菌 ,显示出东北赤杨
Frankia 菌较强的宿主专一性。侵染西伯利亚赤杨
和色赤杨 Frankia 菌可能专一性较差 ,而属于同一
组(Ⅰ)。这可以说明来源于不同宿主的 Frank ia菌
的对宿主专一性的程度不同 。
3.4　海拔与 Frankia 菌多样性的关系
分别采自 3个不同海拔高度的东北赤杨样品有
3种不同的 REP 基因类型。位于海拔 1 900 m 左右
的 4个样品同属于Ⅳ组 ,采自 1 270 m 处的 Am 08 、
Am 09 属另一分支(Ⅴ组), 组 Ⅱ 的东北赤杨
Frankia菌表现出完全相同的 REP 图谱 ,均采自海
拔 2 000 m 以上 ,因此侵染东北赤杨的 Frankia 菌
基因类型随海拔的不同而不同。色赤杨样品的基因
型也基本表现出上述规律 ,相同(相近)海拔的样品
的有相同的 REP 图谱 。海拔 1 699m 的西伯利亚赤
杨的 2 个样品属同一组 ,而其它分布在 1 262 m 、
1 045 m和 755 m 的西伯利亚赤杨的样品则与有相
似海拔高度的色赤杨样品分为了一组 ,尤其值得注
意的是 1 262m 的 As 05和 1287 m 的At 05有完全
70　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生态学杂志　第 23卷　第 3期　
相同的 REP 图谱 。因此同种宿主内的 Frankia 菌
的 REP 基因类型与海拔有密切关系 ,而相同或相似
的海拔使得西伯利亚赤杨与色赤杨的 Frank ia菌间
表现出明显的宿主混乱相现象 。
东北赤杨 Frankia 菌的宿主专一性很强 ,西伯
利亚赤杨和色赤杨的 Frankia 菌的有较近的亲缘关
系。同种宿主 、相同海拔的 Frank ia 菌有相同的基
因类型 , 相同海拔的西伯利亚赤杨和色赤杨的
Frankia 菌出现宿主混乱现象 。因此 ,宿主和海拔
因素共同影响长白山赤杨 Frankia 菌的基因多样
性。
4　讨　论
本文得出的宿主影响长白山 Frank ia菌基因多
样性结论与 Rouvier[ 10] 、Murry[ 7]等的结论相一致 。
但他们的研究只在宿主属的水平上确定了宿主与
Frankia 菌之间有牢固的关系 ,本文则进一步在宿
主种水平上反映出 Frankia菌基因类型与宿主之间
的关系。Nancy 等[ 8]用 IGS PCR-RFLP 方法分析了
Ceanothus 根瘤内Frankia 菌的基因多样性 ,认为海
拔而不是宿主决定 Frankia 菌的分布 ,而我们的实
验则发现海拔与宿主赤杨同时影响着 Frank ia菌的
遗传多样性。
实验发现色赤杨与西伯利亚赤杨 Frank ia菌享
有相似 REP 基因型 ,吴少惠[ 2]的研究也发现色赤杨
和西伯利亚赤杨的 Frank ia 菌享有相类似的
ARDRA 图谱 ,二者之间在基因类型上表现出了高
度相似性 , 因此推测色赤杨与西伯利亚赤杨的
Frankia 菌可能有相同起源 , 与其它种赤杨的
Frankia 菌相比 ,分化时间相对较短 ,有较近的亲缘
关系。关于这一点 ,我们还需要对相关的化石资料
及宿主植物基因型进行研究才能加以证实。
宿主植物在一定的生态条件下 ,选择特异基因
类型的 Frankia 菌 ,这一选择过程是一个逐渐的互
惠过程。海拔对 Frankia 菌基因类型的影响表明生
态环境中各因子也参与了宿主植物对菌的选择过
程 ,所以导致相同的生态条件下 ,相同或不同宿主选
择相同了基因类型 Frankia 菌 ,这种选择过程中具
体的作用机制还有待研究 。
目前 , Frankia 菌属的分类指标较明确 ,但由于
已被分纯的菌株还不多 , 因而种的标准尚未确立。
本研究利用 REP -PCR方法指出 Frank ia 菌基因
类型 与宿主 关系 密切 , 支 持了 Fernandez[ 6] 、
Nazaret[ 9]等提出的宿主植物源是 Frankia 菌定种
分群的重要因素的主张 ,这也预示了 REP-PCR技
术在 Frankia 菌分类鉴定中的应用前景 ,将其与传
统的形态学分类相结合 , 将更可靠的反映出
Frankia 菌的系统发育关系。
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作者简介　唐晓萌 , 女 , 1978 年生 ,硕士研究生 ,主要从事结
瘤固氮的放线菌分子生态学方面的研究.E-mail:manw rong
@sina.com
责任编辑　王　伟
71唐晓荫等:长白山三种赤杨根瘤内 Frankia 基因多样性的 REP分析