全 文 ：长白山赤杨根瘤内 Frankia 的基因多样性分析1)
代玉梅　韩士杰　唐晓萌　张成刚
(中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 , 110016)
　　摘　要　采集长白山自然保护区北坡东北赤杨 、西伯利亚赤杨 、色赤杨根瘤样品 21 个 , 对根瘤内 Frankia DNA
的 16S-23S rDNA和 nifD-nifK 两个基因间隔区段(IGS)进行 PCR-RFLP分析 ,研究其基因多样性。结果表明:与
赤杨共生的 Frankia 菌存在丰富的基因多样性 , 基因类型与宿主种型关系密切。东北赤杨对 Frankia 的特异性较
高 , 与西伯利亚赤杨和色赤杨共生的 Frankia 菌有较近的亲缘关系。上述结果说明 Frankia 菌与其宿主赤杨间存在
着协同进化。
关键词　赤杨;Frankia;基因多样性;协同进化
分类号　Q939.13
Genetic Diversity of Frankia in Nodule of Alnus in Changbai Mountain Revealed by IGS PCR-RFLP/Dai Yumei , Han
Shijie , Tang Xiaomeng , Zhang Chenggang(Institute of Applied Ecology , Chinese Academy of Sciences , Shenyang 110016 , P.
R.China)// Journal of Northeast Forestry University.-2003 , 31(6).-6～ 8
21 nodule samples were collected from Alnus mandshurica , Alnus sibirica , and Alnus tinctoria growing in Changbai Moun-
tain.DNA was extracted directly from nodules , and its two target DNA regions that encode16S-23S rDNA intergenic spacer
(IGS)and nifD -nifK IGS were studied by PCR-RFLP.The results indicated that rich genetic diversity existed in Alnus-in-
fective Frankia in Changbai Mountain , and the genotypes were closely related to Alnus species.Alnus mandshurica showed
greater specialization towards Frankia , and Frankia strains that infected Alnus sibirica and Alnus tinctoria had more close rela-
tionship.Above results suggest the co-evolution between Frankia and its host plants Alnus.
Key words　Alnus;Frankia;Genetic diversity;Co-evolution
　　Frankia—非豆科植物(放线菌根植物)是一类重要的固
氮共生体系 ,能够在干旱 、沙丘 、湿地 、沼泽 、冻原[ 1]等多种环
境中生存。研究该共生体系在自然状况下的多样性 ,将有助
于人们对其起源与进化的认识 , 并可为充分保护和利用这类
固氮资源 、提高其固氮效率 、扩大生物固氮种类[ 2]等实践提供
依据。桦木科赤杨属植物是一类古老的放线菌根植物 , 以往
对 Frankia 纯培养的研究表明 , 与其共生的 Frankia 有较高的
基因多样性[ 3] 。东北地区是我国桦木科植物的一个多样化中
心[ 4] ,为赤杨 Frankia 基因多样性的研究提供了便利条件。
文中采集长白山自然保护区北坡分布较广的东北赤杨
(Alnus mandshurica)、西伯利亚赤杨(Alnus sibirica)和色赤杨
(Alnus tinctoria)根瘤样品 21 个 , 从中直接提取 Frankia DNA ,
对其 16S-23S rDNA 基因间隔区(intergenic spacer , IGS)和 nifD
-nifK IGS两个目的区段进行 PCR-RFLP分析 , 旨在从宿主
种型水平上探讨自然状况下赤杨 Frankia 基因多样性。
1　材料与方法
1.1　材料
采集地自然概况:位于吉林省的长白山自然保护区 ,是我
国面积最大 、自然环境和森林植被保护最完整的自然保护区 ,
是公认的研究生物多样性的理想基地[ 5] 。区内海拔高度差
1)国家重点基础研究发展规划资助项目(No.001CB1089);中国
科学院长白山森林生态系统定位研究站资助项目;中国科学院沈阳应
用生态研究所创新项目(C11-AG-SCXZY0106)。
第一作者简介:代玉梅 ,女 , 1976年 2月生 ,中国科学院沈阳应用
生态研究所 ,现就读于中国科学院研究生院 ,博士研究生。
收稿日期:2003年 9月 8日。
责任编辑:李金荣。
近 2 000 m ,其气候 、土壤 、植被等环境因子呈明显的垂直带谱
分布[ 6] , 本研究样品采集地分布在不同海拔高度的各垂直带
内(见表 1)。
根瘤:采集的 21 个根瘤样品 , 经晾干后 , -20℃储存备
用。
1.2　方法
1.2.1　DNA的提取和纯化
取 0.1 g瘤样 , 研碎 , CTAB 法提取 DNA后 , 用 PEG-NaCl
纯化 , -20℃储存。详细步骤见文献[ 7] 。
1.2.2　PCR扩增
选择侵染 Alnus-Casuarina 的Frankia 的特异性引物 FG-
PS989ac(5′-GGGGTCCGTAAGGGTC -3′)和 FGPL132′(5′-
CCGGGTTTCCCCATTCGG- 3′)扩增 16S -23S rDNA IGS , 扩增
片段包括 16S 的 3′端 、IGS、23S 的 5′端[ 8] 。选择 Frankia 的特
异性引物 FGPD807-85(5′-CACTGCTACCGGTCGATGAA-3′)
和FGPK333′-355(5′-CCGGGCGAAGTGGCT -3′)对 nifD -
nifK IGS 区段进行扩增 ,扩增片段包括 nifD 的 3′端 、IGS 、nifK
的 5′端[ 9] 。
PCR扩增反应在Whatman 公司温度梯度扩增仪上进行。
50 μL体系中包括:DNA模板 5 ～ 10 ng ,Mg2+2.5 mmol/ L , dNTP
0.2 mmol/L , 引物各 0.2 μmol/ L , exTaqDNA 聚合酶 1.5 U
(TaKaRa公司)。 PCR反应在 95℃预变性 5 min 后 , 进行以下
35 个循环:95℃变性 30 s , 58℃[ nifD -nifK IGS] 或者 50℃[ 16S
-23S rDNA IGS]退火30 s , 72℃延伸 2 min ,最后在 72℃下延伸 5
min。0.8%琼脂糖电泳检测 ,产物于-20℃储存备用。
1.2.3　限制性内切酶酶切
5 μL(nifD-nifK IGS)或 10μL(16S-23S rDNA IGS)PCR产
物进行 HaeⅢ和 AfaⅠ(TakaRa公司)双酶切 12 h ,酶切反应严
格按照供应商提供的说明书进行。取 5μL酶切产物在 BIO-
RAD Mini-PROTEAN Ⅱ Vertical Gel System 上进行15%聚丙烯
　　第 31卷 第 6 期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.31 No.6
2003年 11 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Nov.2003
DOI :10.13759/j.cnki.dlxb.2003.06.002
酰胺(PAG)电泳 , 电泳后胶银染。
1.2.4　银染电泳图谱的数值分析
胶片在 Bio-RAD Gel Doc 1000 自动成像仪上拍照 , 用
Quantity one软件判读酶切条带的分子量(bp)。当酶切图谱中
某一酶切条带出现时记为 1 , 缺失则记为 0 , 从而建立原始谱
带距阵。用 Phytool1.2 Jaccard联合系数计算出每两个样品间
的遗传距离 , 用 PHYLIP3.0 的非加权配对算术平均法(Un-
weight Pair Group Method Using Arithmetic Average , UPGMA)构建
系统树 , 由 Treeview 转化成图形。
表 1　长白山北坡自然概况及采集的样品
海拔/m 坡度/(°) 土壤 植　　被 采样地海拔/m 样品
2100以上 >40 苔原 地衣 、苔藓 无赤杨分布
2100～ 1800 >40 草甸土 赤杨纯林与岳桦林伴生 2030 ＊Am01、Am02 、Am03 Am04
1900 Am05、Am06 、Am07
1800～ 1100 10 针叶林土 云冷杉为主 、伴生岳桦及长白落叶松 1700 Am08 、＊As01 、As02
1200 Am09 、Am10、As03、As04、＊At01
1100以下 平缓 暗棕壤土 阔叶红松林为主 1000 As05、＊At02 、At03
700 As06 、At04、 At05
　　＊Am , 东北赤杨(Alnus mandshurica);As ,西伯利亚赤杨(Alnus sibirica);At ,色赤杨(Alnus tinctoria)。
2　结果与分析
2.1　16S-23S rDNA IGS 的 PCR-RFLP分析
样品的 16S-23S rDNA IGS PCR产物 , 经 0.8%琼脂糖电
泳分析 , 均显示长度为 1 100 bp 左右的单一片断。 PCR产物
经 HaeⅢ和 AfaⅠ双酶切后 ,有相同酶切带型的样品 ,定义为
一种 rrn-type , 21 个样品可区分出 14 种 rrn-type(见表 2 和
图 1)。
表 2　样品的酶切带型
树种 根瘤样品 rrn-type nif-type Genotype
东北赤杨
Am01 R1 N1 Ⅰ
Am02 R1 N1 Ⅰ
Am03 R2 N1 Ⅱ
Am05 R2 N1 Ⅱ
Am04 R3 N2 Ⅲ
Am06 R4 N3 Ⅳ
Am07 R4 N3 Ⅳ
Am08 R4 N3 Ⅳ
Am09 R5 N3 Ⅴ
Am10 R5 N3 Ⅴ
西伯利亚赤杨
As01 R6 N4 Ⅵ
As02 R6 N5 Ⅶ
As03 R7 N6 Ⅷ
As04 R8 N6 Ⅸ
As05 R9 N7 Ⅹ
As06 R10 N8 Ⅺ
色赤杨
At01 R11 N9 Ⅶ
At02 R12 N10 Ⅷ
At03 R12 N10 Ⅷ
At04 R13 N10 ⅪⅤ
At05 R14 N11 Ⅹ Ⅴ
　　注:R代表 rrn-type , N代表 nif-type;Genotype 是由两个 IGS区
段的 PCR-RFLP 联合分析后确定的基因型。
图 1　16S-23S rDNA IGS的 HaeⅢ和 Afa Ⅰ的双酶切带谱
注:M 为GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder (Fermantas);R1～ R14为各 16S
-23S rDNA IGS酶切带型的代表样品 ,从左至右依次为 Am04 、Am01 、
Am03 、Am05 、Am09 、Am08 、As01 、As03、As04、At01 、At04 、As06 、At05、At02 、
At03、As05
2.2　nifD-nifK IGS 的 PCR-RFLP分析
样品的 nifD-nifK IGS 的 PCR产物, 经 0.8%琼脂糖电泳
分析后 ,显示为1 200 bp 左右的单一片断。经 HaeⅢ和 AfaⅠ双
酶切后 ,区分出11 种 nif-type(见表2 和图2)。
图 2　nifD-nifK IGS的 HaeⅢ和 Afa Ⅰ的双酶切带谱
注:M 为GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder(Fermantas);N1～ N11为各 nifD
-nifK IGS酶切带型的代表样品 ,从左至右依次为 Am04 、Am01 、As04 、
At01、Am03 、At03 、At02 、As05 、As01 、As02 、As06 、At05
结合两个 IGS 区段的 PCR-RFLP的实验结果 , 可得到 15
种基因型(Genotype)的 Frankia 菌株。这进一步证实了在自然
状况下与赤杨共生的 Frankia 存在着丰富的基因多样性。
2.3　酶切带型的聚类分析
为了更准确地反映长白山赤杨 Frankia 的亲缘关系 , 将
rrn-type 与 nif-type 的 25 种酶切带型所涉及的 45 种酶切
条带进行聚类分析 , 构建UPGMA聚类图(见图3)。聚类图
7第 6期　　　　　　　　　　　　代玉梅等:长白山赤杨根瘤内 Frankia 的基因多样性分析　　　　　　
的 15个独立分支代表上述 15 种基因型。
图 3　赤杨 Frankia 的 16S-23S rDNA和 nifD-nifK IGS PCR-RFLP联
合分析的 UPGMA聚类图
图3 显示 ,在 75%左右相似水平①处 ,所有与东北赤杨共
生的 Frankia 菌株聚为一类 , 西伯利亚赤杨 Frankia 菌株与色
赤杨 Frankia 菌株聚为另一类;在 80%左右相似水平②处 , 除
样品 At01 和 As05 外 , 西伯利亚赤杨 Frankia 菌株与色赤杨
Frankia 菌株又可以分别聚为 2 个亚类。上述结果表明:共生
Frankia 的基因类型与其宿主种型关系密切 , 侵染西伯利亚赤
杨与色赤杨的 Frankia 菌株有相对较近的亲缘关系。At01 与
As05 没有与宿主相同的其它样品聚为一类 ,却分别与来源于
同一采样点(相同的环境条件)、宿主不同的样品聚为一类 ,这
可进一步说明侵染西伯利亚赤杨与色赤杨的 Frankia 菌有较
近的亲缘关系 ,在相似的自然条件下 , 其遗传相似性也较大。
此外 , 以 93%左右相似水平③为分界 , 与东北赤杨共生的
Frankia 菌株仅可分为 2 类 , 而西伯利亚赤杨的 Frankia 菌株
可分为 5类 , 色赤杨的 Frankia 菌株分为 3 类 , 表明东北赤杨
对 Frankia 的特异性更高 ,与更少数基因类型的 Frankia 菌株
共生 , 而西伯利亚赤杨和色赤杨对 Frankia 特异性较低 , 可与
遗传距离较大的 Frankia 菌株共生。
3　讨论
已有研究表明 , 放线菌根植物与 Frankia 存在一定的协同
进化 , 分化较晚的宿主植物选择较窄范围的 Frankia , 而较为
原始的植物则存在更多的宿主混乱性 ,这种协同进化是向着
减少混乱性和增加特异性的方向发展[ 10] 。 桦木科赤杨(桤
木)属植物依据花序的出现期 、开花期 、种子的成熟期 、芽鳞的
数目等特征可划分为 4 组(生活型)[ 4]　:蒙自桤木组 、单序组 、
桤木组和桦桤组。 组的划分反映了该属植物分化的先后顺
序。前两组较为原始 , 我国仅在四川 、贵州 、云南有分布;桤木
组是现代桤木属植物中最繁盛的组 ,分布较广;桦桤组则是桤
木属中最进化的一个组 , 仅有少数几种。根据上述划分标准
及这 3 种赤杨的形态特征[ 11] , 东北赤杨应属桦桤组较高等 ,
西伯利亚赤杨与色赤杨属桤木组 。同一生活型有较近的亲缘
关系。东北赤杨对 Frankia 特异性更强 , 而侵染西伯利亚赤杨
与色赤杨的 Frankia 之间的亲缘关系较近 , 符合上述协同进化
历程 , 从而揭示 Frankia 与其宿主赤杨间存在着协同进化。
参　考　文　献
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