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复合酶法提取苦瓜叶总黄酮的研究
王文渊1，周振华1，龙红萍2
(1. 湖南永州职业技术学院，永州 425100;
2. 中南大学药学院，长沙 410013)
摘 要:以苦瓜叶为原料，采用复合酶法从苦瓜叶中提取黄酮。通过对单一酶和复合酶辅助提取的实验
效果比较，得到了纤维素酶和果胶酶组成的复合酶为最佳复合酶，通过单因素试验和正交试验确定复合酶提
取苦瓜叶中总黄酮的最佳工艺条件:纤维素酶浓度为 0. 8mg /mL，果胶酶浓度为 0. 5mg /mL的情况下，提取温
度为 55℃、提取介质 pH4. 5 的条件下酶解 140min，苦瓜叶总黄酮的提取率可达到 3. 13%，与直接醇提工艺相
比较，总黄酮提取率提高了 30%以上。对苦瓜叶中黄酮有效成分进行提取研究，为合理有效利用苦瓜叶这一
废弃物提供参考依据，具有重要的理论意义和实际应用价值。
关键词:复合酶;苦瓜叶;总黄酮;提取
中图分类号:TS201. 2 + 5 文献标识码:A 文章编号:1006 － 2513(2011)04 － 0107 － 06
Study on extraction of total flavonoids from leaves of
momordica charantia L. by compound enzymes
WANG Wen-yuan1，ZHOU Zhen-hua1，LONG Hong-ping2
(1． Hunan YongZhou Vocational Technical college，Yongzhou 425000;
2． School of Pharmacy，Central South University，Changsha 410013)
Abstract:Taking leaves of Momordica Charantia L． as material，and extracting the total flavonoids from it by com-
pound enzymes． The catalytic effect was compared between single enzymes and compound enzymes，the result showed
that the best composition of compound enzymes was cellulase and pectolase． Based on the single factor tests and orthog-
onal experiments，the optimum conditions by compound enzymatic treatment were as follow:amount of compound en-
zyme were 0. 8mg /mL cellulase and 0. 5mg /mL pectinase，enzymatic temperature 55℃，enzymatic treatment time for
140 min and pH value 5. 0． On this condition，the extraction rate of flavonoids could get up to 3. 13% ． Compared with
extraction of alcohol，the extraction rate was increased by over 30% . Study on extracting the total flavonoids from the
leaves of Momordica Charantia L． it provide reference information for reasonable and effective use，have important the-
oretical and practical significance．
Key words:total flavonoids;leaves of momordica charantial．;enzymes;extraction
苦瓜 (Momordica Charantia L．)是葫芦科苦
瓜属植物，又名凉瓜，性味苦寒，药食兼用，具
有消暑解热、明目解毒、滋养强壮等作用［1］，因
此深受人们欢迎，在我国各地均有种植。研究表
明，苦瓜的果实和叶中富含黄酮［2］，苦瓜黄酮有
多种生理和药理活性，如抗癌防癌，降血糖、血
收稿日期:2011 － 04 － 01
作者简介:王文渊 (1969 －) ，男，副教授，从事天然活性成分的分离研究与教学。
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脂和增强免疫力、改善睡眠等功效［3］，因此可用
来治疗心脑血管疾病。黄酮类化合物还是一种天
然的抗氧化剂，具有抗氧化和清除自由基抗衰老
作用，已成为人类膳食中的一种不可或缺的抗氧
化营养因子［4 － 6］;也可用作为食品甜味剂和食用
色素的天然添加剂［7］，在现代化食品工业中发挥
着越来越重要的作用。
目前，对苦瓜中的多糖、皂苷等生物活性成
分研究报道的较多，而对苦瓜中黄酮类物质研究
报道的较少。酶法技术以其高效、无毒、反应条
件温和等优点在生物活性成分的提取中得到了广
泛的应用［8］，有关酶法提取苦瓜叶中黄酮类物质
的研究鲜见报道。本实验探索采用复合酶法对苦
瓜叶进行酶解处理，并对酶解提取工艺条件进行
优化，以期获得较高的总黄酮提取率，为充分利
用苦瓜叶中的生物活性物质—苦瓜黄酮，提供一
定的理论基础和指导。
1 实验部分
1. 1 材料与试剂
苦瓜叶，自采，经漂洗，自然晾干，于 65℃
烘干，粉碎过 60 目筛后置干燥器中备用;芦丁对
照品 (中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所，批 号:
100080) ;纤维素酶 (40000μ / g，山东隆大生物
公司) ;果胶酶 (300000μ / g，山东隆大生物公
司) ;木瓜蛋白酶 (50000μ / g，广西科学院生物
研究所) ;亚硝酸钠、硝酸铝、磷酸氢二钠、柠
檬酸、无水乙醇等均为分析纯;二次蒸馏水自
制。
SHY －2A双功能恒温振荡器 (江苏金坛晶玻
仪器厂) ;FZ － 102 微型中草药植物粉碎机 (上
海越磁电子) ;SENCO － R 旋转蒸发仪 (上海申
生公司) ;H1650 － W 高速离心机 (湘仪仪器有
限公司) ;AE － 240 电子天平 (梅 －托上海仪器
有限公司) ;UV －9200 型分光光度计 (北京瑞利
分析仪器公司) ;M － 50 真空抽滤器 (巩义瑞德
仪器有限公司)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 苦瓜黄酮的提取
准确称取苦瓜叶粉 2. 0g 于 250mL 三角瓶中，
加入 50mL 石油醚 (脱脂、除色素)浸泡 12h，
抽滤，取滤渣，自然挥干石油醚。滤渣中加入适
量酶与 40mL 磷酸氢二钠 － 柠檬酸缓冲液混合，
在一定温度下酶解一定时间后，升温灭酶，按料
液比 1 ∶ 50 (g /mL)加乙醇调节乙醇浓度为 65%
［乙醇浓度 = 乙醇含量 / (缓冲液体积 + 乙醇体
积) × 100%］，置 70℃恒温水浴振荡器上提取
2. 5h，抽滤，减压回收乙醇 (浓缩一倍) ，得提
取液。
1. 2. 2 标准曲线的制作［9］
精密称取芦丁标准品 12. 7mg，用 60%乙醇
溶解转移至 50mL 容量瓶，并定容至刻度，得到
浓度 0. 254mg /mL的芦丁标准溶液。
精密吸取 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、
6. 0mL芦丁标准液于 7 支 25mL 的容量瓶中，各
加入 1. 0mL 5% NaNO2，混匀，静置 6min 后加入
10%的 Al (NO3)3溶液 1. 0mL，混匀，静置 6min
后再加入 10mL 1mol /L NaOH，混匀，用 60%乙
醇稀释至刻度，混匀静置 15min，以芦丁空白试
剂为参比，于 510nm 波长处测吸光度。以浓度 X
(mg /mL)为横坐标，吸光度 A 为纵坐标绘制标
准曲线，得回归方程:A = 0. 504x － 0. 0048，R2
= 0. 9996
1. 2. 3 提取液总黄酮含量的测定
移取适量提取液于 25mL 的容量瓶中，按上
述测芦丁的方法依次加入 NaNO2、Al(NO3)3、
NaOH，用 60% 的乙醇补充至刻度，混匀静置
15min，在 510nm 处测定吸光度，按标准曲线法
求出黄酮浓度，计算黄酮的提取率。
黄酮提取率(%)=
提取液中总黄酮物质的质量
苦瓜叶粉质量
× 100
2 结果与讨论
2. 1 酶种类及浓度的确定
2. 1. 1 不同种类的酶对黄酮提取率的影响
选用纤维素酶、果胶酶及蛋白酶为实验用
酶，为考察不同种类的酶对苦瓜叶黄酮提取的影
响，称取 2. 0g苦瓜叶样粉四份，脱脂后，在滤
渣中分别加入相同酶活单位的纤维素酶、果胶
酶、蛋白酶和 40mL磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲液
混合，在 pH5. 0、温度 50℃、酶解 150min 后，
以不加酶样品为对照，按 “1. 2. 1”方法提取黄
109
酮，测定提取液中黄酮浓度，计算提取率，结
果见图 1。
图 1 不同酶处理对黄酮提取率的影响
Fig. 1 the effects of different enzyme treatment
on extraction rate of flavonoids
结果表明，各种酶对总黄酮的提取率的影响
为:纤维素酶 ＞果胶酶 ＞木瓜蛋白酶。加入纤维
素酶与果胶酶，黄酮提取率有较大幅度提高，而
蛋白酶的加入则无明显效果。
2. 1. 2 单酶和复合酶对黄酮提取率的影响
为比较提取体系中单一酶和复合酶对黄酮提
取率的影响，称取 2. 0g 苦瓜叶样粉 6 份，脱脂
后，在滤渣中分别加入相同量的纤维素酶、果胶
酶、蛋白酶、复合酶和 40mL 磷酸氢二钠 －柠檬
酸缓冲液混合，在 pH5. 0、温度 50℃、酶解
150min后，按“1. 2. 1”方法提取，测定提取液
中黄酮浓度，计算提取率，结果见图 2。
图 2 单酶与复合酶处理对黄酮提取率的影响
Fig. 2 the effects of compound enzyme and
single enzyme on extraction rate of flavonoids
结果表明，复合酶的效果比单酶好，不同组
成的复合酶效果也不一样，复合酶 1 提取效果最
好。单一的木瓜蛋白酶对总黄酮的提取率影响不
大，但在复合酶中木瓜蛋白酶的加入可适当提高
总黄酮的提取率，说明木瓜蛋白酶对纤维素酶、
果胶酶两种酶有少许协同作用。比较三种复合酶
组合对黄酮提取率的影响，实验选择纤维素酶和
果胶酶组成的复合酶作为提取苦瓜叶黄酮用酶。
2. 1. 3 纤维素酶浓度的确定
称取 2. 0g苦瓜叶样粉，脱脂后，在滤渣中分
别加入不同量的纤维素酶和 40mL 磷酸氢二钠 －
柠檬酸缓冲液混合，在 pH5. 0、温度 50℃、酶解
150min后，按“1. 2. 1”方法提取黄酮，测定提
取液中黄酮浓度，计算提取率，结果见图 3。
图 3 纤维素酶浓度对黄酮提取率的影响
Fig. 3 the effects of concentration of cellulase
on extraction rate of flavonoids
可以看出，当酶浓度由 0. 2mg /mL 上升到
0. 8mg /mL时，总黄酮得率明显提高。之后再增
大纤维素酶用量，黄酮提取率呈负增长。可能是
继续加大酶量，底物浓度不能对酶达到饱和，导
致酶的作用受到抑制所致［10］。因此，实验选用纤
维素酶浓度为 0. 8mg /mL。
2. 1. 4 复合酶浓度的确定
称取 2. 0g苦瓜叶样粉 7 份，脱脂后，在滤渣
中各加入 40mL 磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲液，按
0. 8mg /mL加入纤维素酶混合，分别加入不同比
例的果胶酶，在 pH5. 0、温度 50℃、酶解 150min
后，按“1. 2. 1”方法提取黄酮，测定提取液中
黄酮浓度，计算提取率，结果见图 4。
结果表明，当纤维素酶与果胶酶添加比为
1 ∶ 0. 6时，提取率达到 2. 91%，继续增大果胶酶
量，提取率不再增加。因此，确定复合酶的最佳
浓度为:纤维素酶浓度为 0. 8mg /mL，果胶酶浓
110
图 4 复合酶浓度对黄酮提取率的影响
Fig. 4 the effects of compound enzyme
concentration on extraction rate of flavonoids
度为 0. 5mg /mL。
综合上述实验结果，提取竹叶黄酮选用由纤
维素酶与果胶酶组成的复合酶对竹叶进行酶解处
理，复合酶的加入量为:纤维素酶浓度为 0. 8mg /
mL，果胶酶浓度为 0. 5mg /mL。
2. 2 复合酶酶解单因素试验
2. 2. 1 温度对提取率的影响
酶的活性与温度有直接的关系，温度太低无
法正常发挥酶的活性，高温容易导致酶失活，同
样不利于黄酮提取。因此，选择一个适宜的酶解
温度有助于提高黄酮得率。
称取苦瓜叶样粉 2. 0g，脱脂后，在滤渣中加
入 40mL pH5. 0 的缓冲液，按最佳浓度加入复合
酶，在不同温度下酶解 150min，按 “1. 2. 1”方
法提取黄酮，测定提取液中黄酮浓度，计算黄酮
提取率，结果见图 5。
图 5 酶解温度对黄酮提取率的影响
Fig. 5 the effects of hydrolysis temperature
on extraction rate of flavonoids
结果表明，在 30℃ 55℃之间，随着温度的
升高，总黄酮的提取率不断增加;55℃以后温度
进一步提高时，提取率呈下降趋势，这是因为高
温抑制了酶的活性，黄酮提取率降低。
2. 2. 2 酶解时间对提取率的影响
称取苦瓜叶样粉 2. 0g，脱脂后，在滤渣中加
入 40mL pH5. 0 的缓冲液，加入复合酶，在 50℃
下酶解不同时间后，按 “1. 2. 1”方法提取黄酮，
测定提取液中黄酮浓度，计算黄酮提取率，结果
见图 6。
图 6 酶解时间对黄酮提取率的影响
Fig. 6 the effects of enzymatic treatment time
on extraction rate of flavonoids
由图 6 可知，总黄酮提取率随着酶解时间的
延长而逐步增加，当达到 140min时，提取率处于
平衡状态，进一步延长酶解时间，提取率并没有
明显的提高。
2. 2. 3 pH对提取率的影响
称取苦瓜叶样粉 2. 0g，脱脂后，在滤渣中加
入 40mL不同 pH的缓冲液，按最佳浓度加入复合
酶，在 50℃下酶解 150min 后，按 “1. 2. 1”方法
提取黄酮，测定提取液中黄酮浓度，计算黄酮提
取率，结果见图 7。
图 7 pH对黄酮提取率的影响
Fig. 7 the effects of pH values
on extraction rate of flavonoids
111
由图 7 可知，在 3. 5 4. 5 之间，随着 pH的
升高，黄酮提取率逐渐增大。到 pH 4. 5 时，复合
酶发挥最大活力，黄酮提取率最高。再增大 pH，
黄酮提取率下降，说明酶的活性下降。
2. 3 复合酶法提取正交试验
在对酶解温度、酶解时间以及 pH 对黄酮提
取率影响的单因素试验基础上，以黄酮得率为指
标，采用 L9(3
3)正交试验来确定这 3 个因素对黄
酮提取率的综合影响，每个因素设定 3 个水平
(见表 1) ，以确定复合酶法提取苦瓜叶中总黄酮
的最佳酶解工艺条件。
表 1 正交试验结果及分析
Tab 1 the results and analysis of extracting orthogonal test
试验号 酶解温度 /℃ 酶解时间 /min 酶解 pH
各次黄酮提取率 /%
1 2 3
平均提取率 /%
1 50 120 4. 0 2. 46 2. 38 2. 44 2. 13
2 50 140 4. 5 2. 85 2. 87 2. 92 2. 88
3 50 160 5. 0 2. 64 2. 69 2. 66 2. 67
4 55 120 4. 5 2. 56 2. 54 2. 61 2. 57
5 55 140 5. 0 3. 09 3. 09 3. 14 3. 11
6 55 160 4. 0 2. 95 2. 82 2. 99 2. 92
7 60 120 5. 0 2. 43 2. 39 2. 48 2. 41
8 60 140 4. 0 2. 66 2. 62 2. 57 2. 62
9 60 160 4. 5 2. 83 2. 89 2. 81 2. 84
K1 7. 97 7. 43 7. 96
K2 8. 60 8. 60 8. 29
K3 7. 89 8. 43 8. 20
k1 2. 66 2. 48 2. 65
k2 2. 87 2. 87 2. 76
k3 2. 63 2. 81 2. 73
R 0. 23 0. 39 0. 11
由表 1 的分析可知，在复合酶按纤维素酶浓
度为 0. 8mg /mL，果胶酶浓度为 0. 5mg /mL 情况
下，酶解处理提取苦瓜叶黄酮的最佳工艺条件
为:温度 55℃，pH4. 5，酶解时间 140min。各因
素对总黄酮提取率的影响大小为:酶解时间 ＞酶
解温度 ＞酶解介质 pH。
2. 4 与直接醇提工艺对比实验
按实验确定的最佳酶法提取工艺与直接醇提
工艺进行对比实验，结果见表 2。
表 2 直接醇提法与酶提法所得黄酮的提取率
Table 2 Extraction rates of
flavonoid with different methods
提取方法 pH
提取
温度 /℃
提取
时间 /min
最高提
取率 /%
直接醇提 6. 8 70 180 2. 38
复合酶辅助提取 4. 5 55 140 3. 13
表 2 表明，用复合酶对苦瓜叶进行酶解处理
112
后提取黄酮，黄酮的提取率比直接醇提提高了
30%以上，说明苦瓜叶经复合酶处理后，细胞壁
膜被破坏，更有利于黄酮类成分的溶出提取。
3 结论
用酶法提取苦瓜叶中黄酮，复合酶比单酶效
果好，复合酶法辅助醇提苦瓜叶中黄酮的最佳条
件为:在纤维素酶浓度为 0. 8mg /mL，果胶酶浓
度为 0. 5mg /mL情况下，在温度 55℃和 pH 4. 5 的
条件下酶解时间 140min，苦瓜叶总黄酮的最高提
取率可达到 3. 13%，与直接醇提工艺相比，提取
率提高了 30%以上。
木瓜蛋白酶在单独使用时对苦瓜叶总黄酮的
提取率影响不大，但和纤维素酶、果胶酶复合使
用时有协同作用，能适当提高总黄酮的提取率。
酶法提取是在较低温度下进行，能耗低，保
持了所得产物的稳定性及生物活性、无污染，对
于利用废弃苦瓜叶资源，生产出高附加值的产品
具有现实的意义。
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