全 文 ：第 4 期 陈炼红，等:复合酶法提取蕨麻多糖及其抗氧化活性研究
2015 年 7 月
第 41 卷第 4 期
西南民族大学学报( 自然科学版)
Journal of Southwest University for Nationalities(Natural Science Edition)
Jul. 2015
Vol. 41 No. 4
doi:10. 11920 /xnmdzk. 2015. 04. 003
复合酶法提取蕨麻多糖及其抗氧化活性研究
陈炼红1，张梦苑1，伍 红1，孙 青2，李 键3
( 1. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041; 2. 西南民族大学外国语学院，四川 成都 610041;
3. 西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)
摘 要:确定了复合酶( 纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶) 提取蕨麻多糖的最佳工艺，并对其体外抗氧化活性进行初步研
究．在单因素试验的基础上，设计 L9 ( 3
3 ) 正交实验和 L9 ( 3
4 ) 正交实验，分别得出复合酶的最佳配比和复合酶法提取蕨
麻多糖的最佳提取工艺条件;采用清除·OH( 羟基) 自由基模型和 O2一·( 超氧阴离子) 自由基模型评价了蕨麻多糖的
抗氧化能力．结果表明:复合酶的最佳配比为:纤维素酶 2. 0%，木瓜蛋白酶 1. 0%，果胶酶 2. 0% ; 最佳工艺条件为:料
液比为 1: 30、pH值为 4. 5，温度为 45 ℃，酶解时间为 60min，此时蕨麻多糖的提取率最大为 8. 12%，同时验证性实验也
表明优化得到的提取工艺稳定可靠;蕨麻多糖对羟基自由基和超氧阴离子都具有较强的清除作用，并与浓度呈一定依
赖关系，且对羟自由基的清除能力要比超氧阴离子自由基的清除能力强．
关键词:复合酶;蕨麻多糖;抗氧化
中图分类号:TS201. 2;TS218 文献标志码:A 文章编号:2095-4271(2015)04-0407-05
收稿日期:2015-05-21
作者简介:陈炼红(1967 －) ，女，藏族，成都人，副教授，研究方向为民族食品资源开发与研究;E － mail:lianhong_chen@ 163. com
通信作者:李键(1967 －) ，男，教授，研究方向为民族食品资源开发与研究;E － mail:lijiangracy@ yahoo. com
基金项目:公益性行业(农业)科研专项项目(201203009)
Extraction and antioxidant activities of polysaccharides from Potentilla
anserina with combined-enzyme method
CHEN Lian-hong1，ZHANG Meng-yuan1，WU Hong1，SUN Qing2，LI Jian3
(1. School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P. Ｒ. C.;
2. School of Foreign Languages，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P. Ｒ. C.;
3. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P. Ｒ. C.)
Abstract:The extraction and antioxidant activities of polysaccharides from Potentilla anserina with combined-enzyme(cellulase，
Pectinase，papain)method were studied. Single factor experiments were conduced to examine the ratio of the solid-liquid，pH val-
ue，temperature by enzymatic hydrolysis，extracting time，which provided optimum reaction conditions for extraction of polysac-
charides in Potentilla anserina. The best ratio of combined enzymes and the effects of extraction temperature，extraction time，pH
value，the ratio of solid-liquid on yield rate of polysaccharides were determined through orthogonal test and its antioxidant activi-
ties were tested by ·OH and O2-· radical scavenging experiments. The best ratio of combined enzymes was cellulase of
2. 0%，papain of 1. 0%，and pectinase of 2. 0% ． The optimum reaction condition was temperature of 45℃，pH value of 4. 5，
time of 60 min，the solid-liquid ratio of 1:30，the extraction rate reached 8. 12% . This study developed the best extraction
process of polysaccharides from Potentilla anserina with combined-enzyme method． The result shows that polysaccharides has
good scavenging effect on ·OH and O2 －·，and the scavenging effect of ·OH is better than that of O2 －·．
Key words:complex enzyme;Potentilla anserina;polysaccharide;antioxidantion
多糖(Polysaccharide)具有免疫调节、止血抑菌、
抗疲劳等多种生理药理作用［1 － 2］，有着广阔的应用前
景．蕨麻又名人参果，属于高原高寒地区生长的植物，
藏医称“卓老沙僧”［3］，是一种理想的食药两用品［4］．
西南民族大学学报( 自然科学版) 第 41 卷
蕨麻多糖作为一种具有生物活性的食品功能因子，近
年来已引起研究人员的关注． 目前，对蕨麻多糖提取
工艺的研究主要集中在水提法以及醇提法［5 － 7］，并未
见复合酶法提取工艺优化的系统报道．本试验采用复
合酶法提取［8 － 10］，优化提取工艺，并对其体外抗氧化
活性进行初步研究，从而为进一步研究蕨麻多糖的生
物活性及在食品中的应用提供理论依据．
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
蕨麻(Potentilla anserina) :秋季，采自四川巴塘草
原．
纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶(均购于成都成华
区怡语化学实验设备经营部)．
无水乙醇、磷酸氢二钠、柠檬酸、葡萄糖、邻苯三
酚、三羟甲基氨基甲烷、水杨酸、硫酸亚铁(均为分析
纯，购于成都迪康生物技术有限公司)．
1. 2 仪器
Delta320 型 pH 计(Mettler － Toledo Group) ;WFZ
UV －2102PSC型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海
仪器有限公司) ;DHG － 9240A 型电热恒温鼓风干燥
箱(上海精宏实验设备有限公司) ;Centrifuge 5804 型
离心机(德国 Eppendorf 公司) ;ＲE － 85Z 旋转蒸发器
(上海青浦沪西仪器厂) ;PL303 分析天平(梅特勒 －
托利多仪器(上海)有限公司) ;HH － 6 数显恒温水浴
锅(国华电器有限公司) ;AKHL － III － 24 超纯水机
(成都康宁试验专用纯水设备厂)．
1. 3 试验步骤
1. 3. 1 复合酶法提取蕨麻多糖的工艺流程
蕨麻→烘干→粉碎(过 100 目筛)→复合酶水解
→离心(4000r /min、15min)→取上清液→真空浓缩→
醇沉→离心→洗涤→干燥→称重［11 － 12］
1. 3. 2 蕨麻多糖含量的测定
采用苯酚硫酸法对蕨麻多糖含量进行测定［13］．
1. 3. 3 单因素实验
依据参考文献确定复合酶为纤维素酶 2. 0%、果
胶酶 1. 5%和木瓜蛋白酶 1. 5%［14］，在复合酶的配比
一定的条件下，分别考察不同料液比(g /ml)、pH 值、
酶解温度和提取时间对蕨麻多糖提取率的影响．
1. 3. 4 蕨麻多糖的复合酶配比及提取工艺的正交实验
1)复合酶配比对蕨麻多糖的影响
设计 L9(3
3)正交实验，见表 1，确定复合酶的最
佳配比．
表 1 蕨麻多糖复合酶配比正交试验因素水平表
Table 1 Complex enzyme factors level table of orthogonal test
水平 A纤维素酶(%) B果胶酶(%) C木瓜蛋白酶(%)
1 1. 0 1. 0 0. 5
2 1. 5 1. 5 1. 0
3 2. 0 2. 0 1. 5
2)提取工艺优化
设计 L9(3
4)正交实验，见表 2，确定最佳提取工
艺［15 － 16］．
表 2 提取工艺正交因素水平表
Table 2 The orthogonal factor level table of extraction process
水平
A料液比
(g /mL) B pH
C酶解温
度(℃)
D酶解
时间(min)
1 1:10 4. 0 40 60
2 1:20 4. 5 45 80
3 1:30 5. 0 50 100
1. 3. 5 蕨麻多糖体外抗氧化活性研究
1)测定超氧阴离子自由基清除率
取 4. 5ml 50mmol /L Tris － HCl缓冲溶液(pH8. 2)
和 2ml蕨麻多糖提取液于试管中，混匀后于室温条件
下静置 4min，然后于 325nm 处测定吸光度，记作 A0;
取 4. 5ml 50mmol /L Tris － HCl 缓冲溶液，立即加入
1ml 3mmol /L邻苯三酚并开始计时，在紫外分光光度
计 325nm处记录第 100s 时的吸光值，记作 A2;按照
上述方法，取 4. 5ml 50mmol /L Tris － HCl 缓冲溶液和
1ml蕨麻多糖提取液，放置 4min后加入 1ml邻苯三酚
(3mmol /L) ，计时，以 10mmol /L HCl 作为对照，在紫
外分光光度计 325nm 处记录第 100s 时的吸光
度［17 － 18］，记作 A1．
按式(1)计算蕨麻多糖清除超氧阴离子自由基清
除率:
清除率(%)=［1 －(A1 － A0)/A2］× 100% (1)
2)测定羟自由基清除率
将蕨麻多糖用蒸馏水配成浓度为 0. 1、0. 2、0. 3、
0. 4、0. 5 mg /ml 的溶液，取 2ml 不同浓度的蕨麻多糖
溶液，依次加入 2ml 6mmol /L 的 FeSO4 溶液、2ml
6mmol /L的 H2O2，静置 10min ，再加入 6mmol /L的水
804
第 4 期 陈炼红，等:复合酶法提取蕨麻多糖及其抗氧化活性研究
杨酸溶液 2ml，混匀后在室温下静置 30min，于 510nm
处测其吸光值 A1，然后用双蒸水代替水杨酸测定吸
光值记作 A2，其中空白组用超纯水代替多糖溶液，测
定吸光值［19 － 20］，记作 A0．
按下列式(2)计算蕨麻多糖清除羟自由基清除率:
·OH的清除率(%)=［1 －(A1 － A0)/A2］×
100% (2)
2 结果与分析
2. 1 单因素实验
2. 1. 1 不同料液比对蕨麻多糖得率的影响
图 1 料液比对蕨麻多糖得率的影响
Fig. 1 The effect of the material － water ratio on
the extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide
由图 1 可知，当料液比小于 1:20 时，随着料液比
的增加，蕨麻多糖的得率逐渐增加;当料液比大于 1:
20 时，随着料液比的增加，蕨麻多糖的得率反而减
少;料液比为 1:20 时，蕨麻多糖的得率最大，说明此
时的料液比使蕨麻的溶解性达到最大． 因此，通过试
验结果可知当料液比为 1:20 时，最有助于蕨麻多糖
溶液的提取，所以最佳料液比为 1:20．
2. 1. 2 不同 pH值对蕨麻多糖得率的影响
图 2 不同 pH对蕨麻多糖得率的影响
Fig. 2 The effect of pH on the extraction efficiency
of Potentilla anserina polysaccharide
由图 2 可知，当 pH 值小于 4. 5 时，基本上随着
pH的增加，蕨麻多糖的得率也呈增加的趋势，但当
pH值大于 4. 5 时，多糖得率呈减少的趋势，说明 pH
值超出一定范围后，酶的活性受到了影响，而 pH值为
4. 5 时蕨麻多糖的得率最大． pH值对酶活性的影响可
通过改变酶的空间结构，使酶失活，从而影响复合酶
法蕨麻多糖的得率．
2. 1. 3 不同酶解时间对蕨麻多糖得率的影响
图 3 酶解时间对蕨麻多糖得率的影响
Fig. 3 The effect of hydrolysis time on the extraction efficiency
of Potentilla anserina polysaccharide
酶解时间对蕨麻多糖得率的影响呈倒“U”形，当
酶解时间为 80min 时，蕨麻多糖的得率达到最大值，
说明酶发挥了最大的作用，且蕨麻中多糖的得率最
大．当酶解时间少于 80min时，三种酶各自发挥作用，
互相影响少，当时间超过 80min 时，三种酶会相互作
用，相互影响，反而对蕨麻中多糖的得率起反作用，使
得蕨麻多糖得率降低．
2. 1. 4 不同酶解温度对蕨麻多糖得率的影响
图 4 酶解温度对蕨麻多糖得率的影响
Fig. 4 The effect of hydrolysis temperature on the extraction
efficiency of Potentilla anserina polysaccharide
实验表明:当酶解温度为 45 ℃时效果最好．当温
度低于 45 ℃时，得率随温度的升高呈逐渐增大的趋
势;当温度高于 45 ℃，得率随温度的升高反而逐渐降
低．在一定温度范围内，酶的活性随着温度升高而升
高，反应速度加快，当温度升高超出阈值时，酶蛋白变
性失活，从而使酶的活力降低．
904
西南民族大学学报( 自然科学版) 第 41 卷
2. 2 正交实验
2. 2. 1 蕨麻多糖复合酶最佳配比的正交实验结果及
分析
通过对蕨麻多糖复合酶的配比进行正交试验，得
出结果见表 3．
表 3 L9(3
3)正交试验结果及分析
Table 3 Ｒesults and analysis of L9(3
3)orthogonal test
on polysaccharides extraction conditions
试验号
因素水平
A(纤维
素酶 /%)
B(果胶
酶 /%)
C(木瓜
蛋白酶 /%)
测定指标 /%
得率
1 1. 0 1. 0 0. 5 5. 63
2 1. 0 1. 5 1. 0 5. 12
3 1. 0 2. 0 1. 5 4. 04
4 1. 5 1. 0 1. 0 2. 39
5 1. 5 1. 5 1. 5 4. 25
6 1. 5 2. 0 0. 5 4. 54
7 2. 0 1. 0 1. 5 5. 61
8 2. 0 1. 5 0. 5 5. 38
9 2. 0 2. 0 1. 0 6. 12
K1 14. 79 13. 63 15. 55
K2 11. 18 14. 75 13. 63
K3 17. 11 14. 70 13. 90
K1 4. 93 4. 54 5. 18
K2 3. 73 4. 92 4. 54
K3 5. 70 4. 9 4. 63
优水平 A3 B2 C1
Ｒ 1. 97 0. 38 0. 64
由表 3 可以看出，影响蕨麻多糖得率的复合酶因
素中:复合酶的配比为 A ＞ C ＞ B，即纤维素酶 ＞木瓜
蛋白酶 ＞果胶酶，即在这三种酶中，对蕨麻多糖得率
影响最大的是纤维素酶，分析原因可能是因为植物细
胞的细胞壁主要成分是纤维素，通过对细胞壁的破坏
从而更有利于多糖的溶解．通过正交试验极差分析得
出的最佳酶配比为 A3 B2 C1，但是从 9 个处理中直观
的找出最优水平为 9 号处理，即 A3B3C2，试验指标值
为 6. 12．所以最佳酶配比为纤维素酶为 2. 0%，木瓜
蛋白酶为 1. 0%，果胶酶为 2. 0% ．
2. 2. 2 提取条件的正交实验结果
蕨麻多糖的正交实验是在单因素试验和复合酶
配比的正交试验的基础上，选取四因素三水平进行正
交试验，得到的结果见表 4．
为确定复合酶的最佳配比，设计了复合酶最佳配
比的正交试验，得到了三种复合酶的最佳配比，然后
在此基础上对酶解的提取工艺进行优化．通过单因素
试验，设计四个单因素且每个因素选取 3 个水平，进
行正交试验，由表 4 可知，对蕨麻多糖得率影响由大
到小依次为:料液比、温度、pH值和酶解时间，通过极
差分析得出的最佳提取工艺条件为 A3 B2 C2 D1，即最
佳料液比为 1:30，pH值为 4. 5，温度为 45 ℃，酶解时
间为 60min．
表 4 L9(3
4)正交试验结果及分析
Table 4 Ｒesults and analysis of L9(3
4)orthogonal test
on polysaccharides extraction conditions
试验号
因素水平
A
(料液比)
B
(pH值)
C
(温度 /℃)
D(酶解
时间 /min)
测定指标
得率 /%
1 A1(1:10) B1(4. 0) C1(40) D1(60) 4. 11
2 A1 B2(4. 5) C2(45) D2(80) 4. 74
3 A1 B3(5. 0) C3(50) D3(100) 3. 88
4 A2(1:20) B1 C2 D3 6. 09
5 A2 B2 C3 D1 6. 30
6 A2 B3 C1 D2 4. 57
7 A3(1:30) B1 C3 D2 7. 04
8 A3 B2 C1 D3 7. 56
9 A3 B3 C2 D1 8. 03
K1 12. 73 17. 24 16. 24 18. 44
K2 16. 96 18. 60 18. 86 16. 35
K3 22. 63 16. 48 17. 22 17. 43
K1 4. 24 5. 75 5. 41 6. 15
K2 5. 65 6. 2 6. 29 5. 45
K3 7. 54 5. 49 5. 74 5. 81
优水平 A3 B2 C2 D1
Ｒ 3. 3 0. 71 0. 88 0. 70
2. 2. 3 验证试验
在极差分析得到的最佳理论条件(即料液比 1:30、
pH4. 5、酶解温度45 ℃、酶解时间60min)下进行三次平
行试验，结果表明:最佳理论条件A3B2C2D1的多糖得率
平均为 8. 12%，比正交试验结果 A3 B3 C2 D1的得率
(8. 03%)高，说明提取的最佳工艺为 A3B2C2D1．
2. 3 蕨麻多糖的抗氧化活性
2. 3. 1 采用超氧阴离子自由基清除率的测定确定抗
氧化性能
图 5 对超氧阴离子自由基的清除率的影响
Fig. 5 Effect of superoxide anion free radical scavenging
014
第 4 期 陈炼红，等:复合酶法提取蕨麻多糖及其抗氧化活性研究
由图 5 可以看出，在蕨麻多糖的质量浓度为 0. 1
－ 0. 4mg /ml之间时，清除超氧阴离子自由基的能力
随着浓度的增加而增加;而当质量浓度为 0. 5mg /ml
时，清除率明显下降，因此，蕨麻多糖对超氧阴离子自
由基有较好的清除能力即有一定的抗氧化性能．
2. 3. 2 采用羟自由基清除率的测定确定抗氧化性能
图 6 对羟自由基的清除作用的影响
Fig. 6 Effect of hydroxyl free radical scavenging
随着蕨麻多糖浓度的增大，对羟自由基的清除作
用逐渐增强，说明蕨麻多糖具有良好的抗氧化性能，
且由图可知，对羟自由基的清除能力与其浓度具有明
显的量效关系，因此，对羟自由基有一定的清除作用
即具有较好的抗氧化性能．
3 结论
使用复合酶法提取蕨麻多糖，在单因素实验的基
础上，分别对复合酶配比和蕨麻多糖提取工艺进行正
交实验优化多糖得率，我们得出:酶的最佳配比为纤
维素酶 2. 0%，木瓜蛋白酶 1. 0%，果胶酶 2. 0%;复合
酶法提取蕨麻多糖的优化工艺条件为:最佳料液比为
1:30，最佳 pH值为 4. 5，最佳温度为 45 ℃，最佳酶解
时间为 60min，在这种条件下，蕨麻多糖得率为
8. 12%，与一般的水浸提法多糖得率的 2. 54%［25］相
比，多糖含量近乎提高了 3 倍，说明使用复合酶法可
大大提高蕨麻多糖的提取率．蕨麻多糖的体外抗氧化
实验表明，蕨麻多糖具有抗氧化活性，且对不同自由
基的清除能力不同，其中对羟自由基的清除能力要比
超氧阴离子自由基强．
参考文献
［1］王谢忠 . 蕨麻多糖免疫药理作用的研究［D］． 兰州:甘肃农业大
学，2006．
［2］唐洁 . 植物多糖生物活性功能的研究进展［J］． 食品研究与开发，
2006，127(5) :130 － 132．
［3］白术杰，蔡光明，周伟，等．蕨麻苷对照品的分离制备［J］．解放军药
学学报，2007，23(1) :64 － 65．
［4］王晋，张坚，康胜利，等．青海产蕨麻营养成分的研究［J］．青海医药
杂志，1998，28(2) :52 － 53．
［5］吴依茜 . 蕨麻多糖的提取工艺及抗辐射、抗氧化药理学研究［D］．
兰州:西北师范大学，2008．
［6］陈灵然，王琴 . 蕨麻多糖的提取及其清除自由基的作用［J］． 中国
兽医科技，2004，34(4) :59 － 62．
［7］杨娜，王鸿飞，许凤，等．蕨麻多糖提取及抗氧化活性研究［J］．中国
食品学报，2014，2:60 － 66．
［8］马利华，秦卫东，贺菊萍，等． 复合酶法提取生姜多糖［J］． 食品科
学，2008，29(8) :369 － 371．
［9］程俊文，贺亮，吴学谦，等．复合酶法提取山茱萸多糖的工艺条件优
化［J］．中国林副特产，2010(3) :1 － 4．
［10］孙婕，尹国友，陈兰英，等．复合酶法提取南瓜多糖及其抗氧化性
的研究［J］．安徽农业科学，2010，38(32) :18064 － 18066．
［11］陈炼红，杨丽珠，索华夷，等．响应面法优化松茸多糖酶法提取工
艺及其体外抗氧化性分析［J］．食品科学，2014，35(16) :23 － 28．
［12］HOSHI H，IIJIMA H，ISHIHAＲA Y，et al． Absorption and tissue dis-
tribution of an immunomodulatory alpha － D － glucan afteroral adminis-
tration of Tricholoma matsutake［J］． Journal of Agricultural and Food
Chemistry，2008，56(17) :7715 － 7720．
［13］马宁，杨培君 . 苯酚 －硫酸法测定石参多糖工艺条件的优化［J］．
陕西理工学院学报:自然科学版，2013，29(5) :64 － 70．
［14］尹秀莲，游庆宏，蒋中海 . 松茸多糖的提取纯化工艺研究［J］． 中
国酿造，2009，28(10) :171 － 173．
［15］陈春阳，刘景圣 . 松茸胞外多糖提取条件的优化［［J］．中国食物
与营养，2012，18(1) :60 － 62．
［16］商龙臣，李琴，张驰 . 正交试验优化红豆杉硒多糖的提取［J］． 广
东农业科学，2014，24(4) :95 － 98．
［17］CHANDＲIKA L P，FEＲEIDOON S. Optimization of extraction of phe-
nolic compounds from wheat using response surface methodology［J］．
Food Chemistry，2005，93(1) :47 － 56．
［18］刘肯，刘珍伶，周娟 . 金线莲多糖的体外抗氧化活性［［J］．华侨大
学学报:自然利学版 . 2010，31(6) :718 － 720．
［19］CAPEK P，MACHOBA E，TUＲIAN J. Scavenging and antioxidant act-
ibitiee of immunomodulating polysaccharide isolated form Salvia offici-
nalis［J］． International of Biologica Macromolecules，2009，44(1) :75 －
80．
［20］祝元婷，吴文林，张利，等．超声提取鼠尾草叶多糖工艺优化及其
DPPH自由基清除能力评价［J］．食品科学，2011，32(16) :76 － 79．
( 责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏; 英文编辑:周序林，郑玉才)
114