全 文 :粮油食品科技 第 2 3 卷 2 0 1 5 年 第 4 期
生物工程
白花丹参多 酶法提取条件的
响应面优化及其抗氧化活性研究
巩 健
( 淄博职业学院 制 药与 生物工程 系 , 山 东 淄博 2 5 5 3 1 4 )
摘 要 :研究响应面优化复合酶法提取 白花丹参 多糖的 工艺 ,并评价其抗氧化活性 。 以 白花丹参多
糖提取率为响应值 ,液料比 、酶解温度 、酶解时间 、复合酶 (木瓜蛋 白 酶 : 纤维素酶 : 果胶酶 = 2 : 2 : 1 )
添加量为 实验因 素 ,釆用 响应面法建立数学模型 ,优化提取条件 ,并初步探讨 白花丹参 多 糖的理化
性质 ,考察 白花丹参 多糖对 DPPH 和 ?OH 自 由基的 清除能力 。 结果表明 ,通过二 次回 归模型响应
面分析 ,液料比 、酶解时间 、温度 、复合酶添加量四 因 素对白 花丹参多 糖提取率的影响依次减弱 ; 最
佳工艺条件 为酶解温度 5 2 T 、时间 7 0 min 、复合酶添加量 8 . 0 mg/mL、液料比例 为 4 5 : 1ml/g ,在此
条件下 多糖提取率为 1 3 . 3 6 % ,模型 方程理论预测值为 1 3 . 7 0% , 两者相对误差 小 于 5 % 。 白 花丹
参 多糖为左旋型 、酸性多糖 , 易溶于水 ,并具有较 强的抗氧化活性 , 对 DPPH 和 ?OH 自 由基的半数
抑制浓度分别 为 0 . 9 6 9mg/mL 和 3 . 1 1 4 mg/mL ,但抗氧化活性小 于 Vc 。 采用 响应 面法优化得到 了
白花丹参 多糖的最佳复合醉提取工 艺 ,得到 的 多糖具有较强 的抗氧化活性 。
关键词 : 白 花丹参多 糖 ;复合酶 ; 响应 面 ;提取 ;抗氧化
中图分类号 :R 2 8 2 ; Q 5 3 9 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 7 - 7 5 6 1 ( 2 0 1 5 ) 0 4 - 0 0 9 3 - 0 5
Studyonoptimizationofextractionconditionofpolysaccharidefromsalvia
miltiorrhiza/?albabyresponsesurfiaccmethodologyanditsantioxidantactivity
GONGJian
( Depar tmentofPharmaceut icalandB io logi ca lEngineering ,ZiboVoc ationalIns titute ,ZiboShandong 2 5 5 3 1 4 )
Abstract : Theextrac t iontechno logyofpo lysaccharidefromsalv iam iltiorrhizaf.albabyoptimizedcom?
plexenzymeme thodwasstudiedtoevaluatei tsantiox idantactivi ty .Takingpo lysaccharide sextract ion
rateasresponsevalue , theratioofwa tertom aterial , enzymo lysistempera tu reandtime , andcomplexen?
zymeconcentra tion(papain :ce llulase :pec tinase= 2 : 2 : 1 )asexperim entalfactors , themathema tical
mod elwases tab lishedbyresponsesu rfaceme thod .Theextractioncondi tionswereoptim ized .The physi-
co_chemicalcharacte ri stic so fth epolysac charideandthefreerad ical scavengingactivi ty toDPPHand
?OHwereanalyzed .Th eresul tshowedtha taccording toquadrat icregre ss ionm ode lresponsesurfacea-
nalysistheeffec tofth e 4 facto rsonpolysac charid eyie ldwa sdecreasedin theorderofratioofwaterto
material ,extrac tiontime ,ex tractiontemperatureandc omplexenzymeconcentration .Theoptimalcond i?
tionswerethatthec onc entrationof complexenzymewas 8 . 0 mg/mL ,ex traction timewas 7 0 min ,thera?
tioof wate rtomate rialwa s 4 5 : 1mL/g ,andex traction tem peraturewas 5 2 T l .Underthe optima lcondi?
tions
,
theexp erim entalextrac tionratewas 1 3 . 3 6 % , th epredictedextract ionra tebymathematic almodel
was1 3 . 7 0 % .Thedi ffe rencebe tweenthemwaslessthan 5 % .Thesam pl ewaslevogyrationandac idi ty
po ly sac charide , andso lubleinwa te reas ilywi th rela tivelystrongant iox idan tact iv ity , the IC 5 0 forDPPH
and?OHwe re 0 . 9 6 9 mg/mLand 3 . 1 1 4 mg/mL ,respect ive ly ,whichwasweakerthanthoseofvi tamin
C .Thepoly sac charide s fromsalviam ilt iorrhiza f.albaex tractedbyopt im alcomplexenzyma tic ex trac tion
technologyoptimizedbyre sponsesurfac eme thodo logyshowedrelat ive lys trongan t iox idantact iv ity .
Key words : salviam ilt iorrh izaf.albapolysaccharide ;c omple xenzyme ;responsesurfac em ethodology ;
extract i on
;
ant io xida tion
收稿 日期 = 2 0 1 5 - 0 3 - 0 7
作者简介 : 巩健 , 1 9 6 7 年出 生 , 女 , 山东桓台人 ,副教授 .
睡
DOI牶10牣16210牤j牣cnki牣1007牠7561牣2015牣04牣022
生物工程
粮油食品科技 第 2 3 卷 2 0 1 5 年 第 4 期
多糖具有多种药理活 性 , 如抗氧化 、抗炎性反品溶液 中有无淀粉的存在 , 以 1 mg/mL 淀粉溶液作
应 、抗肿瘤 、增强免疫等 ,且副作用小 [ U , 天然产物为对照 ;用 自 动旋光仪测 1mg/mL 样品 多糖 2 0 T
如铁棍山药 [ 2 ] 、紫苏m 、梔子 [ 4 ] 、啤酒酵母 [ 5 ] 等都含时的旋光度 ;粘度测定具体方法参照文献 [ 9 ] ,使用
有多糖成分 。 白花丹参 ( safoiamitowr/ iiza /?alba )旋转流变仪 ( 安东帕 MCR3 0 2 ,奥地利 ) 测定不同温
属稀有名贵食药材 , 富含多种有效活性成分 。 研究度下 ( 2 0 T 、 5 0 T ) 样品溶液表观粘度随剪切速率
表明 , 白花丹参提取物通过保护细胞周期与抑制细变化的 曲线 。
胞凋亡对脂多糖 ( LPS )损伤的血管内皮祖细胞发挥 1 . 5 响应面优化设计
保护作用 [ 6 ] ; 此外 , 白 花丹参水溶性部位可能通过酶解 PH 4 . 5 、摇床转速 2 0 0 r/min 及复合酶比
调节细胞氧化应激抑制 由 LPS 导致的血管 内皮细例 (木瓜蛋 白酶 、纤维素酶 、果胶酶的质量 比为 2 : 2
胞凋亡 [ 7 ] 。 本研究拟通过响应面法优化 白花丹参: 1 ) [ 1 Q ]三个条件不变 , 因素水平设计及数据分析方
多糖的复合酶提取工艺 ,并探讨其体外抗氧化作用 。 法参考文献 [ u ] ,具体因素水平见表 1 。 数据分析采
1材料与方法用Design-Exp ert软件 ( Sta t-Ease ,Inc . ) 。
1 . 1材料与试齐H 表 1 白花丹参 多糖提取条件优化的因素水平值
白花丹参 :购 自 山东泰联中药饮片公司 ,烘干至 gf
恒重备用 ; DPPH ( 1 , 1-二苯基 - 2 - 三硝基苯肼 )水平ABch
:北兄 中生瑞泰科技 ;木瓜蛋 白酶 、果胶醇 、纤维素 / ( mL/g) 温度/"C时 间/mi n /( mg/mL )
酶 :上海士锋生物科技 ; D (+ ) _ 无水葡萄糖 (标准—^^ 3 0 6
品 ) :大连美仓生物技术 ;维生素 C : S igma( 美国 ) ; 无丨 5 89 0 ,o
水乙醇等常用化学试剂均为国产分析纯。 :
1 . 2 白花丹参多糖的提取1 . 6 自花丹参多糖抗氧活性研究
白花丹参药材粉碎后过 1 0 0 目筛 ,称取筛后粉白花丹参多糖对 自 由基 DPPH 的清除能力测
末 5 . 0 g ,按具体实验需要的酶解条件 ,在摇床上进定 : 0 . 2 mmol/LDPPH 溶液与待测样液等体积 (各 2
行酶解提取多糖成分 , 摇床转速为 2 0 0 r/min , 酶解mL )混合反应 0 . 5 h 后 ,测其在 5 1 7nm 处的吸光度
完成得到多糖浸提液 ,浓缩 , Sevag 法去除蛋白 ,上清值 ,标记为 C, ,测 DPPH 溶液与蒸馏水在 5 1 7 nm 处的
乙醇沉淀 ,离心 ,沉淀用乙醇 、丙酮 、 乙醚依次清洗 , 吸光度值 ,标记为 C 0 ,测乙醇与样液在 5 1 7 nm 处的吸
真空冷冻干燥 。光度值 ,标记为 C 2 , 同法测定对照 V c的吸光度值 [ 1 2 ] 。
1 . 3 多糖测定 白花丹参多糖对 自 由¥ ?OH 的清除能力泖 1
通过苯酷-硫酸法测定多糖含量 ,还原糖测定 定 :详细步骤参考娜 [ 1 2 ] ,测娜长为 5 1 0 nm 賺
采用 3 ,5 - 二硝基水杨酸法、 以 D (+) - 无水 光度值 ,标记为 蒸溜水替代样品溶液后的 吸光
葡萄糖作为标准品 ,得到标准曲线为 r= 0 . 0 1 5 1 , - 度值为 Q ,蒸馆水代替水杨酸后的吸光雌为 c 2 ’同法测定对照 Vc的吸光度值 ,并进行比较。
0 . 0 3 9 2
:
R= 0 . 9 9,擁式 中 ^ 为葡萄麵量浓对两种 自 由基的清除率计算公式均为 :度 ’单位为mg/mL , y为吸光度 OD值。y/%=[ 1 -( C ! - C 2 )/C。 ]x lOO 。
多糖提取率计算公式为 …/%= [ ( w x r )/z ] 2 结果与分析
x 1 0 0 ,式 中々 为多糖提取率 ( % ) ; T 为多糖浸提液 2 . x 』响应面优化
的体积 ( mL ) ; yV 为 由 回归 方程求得 的多糖浓度」 实验结果
( mg/mL ) ;Z 为药材白花丹参粉末质量 ( g ) 。具体结果见表 2  ̄ 表 3 。
还原糖提取率计算公式 : H/%= 提取液中还原表 2 实验方案及结果
糖质量/白花丹参粉末质里 X 1 0 0 。实验号aBCD 多糖提取率
1 . 4 理化性质分析 ̄i 0 0^I 8^ 5 ̄
将样品多糖分别溶于水 、丙酮 、 乙醚 、乙醇 、正丁丨i 1I 1n9Z
醇 、二 甲基亚砜有机溶剂 , 观察溶解情况 ; 用 pint 4… 0 - 1 07 : 1 5
测定样品溶液 PH 值 ; 采用碘一碘化钾反应检测样 5 0 1 0- 1 9 3 5
M
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生物工程
(?= 1 3 . 3 7 +1 . 1 5 A- 0 . 1 3 B + 1 . 1 0 C一 0 . 0 3 4 J 5+
务验号
多糖提取率/% 0 0 7 5 /1 5 + 0 .A 2 A C+ 0 . 0 8 2 / 1D+ 0 . 2 9BC+ 0 . 1 8 BD-
6 0 01- 1 1 0 . 8 6
7_ ! ,oo 7 . 2 3 0 . 5 2 CD- 2 . 5 4 A 2- 1 . 4 3 S 2- 1 . 8 7 C 2 - 2 . 2 8 D 2
8 0- 1- 1 0 9 . 2 4 由表 3 方差分析结果可知 ,模型方程达到极显
1
1 °° ‘ 0 ' 8 3著 ( P< 0 . 0 0 0 1 ) , 失拟项不显著 ( P= 0 . 2 1 8 0 >
1
0-
1- 1 0 0 8 . 3 5
H! 0 0 1 9 . 8 3 0 . 0 5 ) , 调整决定系数 = 0 . 9 0 1 8 , 总决定系数尺 2
1 2 0 0 001 2 . 6 3 = 0 . 9 5 0 9 ,这些值表 明此 回 归方程模型成立 ,拟合
1 3 0“ 1 1 0 1 0 ' 4 1程度好 ,实验误差小 ,可用于白 花丹参多糖酶法提取
1 4 0
1- 1 0 9 . 1 2
! 5!0 0- 1 9 . 4 7工艺的优化 。 此外 , 液料比M) 、酶解时间 ( C ) 、酶
1 6 10- 1 0 7 . 5 7解温度 ( B ) 、复合酶添加量 ( D ) 对 白花丹参多糖提
1 7 0 0“ 1“ 1 7 9 8取率的影响依次 减弱 , 其中 A 、 c 达到极显著水平
1 8 0 0 0 0 1 3 . 8 5
1 9 0 0, 9 . 4
1
( P < 0 . 0 0 0 1 ) ,两 因素 间交互作用均 不显著 >
2 0 0 00 0 1 3 . 4 7 0 . 0 5 ) 。回归模型方程求解得到 的最佳工艺参数为 :
2 1“ ‘ 0 0 1 7 4 6复合酶酶解温度 5 1 . 9酶添加量 7 . 9 m g/mL , 酶
2 2 0- 1 0- 1 1 0 . 0 1
, , ,… ,
2 3 0 0 0 0 1 3 . 5 3解时间为 6 9 . 8 1^ 1 1 , 液料比为 4 5 . 1 : 1 1 1 1以 1 此时 白
2 4- 1 0 1 0 9 . 3 1花丹参多糖提取率达到 1 3 . 7 0% 。
2 5 0 1 1 0 1 1 . 4 5 2 . 1 . 3 交互作用分析
^JI等高线的形状可反映出 交互效应的强弱 ,椭圆
2 8 0 0 11 9 . 6 6形表示两因素间交互作用显著 ,而圆形则与之相反 。
2 9 1 0
1 0
‘ 1 - 4 1图 1 表明各因素间交互作用等高线 图均近似圆形 ’
说明交互作用对 白花丹参多糖提取率 的 影响不显
表 3 纖■纖析
著 ,与方差分析结果一致 。
参数平方和 自 由 度 均方F P显著性
模型 1 0 6 . 8 0 1 4 7 . 6 3 1 9 . 3 8< 0 . 0 0 0 1* * *
A
1 5 . 9 41 1 5 . 9 4 4 0 . 4 8< 0 . 0 0 0 1* * *
B 0 . 2 2 1 0 . 2 2 0 . 5 5 0 . 4 7 1 1 1 4 . 0
C 1 4 . 5 0 1 1 4 . 5 0 3 6 . 8 2< 0 . 0 0 0 1***
D 0 . 0 1 41 0 . 0 1 4 0 . 0 3 6 0 . 8 5 3 1^ n . O
AB 0 . 0 2 3 I 0 . 0 2 3 0 . 0 5 7 0 . 8 1 4 5 ¥J 0 °
AC 0 . 7 11 0 . 7 1 1 . 7 9 0 . 2 0 2 0 _g o
AD 0 . 0 2 71 0 . 0 2 7 0 . 0 6 9 0 . 7 9 6 4城 7 . 0
|
BC 0 . 3 4 1 0 . 3 4 0 . 8 5 0 . 3 7 1 0
\^<\
5 8 . 0V)"> 6 0 0BD 0 . 1 3 1 0 . 1 3 0 . 3 4 0 . 5 7 0 0 ^乂^^ 5 2 . 0 ‘
c° 1 0 1 1L 0 7 2 . 7 2° - 1 2 1 3
A 2 4 1 . 8 01 4 1 . 8 0 1 0 6 . 1 8< 0 . 0 0 0 1* * *七 4 6 . 0 2 0 . 0^
Bl 1 3 . 3 31 1 3 . 3 3 3 3 . 8 6< 0 0 0 ° 1* * * a 酶解温度与液料比交互作用图
C 2 2 2 . 7 7 1 2 2 . 7 7 5 7 . 8 4< 0 . 0 0 0 1 * * *
D 2 3 3 . 6 11 3 3 . 6 1 8 5 . 3 6< 0 . 0 0 0 1* * *
残差 5 . 5 1 1 4 0 . 3 9
1 4 . 0^
失拟项 4 . 7 0 1 0 0 . 4 7 2 . 3 1 0 . 2 1 8 0。 1 3 . 0 "
纯误差 0 . 8 1 4 0 . 2 0 i
\
2
{
0
0
总误差U 2 . 3 丨 2 8 g
注 : 变异系数CV值为 6 . 2 7 , /? 2 = 0 . 9 5 0 9 , /? 2A < J
j
= 0 . 9 0 1 8 ; … 麗表示差异紐著⑷請 丨 ) , * *表示 差鮮常贿 ( P < G . G 1 ) , *¥ 7 0 , °表示差异藤 ( P < 0 . 0 5 ) 。
_^ 2^ 0 0 X)
2 .
1
. 2 方雖立与棘侧
多糖提取率 ( <? )与 自 变量的二次多项 回归拟合句、 .狐 2 0 0K:#
方程 : 丨>酶解时间与液料 比交互作用图
囫
生物工程
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2 . 2 验证优化后工艺
将白花丹参多糖提取的最佳工艺参数微调为 :
1 3 . 0
1 |复合酶酶解温度 5 2 t , 酶添加量 8 . 0 m g/mL , 酶解
J1 2 . 0
‘‘
时间 为 7 0 m in ,液料比为 4 5 : 1mL/g , 为检验响应面
|
‘
|、法优化后的工艺可靠性 ,此条件下平行进行 3 组实城 验 , 白花丹参多糖 、还原糖提取率的平均值分别 为
1 0 ' °
1 3 . 3 6 % 、 6 . 1 7 % ,此多糖提取率值与 回归方程理论
预测值 1 3 . 7 0 %的相对误差为 2 . 4 8 % 。
6 . (T ! 0 . 0-. 0 "?J 2 . 3 理化性质
c? 酶添加量与液料 比交互作用 图二 …白花丹参多糖易溶于水 ,难裕于 乙醚 、丙酮等有
^^ 机溶剂 ; pH 值等于 6 . 0 3 , 表 明其为酸性多糖 ; 碘一
1
4 . 0 |J
1 3 . 0
[ 碘化 钾 i式剂 反 应为 阴 性 , 无 淀 粉存在 ; 在 波 长承1 2 . 0
5 8 9 nm处的旋光度值为 - 0 . 1 0 1 ,计算 比旋光度 为
|
‘
9 .o
|
-
5 0 . 5
,提示 白花丹参多糖为左旋型 。 粘度特性结
城 7 -°果见图 2 ,样 品多糖溶液粘度随温度 的提高而下降 ,
9 0
8
°
0^\CL_^^ 5>q5 8 - 0随着剪切速度的增大而下降 ,表现为剪切稀化现象 ,
白花丹参多糖水溶液为假塑性流体 。芍?n' 3 0 . 0 4 6 . 0
d 酶解时间与酶解温度交互作用图 1 8 ■
!
十 2 0 T
_H ̄^ 5 0 X
i ^\
l|r^^ . 疆 丨^ 7 . 0° 1 5 9 1 3 1 7
剪憾度/m i , , '
1 0 . 0 <Z /)r> 5 8 . 0
图 2 温 度与剪切速度对样品溶液粘度特性的影响
2 . 4 錯颇随 it甜 石贼
e PB添加量与酶解温度效作用 If!结果如图 3 ̄ 图 4 所 7K , 白花丹参多糖浓度 力
8m g/mL 时 , 其对 DPPH 自 由 基 的 清 除 率 达 到
8 8 . 5 1 % ,但小于 Vc 。 白 花丹参多糖清除 DPPH 的
半数抑制浓度 ( IC 5 0 ) 为 0 . 9 6 9mg/mL ,Vc 的IC 5 fl为
^j q q , 0 . 6 9 7 mg/mL。 白 花丹参多糖浓度达到 1 0m g/mL
1 时 ,对 自 由基 ? 0 H 的清除率达到 8 8 . 5 7 % ,細同
^ 7 ' ° 浓度的 Vc对 ? 0 H 的清除率高达 9 8 . 0 4% , 因此与
 ̄ V e K较 , 白花丹参多糖清除 ? 0 H 的能力较 弱 。 白^花丹参多糖对 自 由 基 ? 0 H 的 IC 5 。为 3 . 1 1 4 mg/mL ,
Vc 的 1 (:
5 。为 0 . 4 0 3mg/mL。
f _添加量与酶解时间交互作用 图
3 结论
图 1 交互作用的响应面图
孟国良等采用正交实验法分别研究了 白 花丹参
_
粮油食品科技 第 2 3 卷 2 0 1 5 年 第 4 期
生物工程
营养品 、美容护肤品 、 中药复方的添加剂等 , 下一步
1 0 0
-
1
Dni l研究将重点探讨白花丹参多糖的化学组成 、相对分
8 0
-□V
,
; rhI
| 6 o| l |子质量分布 、单糖组 成 、波谱分析及其体 内 药理活
|
0f | | | 性 ’ 为其研发应用提供更多信息 。: ^1 1II|参考文献 :
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响应面优化得到 白花丹参多糖复合酶提取的最优工[ 1 1 ] 蒋德旗 , 黄 利敏 , 王艳 , 等 . 响应面优化纤维素酶法提取桂花
艺参数如下 : 复合酶添加量 8 . 0 mg/m L 、 酶解时间多糖工艺及其抗氧活 性研究 [ J ] . 食品 工业科技 , Ml 5 , 3 5
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糖提取率实 际实验值为 1 3 . 3 6% , 与 理论预测 值[ 1 2 ] 郑林龙 ’ 蒋剑平 ’ 许海顺 ’ 等 . 响应面法优化土获苳多糖的提
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1 3 . 7 0% 相对误差小于 5 % , 表明通过响应面法优化
( 3 ) : 9 1 8
-
9 2 2 .
得到的模型参数准确可靠 , 且多糖提取率高于超声
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?OH 和 DPPH 均有 除效 应 , 表明具有一 体[ 1 4 ] 孟国 良 , 王峰祥 . 白 花丹参 多糖的超声提取工艺研究 [ J ] . 现
外抗氧化活性 ,但与 V c 比较 ,其清除这两种 自 由基代中药研究与实践 , 2 0 0 9 , 2 3 ( 1 ) : 6 7 _ 6 8 .
力 [ 1 5 ] 刘振亮 , 张 昌军 , 刘克 , 等 . 白 花丹参多糖含量测定及其抗氧
研究结果提示 白花丹参多糖在功能食品或药 口口口化性研究m . 山 东农业大学学报 : 自然科学版 ’ 2 0 1 3 , 4 4 ( 3 ) :
添加剂的开发中具有一定的应用价值 ,如作为保健 3 5 7 #
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