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分光光度法测定湘产苦丁茶中熊果酸含量



全 文 :第 23卷 ,第 2期 光 谱 实 验 室 Vol . 2 3 , No . 2
2 0 0 6年 3月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory March , 2 0 0 6
分光光度法测定湘产苦丁茶中熊果酸含量
① 联系人 ,电话: ( 0744) 8231386;手机: ( 0) 13974439187; E-mail: li guozhang32898@ 163. com
作者简介:李国章 ( 1965— ) ,男 ,湖南省常德市人 ,工程师 ,从事生物化工教学与科研工作。
收稿日期: 2005-12-05;接受日期: 2005-12-23
李国章① 于华忠 卜晓英 曹 庸 饶力群a
(湖南省林产化工工程重点实验室 湖南省张家界市吉首大学张家界校区  427000)
a(湖南农业大学生物科学与技术学院 长沙市  410128)
摘 要 用 5%香草醛 -冰醋酸、高氯酸显色 ,以熊果酸纯品为对照 ,在波长 548nm处用分光光度法测
定湘产 3种苦丁茶中熊果酸的含量。 方法线性范围为 20— 100μg /5mL ,实验回收率为 98. 96% , RSD=
1. 67% ;精密度、重现性好 ;对照品和样品溶液在 1h内稳定。 该方法操作方便、简单 ,可用于苦丁茶中熊果
酸的定量检测。
关键词 熊果酸 ,分光光度法 ,苦丁茶。
中图分类号: O657. 32   文献标识码: B   文章编号: 1004-8138( 2006) 02-0401-04
1 前言
苦丁茶在我国南方常作为代用茶 ,具有清热解毒、抑菌消炎、止渴生津、提神醒脑、调节血压和
血脂等功效 [1, 2 ]。苦丁茶作为代用茶在我国南方已有两千多年的历史 ,其良好的药用和保健功能得
到了证实 ,并有“绿色黄金”的美誉。苦丁茶营养丰富:它含有多种人体必需氨基酸 ,维生素 C、 B1、
B2、 E,黄酮类和三萜类化合物等有用成分 ,熊果酸 ( Ursolic acid U A)就是其中之一。熊果酸又名乌
索酸 ,是具有五环的三萜皂甙类化合物 ,存在于多种植物体内 ,在苦丁茶内有较高含量。研究表明 ,
熊果酸具有多方面的药理作用 ,它对体外革兰氏阳性菌 ,革兰氏阴性菌 ,酵母菌均有活性 ,还有抗溃
疡、镇咳、抗癌作用 ,可以抗突变、抗氧化和诱导癌细胞的分化。 其具有毒性小 ,抗肿瘤活性强的特
点 , 作为一种很有开发价值的植物活性成分 ,已引起了科研工作者的重视。已有从苦丁茶中提取
熊果酸的工艺研究和检测方法的研究 ,检测方法多用薄层扫描法和高效液相色谱法。本文研究了用
分光光度法检测苦丁茶中熊果酸的含量 ,并检测了湘产冬青科冬青属 3种苦丁茶中熊果酸含量 ,为
不具备高效液相色谱仪和薄层扫描法色谱仪这些昂贵设备的部门提供另一种快速便捷的检测方
法 ,以期有益于苦丁茶的综合利用和对熊果酸的进一步研究。
2 实验部分
2. 1 仪器、试剂与材料
UV -160A紫外可见分光光度计 (日本岛津公司 ) , RE540旋转蒸发仪 (日本 yamato公司 )、 FD-
1真空冷冻干燥机 (上海益生公司 )、 AEL-40 SM十万分之一电子天平 (日本岛津公司 ) , AEG-220
万分之一电子天平 (日本岛津公司 )。
熊果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供 ,批号为 1107422200315。甲醇、乙醇等试剂均
为国产分析纯。
本试验所用苦丁茶材料在不同时间采于不同地点 ,经吉首大学城乡资源与规划学院植物学教
研室鉴定确认其品种。 见表 1。
表 1 材料品种及来源
材料编号 品种 采集地点   采集时间 使用部位
1 大叶冬青 ( Ilex Lat ifolia Thumb. ) 张家界永定林场 2005. 5 老叶
2 苦丁茶 ( Ilex Kudingcha C. J. Tseng) 张家界后坪 2005. 6 老叶
3 枸骨 ( Ilex Cornuta Lindl. ) 桑植八大公山 2005. 7 老叶
2. 2 实验方法 [ 4— 6]
2. 2. 1 对照品溶液的制备
准确称取 105℃干燥至恒重的熊果酸对照品 10. 0mg , 置于 100m L容量瓶中 ,加无水乙醇溶解
并稀释至刻度 ,摇匀。 得浓度为 100μg /mL对照品。
2. 2. 2 样品溶液的制备
将上述 3种苦丁茶供试品在 50℃干燥 ,粉碎过 40目筛。 各准确称取约 5. 000g置于索氏提取
器中 ,加入 95%的乙醇 60mL,于 85℃水浴回流提取 2. 5h,抽滤 ,滤渣按上述条件重复提取 ,共 3
次。合并滤液 ,减压回收乙醇 ,残留物放冷至室温 ,用无水乙醇溶解并定容至 50mL,准确吸取 3mL
于 50mL容量瓶中 ,用无水乙醇定容至刻度 ,制得供试品溶液。
图 1 熊果酸可见光吸收图
1—— 对照品 ;2—— 供试品 ;3——空白对照。
2. 2. 3 测定波长的确定
准确吸取对照品溶液 0. 4mL,供试品溶液 0. 4mL,分别
置于 5mL容量瓶中 ,加人 5%香草醛乙酸溶液 0. 2mL、高氯
酸 0. 8mL,将容量瓶放人 60℃热水浴中加热 15min,放冷至
室温 ,用冰醋酸定容至刻度 ,摇匀 ;以供试品溶液 1. 0mL,不
加显色剂香草醛乙酸溶液及高氯酸 ,同法制得空白对照液。
将 3种溶液于波长 400— 800nm间扫描。供试品溶液及对照
品溶液均在波长 548nm处有良好吸收峰 ,空白无干扰 ,如图
1所示。
3 结果与讨论
3. 1 校准曲线的制备
  准确吸取对照溶液 0. 2、
0. 4、 0. 6、 0. 8、 1. 0mL分别置于
5mL容量瓶中 ,加人 5%香草醛
乙酸溶液 0. 2mL、高氯酸 0. 8mL,
表 2 对照品不同熊果酸含量的吸光值
对照品溶液体积 ( mL) 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0
对照品中熊果酸含量 (μg) 20 40 60 80 100
吸光值 0. 137 0. 212 0. 301 0. 402 0. 489
将容量瓶放人 60℃热水浴中加热 l5min,放冷至室温 ,用冰醋酸定容至刻度 ,摇匀。以未加对照品的
比色液做空白 ,在波长 548nm处测定吸收值 ,结果见表 2。
以熊果酸的μg数为横坐标 ,吸光值为纵坐标 ,作图得到校准曲线 ,其回归方程为 y= 0. 00447x
+ 0. 0400, r= 0. 9995,结果表明 ,熊果酸在 20— 100μg /5mL范围内 ,熊果酸μg数与其吸光值呈良
好的线性关系。
3. 2 稳定性实验
取对照品溶液及供试品溶液 1. 0m L左右 ,同上述方法制备比色液后每间隔 10min在选定波长
402 光谱实验室 第 23卷
处测定吸光值 ,结果见表 3。
表 3 不同时间吸光度值
溶液种类 吸光度 平均值 RSD(% )
对照品溶液 0. 486  0. 483  0. 478  0. 474  0. 468  0. 457 0. 473 2. 27
供试品溶液 0. 241  0. 240  0. 238  0. 235  0. 230  0. 223 0. 235 2. 94
  由表 2可见 ,在显色 1h内 ,对照品溶液和供试品溶液稳定性都比较好。
3. 3 精密度实验
取同一批样品 ,进行 6次平行试验 ,测定含量 ,结果: RSD= 1. 98% (n= 6) ,表明精密度良好。
3. 4 重现性实验
准确称取同一批苦丁茶粗粉 5份 ,每份约 5g ,按 2. 2. 2项方法制备供试品溶液 ,并按 3. 1项方
法测定熊果酸的含量。 结果表明 ,熊果酸含量的均值为 1. 15% , RSD= 2. 71% 。
3. 5 回收率试验
准确称取已知含量的苦丁茶粉末 ,准确加入一定量的熊果酸对照品 ,按 2. 2. 2项方法制备样品
溶液和 2. 2. 3项方法显色测定 ,平均回收率为 98. 96% , RSD= 1. 67% ,结果见表 4。
表 4 加标回收率试验
试验号 样品折算熊果酸含量
( mg)
加入对照品量
(mg )
测得量
( mg)
回收率
(% )
平均回收率
(% )
RSD
(% )
1 9. 321 1. 080 10. 381 98. 14
2 8. 512 1. 051 9. 529 96. 76
3 7. 373 0. 836 8. 213 100. 47 98. 96 1. 67
4 6. 215 0. 857 7. 083 101. 28
5 5. 438 0. 663 6. 093 98. 79
6 5. 576 0. 653 6. 218 98. 32
3. 6 样品测定
按 2. 2. 2项制备样品溶液 ,每次取 1. 0mL供试样品液 ,按 3. 1项方法于选定波长下测定吸光
值 ,每样做 3个平行试验。 按下式计算苦丁茶中熊果酸的质量百分比:
Z= [ ( 223. 714× y- 8. 949)× 2500 /3 ] /m× 100
式中:Z——苦丁茶中熊果酸的质量百分比 ,% ; y—— 样品测得吸光值 ; m——样品质量 , mg。
各样品测定结果见表 5。
表 5 湘产 3种苦丁茶熊果酸含量测定结果 (n= 3)
材料编号 样   品      熊果酸质量百分比 (% ) RSD(% )
1 大叶冬青 ( Ilex Lat ifolia Thumb. ) 1. 16 2. 53
2 苦丁茶 ( Ilex Kudingcha C. J. Tseng) 0. 71 3. 15
3 枸骨 ( Ilex Cornuta Lindl. ) 0. 97 2. 76
4 讨论 [7, 8 ]
( 1)紫外分光光度法测定苦丁茶中熊果酸含量具有比高效液相色谱法更为简便、快捷等优点 ,
且回收率高、重现性好、适用于生产在线检测。
( 2)熊果酸为五环三萜类化合物 ,易溶于二氧六环吡啶 ,溶于甲醇、乙醇、丁醇、略溶于丙酮 ,微
溶于苯、氯仿、乙醚 ,不溶于水和石油醚。考虑到实际生产时的成本和试剂的安全性 ,选用乙醇较适
宜 ,故本实验选用乙醇。
( 3) 在我国 ,有 5科 16种 1变种植物在不同地区作为苦丁茶使用或称作苦丁茶 ,而湘产苦丁
403第 2期 李国章等:分光光度法测定湘产苦丁茶中熊果酸含量
茶多为以上冬青科 3种。不同科冬青茶熊果酸含量差异较大 [3 ] ,而本实验结果显示 ,冬青科同科 3
种苦丁茶熊果酸含量虽有差异 ,但差异不是很大。实验所用材料为老叶 ,不同生龄材料不同部位熊
果酸含量情况有待进一步研究。
参考文献
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[6 ]刘刚 .苦丁茶的化学成分及药理研究进展 [ J ].湖北中医杂志 , 1999, 21( 1): 46— 47.
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Determination of Ursolic Acid in Ilex Kudingcha C. J. Tseng
by Spectrophotometry
LI Guo-Zhang  YU Hua-Zhong  BU Xiao-Ying  CAO Yong  RAO Li-Quna
( Hunan Provincial Key Laborator y of Forest Product and Chemical Ind ustry Engineering ,
Jishou University , Zhang jiaj ie, Hunan 427000, P. R. China )
a(College of Biological Science and Technolog y, Jishou University,Changsha 410128,P . R.Ch ina )
Abstract  5% vanillin acetum and perchloric acid as color developer, pure ursolic acid as refer-
ence, the content of ursolic acid in three kinds of Ilex Kudingcha C. J. Tseng grow ed in Hunan
province w ere determined by spect rophotometry at 548nm. The recovery w as 98. 96% with RSD=
1. 67% in the linear range of 20— 100μg /5mL. The solution w as stable within 1h. This method is sim-
ple, easy, precise, accurate and can be used in practical determination of ursolic acid in Ilex Kudingcha
C. J. Tseng.
Key words  Ursolic Acid, Spectropho tometry, Ilex Kudingcha C. J. Tseng.
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404 光谱实验室 第 23卷