全 文 ：浙江大学学报牗农业与生命科学版牘　32牗6牘牶598～ 605牞2006
Journal of Zhejiang University牗Agric. & Life Sci.牘
文章编号牶1008-9209牗2006牘06-0598-08
　　收稿日期牶2006-02-20
基金项目牶国家自然科学基金资助项目牗30370975牘牷浙江省重大科技资助项目牗2005C 12019-02牘牣
作者简介牶张 弢牗1975—牘牞女牞博士牞主要从事植物分子生物学方面的研究牣
通讯作者牶曹家树牞男牞教授牞博士生导师牞从事植物生殖发育及其分子调控方面的研究牣Tel牶0571-86971188牷E-mail牶js hcao@
z ju牣edu牣cn牣
芜菁花粉发育相关基因 BcMF2r 的分子克隆及其生物信息学分析
张 弢牞向 牞叶纨芝牞余小林牞曹家树
牗浙江大学 蔬菜研究所细胞与分子生物学实验室牞浙江杭州 310029牘
摘　要牶根据白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基因 BcMF2 的全长序列设计引物牞通过 PCR直接扩增
的方法从温州盘菜芜菁牗Brassica campestris L牣spp牣rapi f era cv牣Wenzhoupancai牘中克隆到了BcMF2 的
同源基因牞命名为 BcMF2 r牣经与白菜 BcMF2 基因序列比较牞DNA 全长序列相似性高达 90%牣Blast搜索结
果表明牞BcMF2r与拟南芥外切多聚半乳糖醛酸酶在氨基酸水平的的相似性为 87%牞推测 BcMF2 r属于多
聚半乳糖醛酸酶基因牣BcMF2r基因最大开放阅读框为 1263 bp牞编码 420 个氨基酸序列牞编码的蛋白质分
子量为 43. 8 kDa牞等电点为 8. 108牷碱性氨基酸牗K牞R牘36个牷酸性氨基酸牗D牞E牘32个牷疏水氨基酸牗A牞I牞
L牞F牞W牞V牘152个牷极性氨基酸牗N牞C牞Q牞S牞T牞Y牘113个牣推导的氨基酸序列通过 Pro site数据库查询牞
发现该序列包括 3 个 N-糖基化位点牞4 个蛋白激酶 C 磷酸化位点牞6 个酪蛋白激酶 II磷酸化位点牞12 个 N-
豆蔻酰化位点牞1 个多聚半乳糖醛酸酶活性位点牗257 RVTCGPGHGLSVGS牘等牣通过 PROFsec 预测
BcM F2r蛋白质的二级结构牞表明该蛋白含 7. 86% helix牞46. 90% sheet 和 45. 24% lo op牣将 BcMF2r 基
因氨基酸序列与数据库中的其他植物 PG 序列进行同源序列比对牞构建系统进化树牞发现该基因具有所
有 PG基因特有的 4 个保守结构域牞并且与花粉中特异表达的 PG基因聚为一类牞进一步证明了该基因
可能是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因牞在花粉萌发和花粉管伸长中起作用牣
关　键　词牶芜菁牷BcMF2 r牷花粉发育牷克隆牷生物信息学
中图分类号牶Q81牷S631牣3　　　文献标识码牶A
ZHANG Tao牞XIANG Xun牞YE Wan-zhi牞YU Xiao-lin牞CAO Jia-shu(Laboratory of Ce ll &Molecular
Biology牞Institute of Vegetable S cience牞Zhe jiang University牞Hangz hou 310029牞China)
Molecular cloning and bioinformatic analysis of pollen development related gene BcMF2r from Brassica
campestris L牣spp牣rapi f era牣Journal o f Zhejiang Univer sity 牗Agric. & Life Sci.牘牞2006牞32牗6牘牶
598-605
Abstract牶BcMF2r gene牞homolo gous w ith the BcMF2 gene encoding po llen-specific polyg alacturonase of
Chinese cabbage-pak-choi牞was cloned from turnip牗Brassica campestris L牣spp牣rapi fera牘牣Wenzhoupancai
by PCR amplification牞with two pairs of primers designed according to the sequence of BcMF2牣The largest
opening reading frame of BcMF2r gene was 1263 bp in leng th and encoded a protein of 420 amino acids牣The
molecular mass and isoelectric points of the putative pro tein牞calculated by computer analy sis牞was 43. 8 kDa
and 8. 108牞respectively牣Components of amino acids encoded by BcMF2 r contained 36 basic amino acids牗K牞
R牘牞32 acidic amino acids牗D牞E牘牞152 hydrophobic amino acids牗A牞I牞L牞F牞W牞V牘 and 113 polar amino
张 弢牞等牶芜菁花粉发育相关基因 BcMF2r 的分子克隆及其生物信息学分析
acids牗N牞C牞Q牞S牞T牞Y牘牣Blast result shows it shared 87% overall amino acid similarity to PGA3 of
Arabidopsis牣Sequence analysis revealed that it had three po tential N-gly cosylation sites牞four protein kinase C
phospho rylation sites牞 six casein kinase II phosphorylation sites牞 twelve N-myristoylation sites牞 one
polygalacturonase active position牗257 RVTCGPGHGLSVGS牘牞and so on牣The predicted secondary structure
composition for the protein had 7. 86%helix牞46. 90% sheet and 45. 24% loop牣Four domains which are highly
conserved in the all plants and fungal PGs w ere present in BcMF2r牣Phy logenetic analysis showed that BcMF2r
falled into the category of clade-C牞which includes PG related to pollen牣All results test that BcMF2r might act
as polyg alacturonase related to po llen development牣
Key words牶 B rassica campestris L牣 spp牣 rap i f era牷 BcMF2 r牷 po llen deve lopment牷 cloning牷
bio informatic analy sis
　　花粉发育是一个十分复杂的过程牞在这个
过程中牞有大量基因被激活牣在植物发育的主要
阶段至少有 60000个不同的结构基因表达牞其
中大约有 10000种 mRNA为花药特异性的犤1犦牞
到目前为止牞已经有近百个花粉特异基因被克
隆牞如 LL A23犤2犦牞S gPGs牞Sg PME1牞S gGN1犤3犦
等牣所研究的花粉发育特异性基因中有一部分
可以从已报道的基因中找到同源基因牞并推断
基因产物的功能牣如 zm13牞lat56牞lat59牞tp10
等基因编码的蛋白产物与果胶裂解酶具有较高
的同源性犤4-5犦牞而 PG1牞TP27牞S gPGs等则为多
聚半乳糖醛酸酶牗po lyg alacturonase牞PG牘的同
源基因犤6-8犦牣
　　研究表明牞在许多物种的花粉中具有高水
平的外切 PG 活性牞多聚半乳糖醛酸酶可能在
花粉成熟和花粉管伸长中发挥重要的作用犤7犦牣
利用 cDNA-AFLP 技术结合 RACE技术牞本实
验室已从矮脚黄白菜核雄性不育两用系中成
功分离与植物花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基
因 BcMF2牞研究表明该基因只在白菜可育中蕾
和大蕾中特异表达牞大蕾中的表达量大于中蕾牞
而其它部位和时期未表达牷不育花药中未表达牞
初步断定该基因与白菜育性相关牣
　　芜菁是芸薹属作物牞与白菜的亲缘关系较
近牞为此本研究根据白菜 BcMF2 基因序列设
计引物牞通过同源序列克隆的方法获得芜菁中
BcMF2 的同源基因牞并利用生物信息学方法分
析该基因的结构特征牣BcMF2 基因是花粉特异
的多聚半乳糖醛酸酶基因牞研究芜菁以及芸薹
属其它作物中 BcMF2 同源基因有助于更好地
了解 PG基因在芸薹属植物花粉发育中的作用
和雄性不育发生的机制牷同时芜菁是杂种优势
利用比较普遍的作物牞发掘和创建雄性不育系
配制一代杂种对生产实践具有重要意义牞花粉
发育相关基因的克隆有助于通过反义技术阻断
与花粉发育有关基因的表达从而获得雄性不育
植株牣
1　材料与方法
1. 1　试验材料
　　本实验所用材料为芜菁品种温州盘菜
牗Brassica campestris L牣spp牣rapi f era cv牣
Wenzhoupancai牘牞2003年 9月 25日播于苗床牞
10月 25日移栽于试验田牞田间管理按常规进
行牣在苗龄 50 d时牞从群体中随机选取单株牞每
株取 2 ～ 3片鲜嫩叶片牞在开花期选取健康饱
满的花蕾牞所选材料用 75%的酒精棉擦洗干
净牞做好记号牞用纱布包好牞立即投入液氮中固
定牞- 75℃保存备用牣整个取材过程迅速牣
1. 2　主要试剂
　　TRIzoL®购自 Life Technologies 公司牣
Taq plus DNA po lymerase 和 100 bp DNA
Ladde r 为北京鼎国生物技术有限公司生产牣
cDNA 合成试剂盒 SMART TM PCR cDNA
Synthesis Kit 购自 Clontech 公司牣EcoR Ⅰ牞
EDTA 、DEPC 、IPTG 、X-GaL 等购自上海生工
生物工程技术服务有限公司牣T 4 DNA 连接酶 、
pG EM-T-easy-vecto r 购 自 Promega 公 司牣
E牣col i DH5α为本实验室保存的菌株牣
　　制备 RNA 的 1. 5 mL 离心管 、枪头等用
0. 01%的 DEPC 水浸泡处理牞溶解 RNA 的水
599　第 6期
浙江大学学报牗农业与生命科学版牘
用 0. 1% DEPC 处理牞室温过夜牞高压灭菌处
理牣分装氯仿 、异丙醇 、DEPC-水等的玻璃器皿
200 ℃烘烤 2 h牣用于 RNA 电泳的电泳槽 、制胶
槽 、梳子用去污剂洗干净牞再用水冲洗牞用乙醇
干燥牞然后灌满 3%的 H 2O 2 溶液牞于室温放置
10 min牞最后用 0. 1 %DEPC水冲洗干净牣
1. 3　DNA提取 、RNA分离及检测
　　DNA 提取参照本实验室的方法犤9犦牣
　　RNA 的分离参照 Life Technolog ies公司
T RIzoL ®的说明书进行牣RNA 沉淀室温干燥 5
～ 10 min牞用 DEPC水溶解牞- 75 ℃保存备用牣
用分光光度计测定 OD260和 OD280牞根据 OD260
值计算 RNA 产量牷根据 OD260牤OD 280值判断
RNA 的质量牣RNA 甲醛变性凝胶电泳检测
RNA 的质量参照分子克隆牣
　　cDNA 第一链和第二链的合成参照
SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit User
Manual 方法牣
1. 4　引物合成
　　根据 BcMF2 的 cDNA 序列的 5-UT R和
3-UT R序列设计一对引物牗P Ⅰ牘牞扩增目的基
因的 DNA 全长序列牣引物序列在 5端引入
BamH Ⅰ酶切位点牞3端引入 Xbal Ⅰ酶切位
点牣引物序列为牶P1牶5-GA T GGA TTC AAG
ATA T TA TCA CCA TGG C-3牞P2牶5-GCT
TCT AGA CAA CAT CAA GT T ATG TAT
ACC-3牷根据 BcMF2 编码区序列设计另一对
引物牗PⅡ牘牞扩增目的基因的 cDNA 全长牣引物
序列在 5端引入 BamH Ⅰ 酶切位点牞3端引
物引入 Xho Ⅰ酶切位点牣引物序列为牶P3牶5-
GAA GGA TCC ATG GCT AGC GCA AGA
AG-3牞P4牶5-GCG CTC GAG AGC TTA
T TT GGG ACA CAG-3牞下划线部分为酶切
位点牣
　　引物序列委托上海生工生物工程技术服务
有限公司合成牣
1. 5　目的基因的 PCR扩增 、克隆和测序
　　分别以温州盘菜总 DNA 以及花蕾双链
cDNA 为模板牞以 PⅠ和 PⅡ为引物牞扩增基因
全长和 cDNA 全长牣PCR反应体系牶DNA 模板
0. 5 μL牞10 ×PCR 反应 缓冲 液 2. 5 μL牞
10 μmol爛L -1 dNTP 0. 5 μL牞上下游引物牗10
μmol爛L - 1牘各 0. 5μL牞Taq DNA 聚合酶 1. 5单
位牞加灭菌水至总体积 25 μL牣PCR扩增条件牶
94℃牞2 min牷94℃牞30 s牷61℃牞30 s牷72℃牞2
min牷35个循环后牞72℃延伸 10 min牣
　　PCR产物用 VITAGENE公司的 DNA 凝
胶回收试剂盒回收牞回收的产物插入 pGEM-T-
easy-vecto r 载体牞连接产物转化大肠杆菌
DH5α牞在含有 IPTG 和 X-gal 的氨苄青霉素
LB培养基上挑选白色重组克隆牣碱裂解法抽
提质粒牞用 EcoRⅠ进行单酶切鉴定和 PCR鉴
定后牞送上海博亚生物公司测序牞基因命名为
BcMF2 r牣
1. 6　核苷酸序列分析牞同源比对和系统树构建
　　DNAS tar 软件分析 BcMF2r 基因最大开
放阅读框牞推导氨基酸序列牷并通过ht tp牶牤牤
www.EMBL-Heidelbe rg牣de 对其编码蛋白序
列进行结构特征分析牷利用 ClustalX牗version
1. 8牘软件将 BcMF2 r 与数据库中的其他 PG 序
列牗表 1牘进行同源序列的多重排定牞MEGA2. 1
构建 N J 系统树牞节点支持率使用 1000 次
boo tst rap检验牣
表 1　研究中所引用的植物 PG基因
Table 1　Plant PG genes u sed in thi s study
　　物　种 序列登录号 基因名称
Brassica napus Z49971 PGA
Brassica ra pa AJ428543 BrPG1
Brassica napus X95800 -
Cucumis melo AJ002532 MPG1
Actinidia deliciosa var del icisoa L12019 -
Brassica napus AJ250919 PGAZ
Cucumis melo AF062466 MPG2
Lycopersicon esculentum U70480 T APG2
Prunus persica X76735 PRF5
Py rus communis AB084462 PC-PG2
Zea mays X62385 -
Brassica napus L19879 S ta44-4
Med icag o sat iva U20431 MePG
Nicotiana tabacum X71020 PG1
Gossy pium hirsutum U09717 G9
Arabidop sis thal iana X73222 PGA2
Arabidop sis thal iana AAF02888 PGA3
600 第 3 2卷　
张 弢牞等牶芜菁花粉发育相关基因 BcMF2r 的分子克隆及其生物信息学分析
2　结果与分析
2. 1　芜菁 BcMF2 同源基因 BcMF2 r 基因的
克隆与分析
　　分别以温州盘菜总 DNA 以及花蕾双链
cDNA 为模板牞以 PI 和 PII 为引物牞扩增
BcMF2r 基因全长牗图 1A牘和 cDN A 全长牗图
1B牘牣PCR扩增结果与预期的条带大小一致牣将
目的基因克隆到 pG EM-Teasy 载体上牞转化
E牣coli DH5α牣通过蓝白斑筛选阳性克隆牞碱法
提取重组质粒牞EcoR Ⅰ酶切鉴定牗图 1C牘牞结果
表明目的基因已被成功克隆牣对重组质粒的插
入片段进行全序列测定牣测序结果牗图 2牘表明牶
除去酶切位点和保护碱基牞BcMF2r 基因 DNA
全长 1605 bp牞cDNA 实际长度为 1263 bp牣
　　图 A 为 BcMF2r 基因 DNA 全长扩增结果牷图 B为 B cMF2 r 基因 cDNA 全长扩增结果牷图 C 为 BcMF2 r 基因
cDNA 全长酶切鉴定结果牣M-核酸的 100 bp ladder DNA 标准分子量牷1 ～ 5牗A牘-BcMF2 r 特异 DNA 全长牷1牗B牘-
B cMF2 r 特异 cDNA 全长牷1牞2牗C牘-BcMF2 r 酶切产物牣
图 1　BcMF2r 基因的 PCR 扩增和重组质粒酶切鉴定
Fig牣1　Ident ifi cation of PCR amplif ication and recom binant plasmid digest ion of BcMF2 cDNA
　　与白菜 BcMF2 基因序列比较牞同源性高达
90%牣BLAST 结果表明牶BcMF2r 基因与来自拟
南芥的外切多聚半乳糖醛酸酶基因在氨基酸水
平上有 87%的相似性牞推断该基因属于多聚半
乳糖醛酸酶基因家族牣BcMF2r 基因牗图 2牘与白
菜BcMF2 基因一样牞包含 3个内含子和四个外
显子牞这与 Tebbutt牞et al牗1994牘提出的花粉特异
的 PG基因内含子数只有 3 ～ 4个的说法一致牣
内含子的长度依次为 142 bp 、75 bp和 83 bp牞所
有外显子-内含子交接点处序列都遵守 GT-AG
规律牞而且 BcMF2r 基因内含子的数目 、位置以
及碱基组成与白菜 BcMF2 基因完全一致牣比较
BcMF2r 基因与白菜 BcMF2 基因外显子牞在第
一个外显子内有 2处碱基替换牗G→A牞A→C牘牞
第二个外显子内仅有一个碱基替换牗G→A牘牞第
三个外显子发生 3处碱基替换牗G→A牞C→T牞G
→A牘牞第四个外显子内有 4个碱基替换牞并有连
续 3个碱基的缺失牗对芜菁而言牘牣
　　BcMF2r 基因的 cDNA 编码区序列 1263
bp牞比白菜少3个碱基牞序列同源性99. 1%牷氨基
酸序列同源性 98. 1%牞有 6处氨基酸残基代换
牗Y→S牞P→L牞A→T牞A→S牞D→T牘和 1处缺失牣
2. 2　BcMF2 r基因序列特征分析
　　利用 DNAS tar 软件对 BcMF2 r 基因
cDNA 序列进行分析牞发现该基因最大开放阅
读框为 1263 bp牞编码 420个氨基酸序列牞有研
究表明花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶氨基酸大
小范围在 362和 445个氨基酸之间犤10犦牣对所推
测的 BcMF2r 编码蛋白质特征进行分析表明牞
编码的蛋白质分子量为 43. 8 kDa牞等电点为
8. 108牞pH7. 0时的电荷为 4. 915牷碱性氨基酸
牗K 、R牘36个牷酸性氨基酸牗D 、E牘32个牷疏水氨
基酸牗A 、I、L 、F 、W 、V牘152个牷极性氨基酸牗N牞
C牞Q牞S牞T牞Y牘113个牣
601　第 6期
浙江大学学报牗农业与生命科学版牘
　　加黑部分为起始密码子 ATG 和终止密码子 TAA牞阴影部分表示三个内含子序列牞粗下划线部分为 N-糖基化位点牞细下
划线为多聚半乳糖醛酸酶活性位点牣
图 2　BcMF2r基因核苷酸序列及推测氨基酸序列
Fig牣2　Nucleot ide and deduced amino acid sequences of BcMF2 r gene
602 第 3 2卷　
张 弢牞等牶芜菁花粉发育相关基因 BcMF2r 的分子克隆及其生物信息学分析
黑体部分为所有序列中的保守序列牷下划线部分分别对应 PG 基因四个保守结构域牣
图 3　BcMF2 r推测氨基酸序列与数据库中其他PG 基因的同源比对
Fig牣3　Alignm en t of the predicted amino acid f rom BcMF2 r and variou s other PG genes
603　第 6期
浙江大学学报牗农业与生命科学版牘
　　推导的氨基酸序列通过 Prosi te 数据库查
询牞发现该序列包括 3个N-糖基化位点牞4个蛋
白激酶 C 磷酸化位点牞6个酪蛋白激酶 II磷酸
化位点牞12个 N-豆蔻酰化位点牞1个多聚半乳
糖醛酸酶活性位点牗257RVTCGPGHGLSVGS牘
等牣通过 PROFsec预测 BcMF2r 蛋白质的二级
结构牞表明该蛋白含 7. 86% helix牞46. 90%
sheet 和 45. 24% loop牣
2. 3　同源比对与系统树构建
　　从 GeneBank牤EMBL牤DDBJ 数 据库中
下载其他植物中 PG 基因牗表 1牘牞将 BcMF2r
基因氨基酸序列与数据库中的其他 PG 序列进
行同源序列比对牗图 3牘牞发现其具有所有 PG 所
特有的四个功能结构域牞其中结构域 I
牗SPN TDG牘、II牗GDDC牘中的三个天冬酰氨残
基和结构域 III牗CGPGHGISIGSLG牘中的 H 残
基被认为与催化反应有关牞高度保守的带正电
的结构域 IV牗RIK牘和基质中的羧基相互作用牞
说明该基因是典型的多聚半乳糖醛酸酶基因牣
值得注意的是牞所推测的 BcMF2r 基因的氨基
酸序列中包含10个 Cys结合位点牞其中大多数
在比对的所有 PG基因中都是保守的牞半胱氨
酸可能在维持胞外蛋白的三维结构中发挥重要
作用犤8犦牣用 MEGA2. 0构建的系统树牗图 4牘表
明牞根据 Hadfield 建立的多聚半乳糖醛酸酶基
因的分类结果犤11犦牞BcMF2r 基因明显属于与花
粉发育相关的 PG 基因牷这些结果表明
BcMF2 r 基因可能编码花粉特异的多聚半乳糖
醛酸酶牞在花粉受精和花粉管的伸长中起
作用牣
图中数字为自举检验置信值牗1000个复制序列牘牣
图 4　用 NJ法构建的植物 PG基因编码氨基酸序列的分子进化树
Fig牣4　Molecular phylogenet ic t rees based on th e dedu ced amino acid sequences of plant PGs u sing NJ m ethod
3　讨　论
　　通过同源序列克隆法牞我们成功地从芜菁
中克隆了白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基
因 BcMF2 的同源基因 BcMF2r牞两者在 DNA
水平上的相似性为 90%牞氨基酸水平相似性
98. 1%牞BLAST 搜索结果表明牞BcMF2r 基因
与拟南芥外切多聚半乳糖醛酸酶在氨基酸水平
上有 87%的相似性牞推测该基因属于多聚半乳
糖醛酸酶基因牞可能与 BcMF2 具有相同的表
达模式和功能牣
　　PG基因是植物发育过程中的一个重要基
因牞在植物发育不同阶段和不同组织中表达牞
Hadf ield等牗1998牘对众多已克隆植物 PG的氨
基酸序列进行分析牞将 PG 分成三大分化单位牞
604 第 3 2卷　
张 弢牞等牶芜菁花粉发育相关基因 BcMF2r 的分子克隆及其生物信息学分析
即分化单位 A牗果实成熟牘牞分化单位 B牗脱落
区牘牞分化单位 C牗花粉特异牘牣目前已被克隆的
果实 PG基因大约有 8 kb的转录单位牞编码区
序列一般为 4 kb左右牞被 8个大小不一的内含
子打断牞每个基因组中可能只含有一个 PG 基
因拷贝牣花粉专一的 PG基因内含子数量较少牞
只有 3 ～ 4个牞这与本文的研究结果一致牣果实
成熟的 PG 有一个相当长的氨基结构域牞在这
一结构域内大约在 105位的保守天冬氨酸处有
一保守的小区 F-G-A-犤KR犦-G-D-G牞而在花粉
PG中则没有牷不同 PG基因家族成员编码的氨
基酸序列差异较大牞但仍有一些高度保守的区
域存在牞这些高度保守的残基与催化功能有关牣
本实验克隆的多聚半乳糖醛酸酶同源基因
BcMF2r牞具有所有 PG基因所特有的四个保守
结构域牞并且与花粉中特异表达的基因聚为一
类牣值得注意的是牞所推测的 BcMF2r 的氨基
酸序列中包含 10个Cys结合位点牞其中的大多
数在比对的 PG 基因中都是保守的牞半胱氨酸
可能在维持胞外蛋白的三维结构中发挥重要作
用犤8犦牣这些结果表明 BcMF2 r 基因可能作为外
切多聚半乳糖醛酸酶在花粉发育中发挥作用牞
但具体的功能及表达模式仍在进一步研究
之中牣
　　另外牞随着各种生物信息学数据库的迅速
完善牞广泛的 DNA 和蛋白质数据库的创建为
新基因的克隆提供了可利用的资源牣同源序列
克隆法就是在这种条件下应运而生牞其最基本
的思路是牶在事先已经得到同源基因的基础上牞
根据基因序列上的同源保守区域设计 PCR引
物牞在相近物种中分离行使相同或相似功能的
高度保守的同源基因牣物种中蛋白和核苷酸序
列进化上的保守区往往是行使功能的区域牞而
不同物种的同源基因功能有很大的相似性牞因
而在核酸同源保守区设计 PCR引物具有可靠
的理论基础牞同源序列克隆法作为一种简捷而
有效的快速克隆方法牞已成为不同物种基因功
能研究的强有力的基础性手段牣
References牶
犤1犦　Kam alay J C牞Goldberg R B牣Regu lat ion of s tru ctural
gene expression in tobacco 犤J犦牣 Cel l牞 1980牞 19牶
935-946牣
犤2犦　H uang J C牞Lin S M牞Wang C S牣A pollen-speci fic and
desiccation-ass ociated t ranscript in Li lium long i f lorum
during development and st res s犤J犦牣Plant and Cel l
Physiology牞2000牞41牗4牘牶477-485牣
犤3犦　Futamu ra N牞M ori H牞Kouchi H牣Male flow er-speci fic
ex pres sion of genes for polygalactu ronase牞 pectin
meth ylesterase and beta-1牞3-glucanase in a dioeciou s
wi llow牗Sa lix gi lgiana S eemen牘犤J犦牣Plant and Cel l
Physiology牞2000牞41牗1牘牶16-26牣
犤4犦　 S tin son J R牞Eis enberg A J牞Willing R P牣Genes
ex pres sed in the m ale gam etophyte of f low ering plan ts
and thei r isolat ion犤J犦牣Plant Physiology牞 1987牞 83牶
442-447牣
犤5犦　Rogers H J牞H arvey A牞Lonsdale D M牣Isolat ion and
characteriz at ion of a tobacco gene w ith h om ology to
pectate lyase牞 w hich is specially ex pres sed du ring
microsporogenesis犤J犦牣Plant Molecular Biology牞1992牞
20牶493-502牣
犤6犦　Brow n S M牞C rouch M L牣Characterizat ion of a gene
family abundant ly expressed in Oenothera organensis
pollen that show s s equence similarit y to
polygalactu ronase 犤J犦牣 The Plant Cel l牞 1990牞 2牶
263-274牣
犤7犦　Niogret M F牞 Dubald M牞 M andaron P牞 et a l牣
Characterizat ion of pollen p oly galacturonase encoded b y
several cDNA clones in maiz e犤J犦牣Plant Molecular
Biology牞1991牞17牶1155-1164牣
犤8犦　Rob ert L S牞Allard S牞Gerster J L牞et a l牣Isolation and
characteriz at ion of a polygalacturonase gene high ly
ex pres sed in B rassica napus pollen 犤J犦牣 Plant
Molecular Biology牞1993牞23牗6牘牶1273-1278牣
犤9犦　CAO Jia-shu牞CAO Shou-chun牞YI Qing-ming 牗曹家
树牞曹寿椿牞易清明牘牣RAPD analysi s on genomic DNA
of Chinese cabbage and th e other g rou ps of B rassica
犤J犦牣Acta Horticul ture Sinica牗园艺学报牘牞1995牞22牶
47-52牣牗in Chinese牘
犤10犦　Qiu X牞Erick son L牣A pol len-specif ic polygalactu roas e-
like cDNA from alfalfa犤J犦牣Sexual Plant Reproduction牞
1996牞9牶123-124牣
犤11犦　H adfeid K A牞Bennet t A B牣Polygalactu ronases牶many
genes in search of a funct ion犤J犦牣Plant Physiology牞
1998牞117牶337-343牣
605　第 6期