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美洲商陆抗病毒蛋白及其在植物病害防治中的应用



全 文 :2006年 第6期
CHINAPLANTPROTECTION2006,Vol.26.No.6
中国植保导刊
处 理 病情指数 防治效果(%)
20%三唑酮EC1000倍液 5.7 84
电生功能水1周2次 16.1 60
对照 35.9 0
表3 发病后电生功能水对小麦条锈病的防治效果
数为2.59,普遍率为9.72%,效果次于1周2次处
理。试验中还发现,三唑酮处理的小麦叶片有大量的
坏死斑出现,可见是在发病后药效作用的结果。而电
生功能水处理的2个组的健康叶片均无坏死斑,说
明是在锈菌的潜育期就抑制了发病。
在病情指数达到20%后喷洒电生功能水试验,
喷后2周后调查统计小麦条锈病病情指数,计算防
治效果。结果(表3)表明,电生功能水1周2次的喷
洒处理对发病后小麦的防治效果仅达到 60%,弱于
粉锈宁处理的84%。与在条锈菌潜育期开始喷洒时
的效果相比,其差异更大。
可见电生功能水对小麦条锈病的防治作用,主
要是由于对锈菌潜育期这一阶段有明显的杀灭作
用。因此,电生功能水用于未发病时的前期预防有显
著作用,而用于小麦发病后的防治也有一定的效果。
发病前1周喷洒2次电生功能水的防治效果明显比
1周喷1次的好。出现这种结果可能有两个原因:一
是由于电生功能水具有瞬间杀菌的功效,无残效,所
以导致无长期的药效作用;二是电生功能水的喷洒
量还未找到最佳的用量,导致无法完全发挥其杀菌
功效。这也是今后需进一步深入研究的工作。
参考文献:
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专题
综述
美洲商陆(PhytolaccaamericanaL.)是一种茎秆
粗壮的多年生草本植物,原产中南美洲,在我国河
南、湖北、河北等省有栽培或野生。美洲商陆抗病毒
蛋白(pokeweedantiviralproteins,PAP)是从这种植
物不同组织部位分离提纯的一种碱性核糖体失活蛋
白(RibosomeInactivatingProteins,RIPs)。该蛋白具
有一种潜在的能阻碍病毒传播的因子,对多种动植
物病毒具有广谱抗性(Chen等,1991),因而备受全
世界各国研究者的关注。作为植物自身的一种防御
机制,在转基因植物中表达商陆抗病毒蛋白时未形
成某种新病毒的潜在危险,当使用创伤诱导表达启
动子驱动时,可以避免商陆抗病毒蛋白的组成型表
达,而使转基因植株在病毒侵染时表达,并基本上不
会影响植物本身的正常发育(Lodge等,1993)。本文
主要综述美洲商陆抗病毒蛋白的作用机制及其在植
物病害防治上的应用等方面研究的最新进展。
1 美洲商陆抗病毒蛋白的发现史及其理化性质
美洲商陆抗病毒蛋白是从美洲商陆植株体内分
美洲商陆抗病毒蛋白及其在
植物病害防治中的应用
杨 宇
1
,王锡锋
2
,吴元华
1
(1.沈阳农业大学植物保护学院,辽宁 沈阳 110161;2.中国农科院植物保护研究所,北京 100094)
摘要:美洲商陆抗病毒蛋白具有多种生物功能,在植物病害防治中有广阔的发展前景。本文较系统综述了该蛋白的
种类、理化性质、抗病毒机制及其在植物病害防治上的应用等方面的研究进展。
美键词:美洲商陆抗病毒蛋白;抗病毒机制;转基因植物
中图分类号:S476+.9 文献标识码:A 文章编号:1672-6820(2006)06-0023-03
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CHINAPLANTPROTECTION2006,Vol.26.No.6
中国植保导刊
离提纯的一种碱性核糖体失活蛋白 (RIPs)。早在
1918年,Alard就发现烟草花叶病毒(TMV)侵染美
洲商陆后不能再接种到烟草上;之后又发现,黄瓜花
叶病毒(CMV)侵染美洲商陆后不能接种到黄瓜上。
1925年,Duggar和 Armstrong在通过机械接种的方
法研究不同的植物汁液对CMV和TMV的影响时发
现,在美洲商陆叶片的汁液中,有一种潜在的能阻碍
TMV传播的因子,随后Kassanis和Kleczkowski又从
美洲商陆叶片中分离和提纯了这种阻碍因子,并初
步描述了它的一些性质。这种阻碍因子含8%~12%
的碳、14%~15%的氮,与双缩尿呈阳性反应,能被三
氯乙酸、乙醇、饱和硫酸铵沉淀,不能被透析,遇热易
失活。根据这些性质,研究者们认为这种阻碍因子是
一种蛋白质,并称之为美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)
2 美洲商陆抗病毒蛋白的种类
目前已从美洲商陆植株体内分离到数种美洲商
陆抗病毒蛋白(统称PAPs),随季节和植株部位的不
同而得到不同形式的PAP。纯化自美洲商陆叶片中
的 PAP有 3种:一种来自春季叶片的称为 PAP
(Irvin,1975);一种来自夏季叶片的称为PAPⅡ(Irvin
等,1980);还有一种在晚夏(早秋)的时候表达的称
为PAPⅢ(Igor等,2003)。从美洲商陆种子中纯化的
称为PAP-S,从美洲商陆根的培养物中纯化的称为
PAP-R。此外,Kataoka等于1992年依照PAP-S序列
设计引物,从种子中获得了该基因组编码的抗病毒
蛋白a-PAP,这个蛋白与PAP-S类似,但不同。
3 美洲商陆抗病毒蛋白的抗病毒机制
PAP作为一类抗病毒蛋白,实际上是一类同工
酶,它可以使真核细胞核糖体活性丧失。PAP抗病毒
的过程和机制是当机械接种病毒时,寄主细胞受到
损伤,定位于叶肉细胞壁上的 PAP得到释放,随同
病毒粒子一同进入细胞质,通过酶的作用,脱去组成
真核细胞核糖体 60S大亚基成分之一的 28SrRNA
上一个保守茎环处特异位点(4324位)的腺嘌呤,致
使核糖体与蛋白质合成延伸因子2(EF-2)的结合受
到阻碍,核糖体在与氨酰基-tRNA结合的腺嘌呤位
点上移码发生困难,结果受侵染的寄主植物细胞因
蛋白质合成受抑制而死亡,最终导致侵入的病毒由
于不能利用寄主植物细胞的蛋白质合成系统合成自
己所需的蛋白质而随之消亡[1]。PAP这种原位自杀
模式(localsuicidemodel)的抗病毒机制使其在植保
领域具有广泛应用的基础。
此外,还有学者认为PAP本身可以破坏病毒的
核酸。Teltow等(1983)通过对动物的系统研究表明,
PAP的抗病毒活性可能与核糖体失活特性无关。
Rajamohan等(1999)通过定量高效液相色谱分析,
认为PAP、PAPⅡ和PAPⅢ都能引起植物TMV基因
组RNA的脱嘌呤。这一结果表明,PAP的抗病毒活
性也包括对病毒本身RNA的脱嘌呤作用。
最新研究表明,PAP蛋白具有不同的功能区域。
现已证明的有2个:一个位于成熟PAP蛋白的N-端
170~183个氨基酸处,其主要功能是对病毒产生抗
性;另一个位于C-末端1~25个氨基酸处的区域,主
要功能与脱去rRNA的特异位点的腺嘌呤有直接关
系,能对寄主产生毒性,而与对病毒抗性无关。实验证
明,缺少C-端25个氨基酸的PAP丧失了对寄主细胞
的毒性,即不阻碍该细胞蛋白质的正常合成,但仍然
赋予该细胞对侵入病毒的抗性,而将活性区的某一个
氨基酸突变之后,PAP就会丧失对病毒的抗性。
4 美洲商陆抗病毒蛋白在植物病害防治上的应用
4.1 用于制备免疫毒素 PAP与 PAP的突变体被
一些研究者用来制备免疫毒素。从美洲商陆不同组
织部位均分离到一系列商陆抗病毒蛋白(PAP)及一
些单、多肽链抗真菌蛋白。可抑制的植物病毒有
CMV、TMV、苜蓿花叶病毒(AMV)等。
4.2 用于基因克隆及转基因作物 目前采用基因
工程技术,已成功的表达了不同类型的PAP蛋白,
并获得了一些转PAP基因的植株,所抗病毒种类有
马铃薯 X病毒(PVX)、马铃薯 Y病毒(PVY)、马铃
薯卷叶病毒(PLRV)、芜菁花叶病毒(TuMV)等。赵玉
等[2]通过缺失突变的方法,克隆了 2个缺失型 PAP
基因,并在大肠杆菌中得到了相应表达。陈定虎等[3]
通过缺失的方法获得了 N-端和 C-端皆缺失的 PAP
基因,对其进行了原核表达,并在毕赤酵母中分泌了
无寄主毒性的PAP蛋白。抗病毒实验结果表明,其
对不同的烟草病毒均有很好的抑制作用。此研究结
果为对寄主植物无毒性的缺失型PAP蛋白,直接应
用于植物体外防治病毒病害奠定了基础。Lodge等
(1993)将分离获得的 PAPcDNA,通过农杆菌(A-
grobacteriumtumefaciens,又称根癌土壤杆菌)介导
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转化引入烟草和马铃薯,结果表达PAP的转基因植
株表现出对多种机械接种和蚜传病毒的抗性,主要
有PVX、PVY、PLRV等。通过过滤发现,转基因植株
细胞间的汁液中含有大量的PAP。同时,也发现转基
因植株较正常植株生长矮小,而且表现出明显的花
叶症状。Tumer等 (1997)将C-末端缺失一部分的
PAP基因转入烟草中,发现转基因烟草植株能抵抗
PVX的侵染而植株也能正常生长,这也间接证明了
PAP的抗病毒活性与其对寄主的毒性两者的结构和
功能是彼此分离的。国内张海燕、傅道林等(1999~
2000)对PAP的cDNA进行了克隆、测序,并构建了
植物表达载体pPB21,利用农杆菌转化法和微束激
光穿刺技术将该基因导入油菜和马铃薯,获得了抗
TuMV的转基因油菜和抗病毒马铃薯植株。孙晓丽等
通过基因枪方法将 PAP基因导入玉米胚性愈伤组
织,通过PCR、SouthrernBloting检测结果表明,PAP
已经成功转入玉米,获得了再生植株。Wang等[4]获得
了表达 PAPI的转基因烟草对 TMVU1株系、PVX
以及立枯丝核菌均有一定抗性。柴红梅等[5]把抗蚜
虫的GNA基因和抗病毒的a-PAP基因串联在一起
导入烟草品种红花大金元中,力求在不改变原品种
优良品质前提下,选育出兼抗病毒、抗虫的抗性植
株。王进忠等[6]利用美洲商陆抗病毒蛋白具有广谱
抗病毒的特性,通过冻融法将含有PAP基因的重组
表达载体 PBI121转入土壤农杆菌 LBA4404中,利
用叶盘法在农杆菌的介导下转入百合愈伤组织,通
过抗性筛选和PCR检测,获得了转 PAP基因的百
合植株。
4.3 其他应用途径 有研究表明,在美洲商陆植株
汁液中,除有一种潜在的能阻碍病毒传播的因子外,
还含有其他抑菌活性成分。马萧等[7]在对美洲商陆
甲醇粗提物进行的研究中发现,粗提液对TMV表现
出较好的抑制效果,其抑制率达 80%以上,接种前
以美洲商陆甲醇粗提物处理心叶烟叶片,可抑制病
毒的初侵染,相对防效达 87.85%,且推迟了植株发
病时间3~5d。杨帮等[8]研究表明,美洲商陆甲醇提
取物对柑橘绿霉病菌与小麦纹枯病菌有较强的抑制
作用,为进一步综合开发利用美洲商陆抗病毒蛋白
提供了更加广阔的空间。
5 展望
美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)以其独特的抗病毒
机理及广谱的抗性,引起了世界各国植保工作者浓
厚的兴趣。通过多年不断深入的研究,PAP的蛋白特
性,抗病机制已逐步明确。随着分子生物学、酶学,特
别是基因工程技术的发展,PAP在基因及蛋白水平
上的研究工作也有了很大进展。基因及蛋白水平上
的研究结果使得 PAP的抗病毒机理进一步得以阐
明。同时,基因工程技术的发展也为PAP的应用开
辟了新途径。随着科学的发展与社会的进步,传统的
植保手段在各个方面以难以适应人类的要求,PAP
作为一类生物防治手段已越来越得到人们的重视,
不断促进植保工作者对它进行更深入的研究。相信
在不远的将来,PAP必然会在植保领域发挥特殊的
作用与价值。
参考文献:
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收稿日期:2005-12-30;修回日期:2006-02-15
作者简介:杨宇(1981- ),男,辽宁省沈阳市人,在读硕士研究
生,主要研究方向为植物病害的生物防治。
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