全 文 ：收稿日期:2003-01-18;修回日期:2003-04-19
基金项目:国家烟草专卖局重点课题(1102002010);国家科技攻关项目(2001BA509B04)资助
通讯作者 王锡锋 ,研究员 ,研究方向为植物病毒学和转基因植物安全性;E-mail:xfwang319@yahoo.com.cn
作者简介:周倩(1977-),女 ,湖南省衡阳市人 ,硕士 ,主要从事分子植物病理学研究。
植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　33(5):425-428(2003)
毕赤酵母 Mut+和Muts重组子表达美洲商陆
抗病毒蛋白基因的比较
周 倩1 , 2 , 王锡锋1＊ , 李 莉1 , 周广和1 , 高必达2
(1中国农业科学院植物保护研究所 , 北京 100094;2 湖南农业大学植物保护学院 , 长沙 410128)
摘要:将N 末端信号肽和C 末端毒性区域缺失突变的美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein , PAP)基因表达载体 pPIC9K-
P酶切线性化后 , 通过电击转化整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115 菌株细胞中 , PCR 筛选出表型为利用甲醇快速型
(Mut+)的重组子。在相同培养条件下比较 Mut+重组子和利用甲醇缓慢型(Muts)重组子在表达缺失突变型 PAP方面的异同。结
果表明 ,诱导培养 48 h后 ,Mut+重组子表达产物在 SDS-PAGE 胶上可见清晰目的带 ,而Muts 重组子培养72 h 才能见到微弱的目的
带。抗病毒活性实验表明Mut+重组子和 Muts 重组子的表达产物均对 TMV病毒侵染有明显的抑制作用 ,它们的抗病毒活性没有
显著的差异。
关键词:美洲商陆抗病毒蛋白;毕赤酵母;表达;Mut+重组子;Muts 重组子
The expression of pokeweed antiviral protein gene in Pichia pastoris Mut+ and Muts recombinants　
ZHOU Qian1 , 2 , WANG Xi-feng1＊ , LI Li1 , ZHOU Guang-he1 , GAO Bi-da2　(1 Institute of Plant Protection , Chinese Academy of Agricul-
tural Sciences , Bei jing 100094 , China;2College of Plant Protection , Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , China)
Abstract:The expression vector pPIC9K-P including the truncated mutant pokeweed antiviral protein (PAP)gene was li-
nearized and then transformed electrically into Pichia pastoris GS115.The Mut+ recombinant was selected by PCR and the
expression of pokeweed antiviral protein was compared with Muts recombinant in P .pastoris under the same condition.
SDS-PAGE results showed that there was a clear target band in Mut+ recombinant culture supernatant after 48 hours culture
but only a faint band in Muts recombinant culture supernatant after 72 hours culture.Activity tests revealed that two culture
supernatants could inhibit plant virus infection with high efficiency and there was no significant difference between them.
Key words:pokeweed antiviral protein , PAP;Pichia pastoris;expression;Mut+ recombinant;Muts recombinant
中图分类号:S188;S432.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:0412-0914(2003)05-0425-04
　　商陆抗病毒蛋白(PAP)是存在于美洲商陆叶片
中的一种单链碱性蛋白 ,分子量为 29 kD[ 1 , 2] ,能抑制
多种病毒侵染。研究表明 , PAP 不但能够对 TMV 和
PVY等多种植物病毒具有抑制作用[ 3 , 4] ,而且对真
菌 、细菌及人类免疫缺陷型病毒(HIV)等都具有一定
的抑制效果[ 5～ 7] 。成熟的 PAP 由 PAP 前体加工而
来。PAP 前体由313个氨基酸组成 ,其基因序列全长
1164 bp ,PAP N端有一由 22个氨基酸组成的信号肽 ,
负责将 PAP 从核糖体向细胞膜的运输 ,C 末端 29个
氨基酸可能对 PAP 前体的稳定有一定的作用。成熟
的PAP 由 262个氨基酸组成[ 8] 。PAP 具有不同的功
能区 ,现已证明在成熟的 PAP N端第 170 ～ 183 个氨
基酸处为一保守性很强活性区域 ,氨基酸排列顺序
为:AIQMVSEAARFKYI ,其主要功能是对病毒产生抗
性 ,而在C末端第 1 ～ 25个氨基酸处的区域主要功能
与脱去 rRNA 的特殊位置的腺嘌呤有直接关系 ,而与
抗病毒无关。实验证明 ,缺少 C 端 25 个氨基酸的
PAP丧失了对寄主细胞的毒性 ,即不阻碍该细胞蛋白
质的正常合成 ,但仍然赋予该细胞对侵入病毒的抗
性[ 9] 。
巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种能利用甲醇作
为唯一碳源的微生物。甲醇代谢首先必须在醇氧化
DOI :10.13926/j.cnki.apps.2003.05.009
酶的作用下将甲醇氧化成甲醛。醇氧化酶对氧的亲
和力很弱 ,所以在甲醇为碳源的培养基上生长时 ,毕
赤酵母代偿性地大量产生这种酶 。在毕赤酵母中有
2种基因编码醇氧化酶 AOX1和 AOX2。细胞中绝大
多数醇氧化酶的活力由 AOX1提供 ,AOX2只承担很
少一部分活力。当 AOX1 基因缺失 , 只存在 AOX2
时 ,大部分的醇氧化酶活力丧失 ,细胞利用甲醇能力
降低 ,因而细胞在甲醇介质上生长很慢 ,这种菌株被
称为Muts ;AOX1 基因存在时 ,细胞利用甲醇能力正
常 ,在甲醇介质上生长较快 ,这种菌株被称为Mut+。
以甘油或葡萄糖为碳源时 Mut+和 Muts 生长速度并
无区别;而以甲醇为碳源时 ,Mut+的生长显著快于
Mut
s [ 10] 。毕赤酵母表达载体就是利用醇氧化酶基因
1(AOX1)的启动子来进行外源基因表达的。
2001年陈定虎等[ 11]通过 RT-PCR扩增出缺失了
N端信号肽编码序列和对细胞生长有害序列的突变
型 PAP 基因 ,将其克隆到表达载体 pPIC9K 中 , 经
BglII酶切后导入到毕赤酵母中 ,得到 Muts 重组子 ,
在摇瓶中发酵 ,诱导表达出有活性的缺失 PAP 蛋白。
本实验利用 Sal I酶切质粒 ,将 PAP 缺失基因插入到
酵母染色体中而不破坏AOX1基因 ,得到表型为Mut+
重组子 ,并在相同培养条件下比较了毕赤酵母 Mut+
重组子和Muts 重组子在表达美洲商陆抗病毒蛋白方
面的异同 。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　菌株　巴氏毕赤酵母(P.pastoris)GS115菌
株(Mut+His-)购自 Invitrogen 公司 , Muts 重组菌株
(Muts His+)为本实验室陈定虎博士构建 。
1.1.2　质粒　pPIC9K-P(将 PAP 基因的N 端信号肽
编码序列和对细胞生长有害的序列缺失后 ,克隆到毕
赤酵母表达载体 pPIC9K 中得到的载体)由本实验室
陈定虎博士构建 。
1.1.3　酶及其它主要试剂　限制性内切酶 , TaqDNA
聚合酶 , 碱性磷酸酶(AP)标记羊抗兔 IgG 购自
Promega公司;DNA Marker 购自 TaKaRa 公司;单链寡
核苷酸引物由上海博亚公司合成;PAP 兔抗血清由法
国UFR分子生物学实验室 Philippe Dulieu博士惠赠;
其它试剂均为国产分析纯产品 。
1.1.4　培养基　MD平板(13.4 g/L YNB , 4×10-4 g/L
生物素 , 20 g/L 葡萄糖 , 15 g/L 琼脂粉), MM 平板
(13.4 g/L YNB , 4×10-4 g/L生物素 , 5 mL/L 甲醇 ,15
g/L 琼脂粉),YPD液体培养基(10 g/L 酵母粉 ,20 g/L
蛋白胨 , 20 g/L 葡萄糖), BMGY(10 g/L 酵母粉 , 20
g/L蛋白胨 , 0.1 mol/L 磷酸钾缓冲液 pH 6.0 , 13.4
g/L YNB , 4×10-4 g/L 生物素 , 10 g/L甘油), BMMY
(10 g/L 酵母粉 ,20 g/L 蛋白胨 , 0.1 mol/L 磷酸钾缓
冲液 pH 6.0 , 13.4 g/L YNB , 4×10-4 g/L 生物素 , 5
mL/L甲醇)。
1.2　方法
1.2.1　载体 pPIC9K-P 的提取及线性化　用碱法少
量提取 pPIC9K-P质粒 DNA ,用 Sal I 酶切线性化后回
收纯化并稀释至 0.1 μg/μL。
1.2.2　GS115的转化 　酵母感受态细胞的制备:参
照 Invitrogen公司Pichia操作手册。电转化:取稀释好
的质粒 DNA 5 μL 加入到 80 μL 酵母感受态细胞中 ,
冰浴 5 min ,然后使用电极间距 0.2 cm的样品杯 ,将
电容 、电阻和电压分别设定为 25 μF ,200 Ψ, 5 kV/cm
进行电击 ,电击结束后立即加入 1 mL YPD培养液 ,混
合物转移到小的指形管中 , 冰上放置 10 min ,最后
30℃,250 r/min摇培 2 h 后 ,取 200 μL 涂 MD平板 ,
30℃培养直至转化子出现 。
1.2.3　转化子的表型筛选和 PCR鉴定　待电转化
的细胞在 30℃生长至大小适中的单菌落 ,在MD 、MM
平板上进行表型筛选。在 MD和 MM 板上均生长正
常的转化子为Mut+型;在 MD板上生长正常而在MM
板上生长缓慢的为 Muts 型 。提取转化子的总 DNA ,
用 5AOX1引物和 3AOX1引物进行PCR扩增。
1.2.4　Mut+重组子和 Muts 重组子的诱导表达　具
体按 Invitrogen公司 Pichia操作指南进行。
1.2.5　Mut+重组子和 Muts 重组子表达蛋白的 SDS-
PAGE和Western blotting 检测　直接取诱导表达产物
的上清液进行SDS-PAGE和Western blotting分析。
1.2.6　表达产物抗病毒活性测定　采用半叶法:取
诱导表达产物上清液 ,用 0.01 mol/L 的磷酸缓冲液
(pH 7.0)稀释 10倍后 ,均匀涂抹于 TMV 的枯斑寄主
心叶烟的叶片上 , 12 h后再接种 TMV。同时用含空
载体 pPIC9K的重组子发酵液上清做对照 。5 d 后观
察统计发病情况 。
2　结果与分析
2.1　转化子 Mut+/ Muts的阳性克隆鉴定
pPIC9K-P用 Sal I 酶切线性化 ,电转化至 GS115
(Mut+His-)。电转化的细胞在 30℃生长至大小适中
的单菌落 , 在 MD 、MM 平板上进行表型筛选。取
Mut+转化子 ,利用 PCR鉴定阳性重组子 ,结果见图1。
426 植物病理学报 33卷
图 1　重组子的 PCR 鉴定
Fig.1　Identification of recombinants by PCR
1:分子量标准(2000, 1000 ,750, 500 , 250 , 100 bp)
2:阴性对照
3 、5 、6、7 、8、9 、11:Mut +阳性重组子
4 、10:Mut s阳性重组子
12:假阳性重组子
1:Marker(2000 , 1000 ,750, 500 , 250 , 100 bp)
2:Negative control
3 , 5 , 6, 7 , 8, 9 , 11:Mut +positive recombinants
4 , 10:Mut s positive recombinants
12:Artificial positive recombinant
　　从图 1可以看出 ,并非所有表型为 Mut+的转化
子均为Mut+阳性重组子 。在MD和 MM 平板上的表
型筛选结果也不十分可靠。如果 PCR产物只有目的
基因 1 条带 ,说明 AOX 1基因在整合过程中被破坏 ,
阳性重组子的表型为 Muts;如果 PCR产物有 2条带 ,
一条为 AOX 1基因的 2.2 kb条带 ,另一条为目的条
带 ,说明 AOX1基因没有被破坏 ,阳性重组子的表型
为Mut+ ,如果 PCR产物只有 AOX 1基因一条带 ,说明
该转化子为假阳性。因此 ,直接用 PCR进行筛选鉴
定能一步准确确定阳性克隆和菌株表型 。
2.2　Mut+重组子和 Muts 重组子的诱导表达和表达
产物的Western-blotting检测
取Mut+重组子和Muts 重组子 ,分别按照 Invitro-
gen Pichia 手册推荐的条件进行表达。SDS-PAGE 后
考马斯亮蓝 R-250染色 ,结果见图 2和图 3。
结果表明 , Muts 重组子诱导表达 3 d 后在 SDS-
PAGE胶上可以看到微弱的目的带 ,而Mut+重组子诱
导表达 2 d就可在胶上看到明显的目的带。分别取
Mut
s 重组子和 Mut+重组子诱导 7 d 的上清液进行
Western-blotting 检测 ,以含 pPIC9K空载体的重组子为
对照 ,结果如图 4。结果发现 ,诱导表达 7 d后 ,Muts
重组子和Mut+重组子上清液与 PAP 抗血清在 29 kD
处均有杂交信号产生 ,可以认为是缺失 PAP 基因的
表达产物。
2.3　表达产物抗病毒生物活性的测定
用半叶法测定表达产物抗病毒活性 。取 Mut+重
组子和 Muts 重组子诱导表达 7 d 的产物上清液 ,用
0.01 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)稀释 10倍后 ,加上
0.5%的农药助剂2201 ,均匀涂抹于 TMV枯斑寄主心
叶烟的右半叶上 ,左半叶用含空载体的转化子发酵液
上清做对照 ,12 h后取 0.5 g 接种 TMV后系统发病的
普通烟病叶 , 加 5 mL 0.01 mol/L 磷酸缓冲液(pH
7.0)充分研磨 ,再接种到处理过的心叶烟叶片上。每
个处理重复 10次 ,5 d后观察发病情况 。统计结果表
明Mut+重组子和 Muts 重组子的表达产物对病毒的
平均抑制率分别为 95.68%和 96.75% 。对病毒抑制
率进行显著性 t测验 ,结果 t值为0.539 ,即Mut+重组
子表达产物和Muts 重组子的表达产物对病毒的抑制
作用没有显著差异。
图 2　Muts 重组子表达产物 SDS-PAGE分析
Fig.2 Analysis of expression protein of Muts recombinant by
SDS_PAGE
1:分子量标准(kD), 2:阴性对照 , 3～ 9:1～ 7 d的表达产物
1:Marker(kD), 2:Negative control , 3-9:1-7 d expression protein
图 3　Mut+重组子表达产物 SDS-PAGE分析
Fig.3 Analysis of expression protein of Mut+ recombinant
by SDS_PAGE
1:分子量标准(kD), 2:阴性对照 , 3～ 9:1～ 7 d的表达产物
1:Marker(kD), 2:Negative control , 3-9:1～ 7 d expression protein
4275 期 周 倩 , 等:毕赤酵母 Mut+和Muts 重组子表达美洲商陆抗病毒蛋白基因的比较
图 4　表达蛋白Western-blotting检测
Fig.4 Western_blotting analysis on expression protein
1:分子量标准(kD), 2:阴性对照 ,
3:Mut +表达蛋白杂交结果 , 4:Muts表达蛋白杂交结果
1:Marker(kD), 2:Negative control ,
3:Hybridization of Mut+recombinant expressing protein ,
4:Hybridization of Muts recombinant expressing protein
3　讨论
早在 1925年 , Duggar 和 Armstrong 就发现美洲商
陆的叶片中含有一种能阻碍 TMV 传播的蛋白[ 12] ,随
着研究的不断深入 ,发现这种蛋白对病毒具有广谱抗
性 ,甚至对真菌 、细菌的侵染也有一定的抑制作用。
由于该蛋白在美洲商陆中的含量有限 ,通过生物工程
技术 ,利用微生物发酵大量生产 PAP 是较为可行的
方法。毕赤酵母表达系统是近年来迅速发展起来的
具有诸多优点的真核表达系统。在表达真核细胞外
源蛋白时 ,不仅具有真核生物生长快 、操作简便的特
点 ,又具备哺乳类细胞的翻译后加工和修饰的功能 ,
从而使表达的外源蛋白具有生物活性。到目前为止 ,
已有上百种蛋白在毕赤酵母中得到成功表达[ 13] 。
本实验通过用 Sal I酶切 ,线性化质粒 pPIC9K-P ,
然后电击将目的基因插入到毕赤酵母的染色体上 ,得
到表型为Mut+重组子。与 Bgl II 酶切线性化质粒后
导入到毕赤酵母得到的 Muts 重组子相比 ,Mut+重组
子在形成过程中没有破坏 AOX1 基因 , 在诱导表达
目的蛋白时 ,能正常利用甲醇 。因此 ,在以甲醇为唯
一碳源的诱导表达阶段 ,Mut+重组子的生长比 Muts
重组子快 ,应用于生产时能缩短发酵周期。另外 ,分
泌表达时由于宿主蛋白酶的存在经常使表达产物不
稳定 ,如果发酵周期太长可能导致表达产物降解 ,降
低产率 。因此 ,在工业生产上 Mut+重组子比Muts 重
组子应该更具有实际应用的价值。
参考文献
[ 1] 　Irvin J D.Purif ication and partial characterization of the antivi ral protein
from Phytolacca americana which inhibits eukaryotic protein synthesis
[ J] .Arch.Biochem.Biophys.,1975 , 169:522-528.
[ 2] 　Irvin J D , Uckun F M.Pokeweed antiviral protein:ribosome inactivation
and therapeutic applications [ J] .Pharmacol.Ther., 1992 , 55:279-
302.
[ 3] 　Chen Z C , White R F , Antoniw J F , et al.Effects of pokeweed antivi-
ral protein PAP on the infection of plant viruses [ J] .Plant Pathol.,
1991 , 40:612-620.
[ 4] 　Tomlinson J A , Walker V M , Flewett T H , et al.The inhibition of in-
f ection by cucumber mosaic virus and inf luenza vi rusby extract of Phyto-
lacca americana [ J] .J.Gen.Virol., 1974, 22:225-232.
[ 5] 　Aron G M , Irvin J D.Inhibition of herpes simplex virus multiplication
by the pokeweed antiviral protein [ J] .Antimicrob.Agents Chemother.,
1980 , 17:1032-1033.
[ 6] 　Olson M , Ramakrishana S , Anand R.Ribosomal inhibitory proteins
from plants inhibitsHIV-1 replication in acutely infected peripheral blood
mononuclear cells [ J] .AIDS Res.Hum.Retrovir., 1991, 7:1025-
1030.
[ 7] 　Zarling J M , Moran P A , Haffar O , et al.Inhibi tion of HIV replication
by pokeweed antiviral protein targeted to CD 4+ cells by monoclonal an-
t ibodies [ J] .Nature , 1990 , 347:92-95.
[ 8] 　Lin Q , Chen Z C.Isolation and characterization of a cDNA clone enco_
ding the antiviral protein from Phytolacca americana [ J] .Plant Molecu-
lar Biology , 1991 ,17:609-614.
[ 9] 　Tumer N E , Hwang D J.C-terminal deletion mutant of pokeweed antivi-
ral protein inhibits vi ral infection but does not depurinate host ribosomes
[ J] .Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 1997 ,94(8):3866-3871.
[ 10] 彭 毅 ,步 威 ,康良仪.甲醇酵母表达系统[ J] .生物技术通报 ,
2000 ,(1):38-41.
[ 11] 陈定虎 ,王锡锋 ,李莉 , 等.美洲商陆抗病毒蛋白基因在毕赤酵
母中的表达及其抗病毒活性测定[ J] .农业生物技术学报 , 2003 ,
11(2):183-186.
[ 12] Duggar BM , Armstrong J K.The effect of treating the virus of tobacco
mosaic with the juice of various plants [ J] .Ann.Missouri Bor.Garden ,
1925 , 2:359-366.
[ 13] Higgins D R , Cregg J M.Pichia Protocols [ M] .New Jersey:Humana
Press , 1998.249-252.
责任编辑:林春芽
428 植物病理学报 33卷