全 文 ：第 30 卷 第 11 期 热 带 作 物 学 报 Vol．30 No．11
2009 年 11 月 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS Nov.2009
美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究
罗遵喜， 杨志才， 吕苏珊， 吴转娣， 冯翠莲， 蔡文伟， 喻时周， 杨本鹏， 张树珍*
中国热带农业科学院热带生物技术研究所
农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海口 571101
摘要 构建叶片特异表达启动子 rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL， 冻融法转化农杆菌
EHA105后， 通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织， 经PPT抗性筛选以及PCR鉴定， 共获得了24株转化
植株， 对其中的5株进行Southern杂交检测， 有2株呈阳性， 初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中； 对其接种甘蔗花叶病
毒， 初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性。
关键词 美洲商陆抗病毒蛋白； 基因； 植物表达载体； 转化； 甘蔗
中图分类号 78； S566.1
甘蔗（Saccharum officinarum L.）是中国最重要的糖料作物， 截止2009年6月， 全国总产糖1 243.12万t，
其中甘蔗糖产量1 152.99万t， 甜菜糖产量为90.13万t。 甘蔗还是中国热带、 亚热带地区重要的经济作物， 是
这些地区部分县市地方财政的重要来源。 近年来巴西等国家通过发酵从甘蔗汁生产燃料乙醇， 甘蔗又逐渐
发展成为一种重要的能源植物。 甘蔗花叶病（Sugarcane Mosaic Virus， ScMV）是甘蔗中较为重要的病害之
一， 传统的化学防治效果不佳， 在中国许多甘蔗品种其发病率接近100％， 使得甘蔗的产量和含糖量降低，
严重影响甘蔗的经济效益。 现代甘蔗栽培种是甘蔗属热带种、 割手密种和印度种的种间杂交种， 使得甘蔗
的染色体数量多、 基因组结构复杂， 且常规的抗病育种存在抗性资源贫乏、 抗病基因与不良性状基因连
锁、 远缘杂交困难、 育种周期长等缺点， 最终导致常规的抗病杂交育种较难进行； 采用化学方法防治甘蔗
病毒病， 但目前对病毒病无特效药， 且施药后易造成环境污染； 而用组织脱毒法所获得的脱毒苗也不具备
抗病毒能力。 因此， 利用植物基因工程技术把抗病毒基因导入甘蔗优良品种并使其得到有效表达从而表现
出特定抗病性是防治甘蔗病毒病最为快速有效的途径。
美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antivirual protein， PAP）是从美洲商陆（Phytolacca americana L.）春叶中
分离得到的一种单链核糖体失活蛋白， 它可以催化水解原核和真核核糖体大亚基rRNA3-端茎环（stem-
loop）结构中的腺嘌呤残基， 导致核糖体失活。 PAP可以有效抑制多种非相关病毒， 包括植物病毒和动物病
毒， 它是当前所有核糖体失活蛋白（RIPs）中最有效的抗病毒蛋白； PAP对不同病毒没有特异性， 且低浓度
就具有很强的抗性[1]。 有关研究结果表明， 成熟的PAP全长262个氨基酸， 其中C端的25个氨基酸为毒性区，
缺失突变体PAP-c没有毒性区， 其细胞毒性很低， 但仍具有较强的抗病毒活性[2]。 Lodge等将PAP遗传转化
烟草和马铃薯， 获得的转基因植株及其后代具有广谱的抗病毒特性， 包括对机械和蚜虫传播的病毒如
PVX、 PVY、 马铃薯卷叶病（Potato leaf roll virus， PLRV）、 CMV、 TMV、 苜蓿花叶病毒（AMV）等均有抗
性[3]。 此外， 国内学者在油菜、 番茄等作物上也获得了对TuMV， TMC、 CMV有抗性的转基因植株[1，4]。
因此， 本研究将美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c导入高产高糖的甘蔗品种中， 使其在叶片中特异表
达， 以期提高甘蔗广谱的抗病毒能力。
基金项目： 现代农业产业技术体系建设专项资金（No. nycytx-24）； 国家自然科学基金（No. 30560081）； 中央级公益性科研院所基本科研业
务费资助。
作者简介： 罗遵喜， 男， 1982年生。 研究方向： 植物基因工程。 其中罗遵喜， 杨志才并列第一作者。
*通讯作者， 张树珍， Tel： 0898-66892735； E-mail： zhangsz.2007@yahoo.com.cn。
收稿日期： 2009-08-30 修回日期： 2009-10-19
11期
1 材料与方法
1.1 实验材料
甘蔗品种为新台糖22号（ROC22）， 种植于实验室苗圃地。 基因PAP-c由李建国博士惠赠。 Taq DNA
聚合酶、 限制性核酸内切酶、 凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa（公司） ； 地高辛标记与检测试剂盒购自
Roche公司。 受体大肠杆菌DH5α及农杆菌菌株EHA105由本研究室保存。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体的构建 首先， 在中间载体pCMBIA3300的质粒上用SacⅠ和EcoRⅠ双酶切后定向插
入终止子NOS， 获得中间载体PN1； 然后对PN1和含有目的基因的载体pMD-P（pMD18-T+PAP-c）进行BamHⅠ
和PstⅠ双酶切， 在PN1上定向插入目的基因PAP-c， 获得中间载体PNP； 最后， 用HindⅢ和PstⅠ双酶切含
有叶片特异表达启动子rbcs的载体Pr6， 并将其定向插入到中间载体PNP上， 从而获得最终的植物表达载
体PNRPL。
1.2.2 植物表达载体导入农杆菌EHA105 采用 “冻融法” 将植物表达PNRPL导入农杆菌EHA105中， 具体
操作为： 向农杆菌（EHA105）感受态细胞中加入1 μg纯化的质粒（PNRPL）DNA， 混匀， 冰上放置5 min， 置于
液氮速冻5 min， 立即用37℃水浴热激5 min， 加入800 μL YEP液体培养基。 28 ℃缓慢振荡培养（<200 r/min）
2～3 h， 取培养后的菌液涂布于含链霉素 （Str）50 μg/mL， 利福平 （Rif）50 μg/mL， 卡那霉素（Km）50 μg/mL
的YEP固体培养基上， 28℃倒置培养约48 h， 可见抗性菌落长出。 同时作空白阴性转化对照（农杆菌感受态
细胞中不加质粒， 其他操作相同）。
1.2.3 农杆菌介导甘蔗遗传转化 农杆菌介导甘蔗胚性愈伤组织的遗传转化按唐建平等的方法 [5] 。
1.2.4 甘蔗再生植株的DNA提取和PCR鉴定 采用改良的CTAB法分别小量和大量提取甘蔗的基因组
DNA， 方法另文发表。 利用生物学软件， 对目的基因PAP-c设计一对特异扩增引物， 序列如下， P1： 5′-
CTGCAGGATGAAGTCGATGCTTGT3′， P2： 5′-GGATCCCACTATACACTTGGCACC-3′。 PCR检测体系如下：
10×PCR Buffer 2.5 μL， MgCI2（25 mM）0.5 μL， dNTPs （2.5 mM）2.0 μL， P1 （100 pmol/μL）1.5 μL， P2
（100 pmol/μL）1.5 μL， Taq DNA Polymerase（3U/μL）0.2 μL， 模板DNA（质粒PNRPL）0.2 μL， ddH2O补足
20 μL， PCR扩增程序如下： 预变性94 ℃， 5 min； 循环参数为94 ℃， 30 S； 56 ℃， 30 S； 72 ℃， 1 min；
30 cycles， 最后72℃， 10 min， 4℃保存； 并同时以植物表达载体PNRPL的质粒作为PCR扩增的阳性对照。
最后， 对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析并照相。
1.2.5 转化植株的Southern Blot检测 对PCR鉴定呈阳性的甘蔗转化植株， 取基因组DNA约50 g进行HindⅢ
单酶切20 h后， 无水乙醇沉淀法回收基因组DNA， 低电压凝胶电泳10~12 h， 采用 “下循法” 将酶切后的
甘蔗基因组DNA转移至尼龙膜上； 利用地高辛标记方法标记酶切回收的目的基因， 制备杂交探针， 然后按
照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I说明书进行Southern Blot检测。
1.2.6 转基因植株抗病性鉴定 甘蔗花叶病的获得方法参见张显勇等文章 [6]。 采集甘蔗带病部位的新鲜叶
片， 置4℃预冷， 称取预冷后的病叶组织2 g， 液氮中研磨（研钵、 研棒、 剪刀等均灭菌处理）， 然后将粉末
转移到含3倍体积质量比的磷酸缓冲液中， 4 ℃， 7 000 r/min， 10 min， 上清液即为甘蔗花叶病毒粗提液
（放置于4 ℃）。 采用400目金刚砂， 分别在同龄甘蔗转化植株和非转化植株的幼嫩叶片上摩擦接种甘蔗花
叶病毒， 力度由轻到重， 只对当代单株接种， 不设重复， 每周接种1次， 连续2次， 之后观察抗性情况。
2 结果与分析
2.1 植物表达载体的构建
对经转化后获得的重组子质粒PN1、 PNP、 PNRPL进行相应的酶切鉴定， 分别切出约250 bp、 780 bp、
2 750 bp的片段， 与实验预期大小一致， 表明中间载体PN1、 PNP以及植物表达载体PNRPL均构建成功（见
罗遵喜等： 美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究 1647
热 带 作 物 学 报 30 卷
图1， 2， 3）。
2.2 植物表达载体导入农杆菌EHA105
利用 “冻融法” 将构建的植物表达载体PNRPL转入农杆菌EHA105中， 以提取的农杆菌质粒作为PCR
扩增模板， 以大肠杆菌质粒PNRPL为阳性对照， 按目的基因PAP-c的PCR反应程序进行扩增， 结果表明，
植物表达载体已成功转入到农杆菌中（图4）。
2.3 农杆菌介导的甘蔗遗传转化
新鲜的甘蔗胚性愈伤组织经农杆菌侵染及共培养处理后 ， 在含有羧苄青霉素（Car 200 mg/L）和
PPT（1~5 mg/L）选择压的相应培养基上， 分别诱导芽分化、 壮苗、 生根， 经连续选择， 最后将获得的甘蔗
再生植株定植于沙床。
2.4 甘蔗再生植株的DNA提取和PCR鉴定
采用改良的CTAB法大量提取甘蔗基因组DNA， 稀释后进行1％琼脂糖凝胶电泳（图5）， 结果表明：
DNA条带单一， 无明显拖尾现象， RNA已彻底去除； 且OD260/280为1.781 2。 随后以稀释的甘蔗基因组DNA为
模板， 进行PCR扩增， 共有24株扩增到与目的基因PAP-c大小（780 bp）一致的条带（图6）， 初步说明目的基
因PAP-c已导入这24株甘蔗中。
2.5 甘蔗转化植株的 Southern Blotting 检测
取 5株长势较快的 PCR鉴定呈阳性的甘蔗基因组 DNA约 50 μg， 分别经 HindⅢ酶切消化后， 与经地高
图 1 重组质粒 PN1 的酶切鉴定
M. 100 bp Ladder DNA marker；
1-2. SacⅠ/EcoRⅠ双酶切。
2 000
1 000
500
252
1 2 M
图 2 重组质粒 PNP 的酶切鉴定
M. 100 bp Ladder DNA marker；
1. BamHⅠ/PstⅠ双酶切。
2 000
1 000
500
780
1 M
M. λ-EcoT14Ⅰ digest DNA Marker；
1. HindⅢ/PstⅠ双酶切；2. 100 bp DNA marker。
图 3 重组质粒 PNRPL 的酶切鉴定
2 750
2 000
1 000
500
19 329
2 690
M 1 2
M. 100bp Ladder DNAmarker； ck+. 质粒 PNRPL PCR扩增；
1-3. PNRPL 转化菌株的 PCR扩增
图 4 植物表达载体 PNRPL 转化农杆菌的 PCR 鉴定
2 000
1 000
500
ck+ 1 2 3 M
图 5 甘蔗基因组 DNA 提取
1648
11期
辛标记的目的基因 PAP-c进行 Southern杂交， 有 2株呈阳性（图 7）， 表明目的基因已整合到甘蔗基因组中。
2.6 转基因植株的抗病性初步鉴定
为了检验转基因植株对病毒的抗性， 对经 Southern杂交鉴定的这 2 株甘蔗植株， 分别接种甘蔗花叶病
毒（ScMV）。结果表明转基因甘蔗接种初期无明显感染症状， 而对照已开始出现明显感染症状， 接种 20 d后，
转基因植株才开始出现局部感染症状， 且两株抗性表现一致， 初步表明获得的转基因甘蔗对 ScMV 具有明
显的抗性。
3 讨论
病毒病是一种严重危害作物的病害之一， 到目前为止仍无有效的化学防治方法， 而常规育种取得的
成效也十分有限。 郭莺等通过基因枪法将甘蔗花叶病毒 CP 基因转入甘蔗品种 Badila， 获得了对甘蔗花叶
病毒具有抗性的甘蔗转基因植株[7]； 顾丽红等则通过农杆菌介导法获得了对甘蔗黑穗病具有抗性的甘蔗转
基因植株[8]。 因此笔者认为， 相对于常规育种， 基因工程技术为培育抗病毒的甘蔗新品种提供了一条新的
研究途径。
本研究中，将 C端缺失的美洲商陆抗病毒蛋白基因 PAP-c转入甘蔗。由于 Southern Blotting 对甘蔗基因
组浓度及纯度要求较高， 为此， 本实验中， 目前仅对第 1 批长势较快的转化植株进行杂交鉴定以及抗病
性初步分析， 5株中有 2株杂交呈阳性， 获得的转基因甘蔗对甘蔗花叶病都表现出良好的抗性， 笔者分析
认为叶片特异表达启动子驱动美洲商陆抗病毒蛋白基因在病毒等病害的入侵部位叶片中特异表达是其产
生良好抗性的关键。 由于获得的转基因植株数量不多， 有关其它转化植株还需继续进行杂交鉴定以及抗
病性分析； 对获得的这 2 株转基因甘蔗， 需重复接种不断验证其抗性， 并对其无性系后代分别接种不同
来源的植物花叶病毒以检验其对不同病毒的抗性情况； 对抗性水平表现较好的植株测定其相应的生理指
标， 并从生理上进一步阐述其抗性产生的依据。 总之， 这些工作为进一步获得具有广谱抗性的甘蔗转基
因新品种奠定了坚实的基础。
参 考 文 献
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M. 100bp Ladder DNA Maker； ck+. 质粒 PNRPL扩增；
ck-. 未转化植株的 PCR扩增； 1~15. 抗性植株的 PCR扩增
图 6 转化植株的 PCR 鉴定
2 000
1 000
750
CK - CK + M CK- CK+ 1 2 3 4 5
ck-. 非转基因甘蔗； ck+. 质粒 PNRPL；
1~5. 转基因甘蔗
图 7 转基因甘蔗的 Southern Blotting 检测
罗遵喜等： 美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究 1649
热 带 作 物 学 报 30 卷
534~2 537.
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Genetic Transformation of Pokeweed Antiviral Protein Gene into Sugarcane
Luo Zunxi, Yang Zhicai, Lu Sushan,Wu Zhuandi, Feng Cuiliang, Yu Shizhou, Yang Bengpeng, Zhang Shuzhen
Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology/
Ministry of Agriculture Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops, CATAS, Haikou 571737, China
Abstract Pokeweed antiviral protein gene PAP -c’s plant expression vector PNRPL was constructed,
which was driven by leaf specific expression promoter rbcs. The Agrobacterium tumerfaciens EHA105 was
transformed by the “ freeze and thaw” method, and the embryonic calli of elite sugarcane variety ROC22
were inoculated by using the A. tumefaciens -mediated method. PPT resistance screening and PCR
identification results showed that 24 transformed plants were generated. Of the transformed plants 5 were
taken for Southern blot analysis, 2 of which were positive, preliminarily proving that exogenous gene had
been integrated into sugarcanes genome. Inoculation of sugarcane mosaic virus further proved that these
transgenic plants had certain resistance on the sugarcane mosaic virus.
Key words Pokeweed antiviral protein; gene; plant expression vector; transformation; sugarcane.
责任编辑： 郑定华
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