全 文 ：337※分析检测 食品科学 2008, Vol. 29, No. 02
高效液相色谱法测定小米中维生素B1
杨云霞，刘 彤，王步军*
(中国农业科学院作物科学研究所，农业部谷物品质监督检验测试中心，北京 100081)
摘 要：研究反相高效液相色谱法分离测定我国主要粮食作物小米原粮中VB1的方法。小米中的VB1经前处理的
酸解提取、酶解、氧化衍生、提纯后，可与小米中的淀粉、脂肪、蛋白质等物质完全分离。采用VP-ODS C18
柱，以甲醇:乙酸钠(0.5mol/L，pH4.5)=20:80作流动相分离，用荧光检测器作定量测定，方法高、中、低三个
水平浓度样品回收率(n=4)91.59%～94.27%；6次重复性实验相对标准偏差(RSD%)为2.8%～5.9%；方法检出限(S/
N=3)为1.56ng/ml。
关键词：V B1；小米；高效液相色谱
Study on Determination of Vitamin B1 in Millet by H gh Performance Liquid Chromatography
YANG Yun-xia，LIU Tong，WANG Bu-jun*
(Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agriculture Science, Cereal Product Quality Supervision and Inspection Center,
Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China)
Abstract ：A method for the determination of vitamin B1 (VB1) in millet which is one of important grain in china by high
performance liquid chromatography (HPLC) was developed. After extracting by hydrochloric acid and taka diastase, the
enzymatically treated sample can separated from fecula, fatty compound and protein and so on in millet completely. A VP-ODS
C18 column was used for separation and elution was performed with methanol and sodium acetate (0.5 mol/L, pH4.5, 20:80). VB1
was detected by fluorescence detector quantificationally. The average recoveries were 91.59%～94.27% of high, middle and low
three level (n=4)in this method. The relative standard deviations(RSD%) were 2.8%～5.9%(n=6). The detection limit (S/N=3)
was 1.56 ng/ml.
Key words：VB1；millet；HPLC
中图分类号：TS210.7 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)02-0337-03
收稿日期：2007-04-29
作者简介：杨云霞(1972-)，女，助理研究员，博士研究生，研究方向为农产品品质、质量与食品安全检测。
E-mail：yangyunxia@caas.net.cn
*通讯作者：王步军(1960-)，男，研究员，博士，研究方向为农产品质量安全与标准制定。E-mail：wangbj@mail.caas.net.cn
维生素B1(VB1)又名硫胺素。其化学名称是氯化3-
[(4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)甲基]-5-(2-羟基乙基)-4-甲基-
噻唑盐酸盐，分子式：C12H17ClN4OSHCl。硫胺素呈白
色结晶状，熔点为248℃[1]。VB1是构成脱羧辅酶的主
要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，在三羧酸循
环中，VB1以硫胺素焦磷酸的形式和丙酮酸脱羧酶联
合，使丙酮酸脱去二氧化碳。VB1和VPP参与糖类代
谢。VB1是维持机体正常代谢必需的水溶性维生素，人
体内VB1缺乏时会引起神经炎和脚气病[2]。
V B1广泛分布于动植物界，小米中含有丰富的
VB1，是人体摄取VB1的主要途径，同时VB1也是评价
小米营养品质的要素之一。
我国目前常用的分析谷物中VB1的方法为GB7628—
87《谷物维生素B1测定方法》，该方法用活化过的人
造沸石装填成分离制备柱，分离样品中的VB1时，先将
滤液过柱，VB1吸附在柱上，然后用热酸性氯化钠洗脱
VB1，收集、氧化、萃取后用荧光分光光度计测定[3]，
每次测定用硫酸奎宁工作液调整荧光仪。该方法样品的
前处理繁琐，耗时费材，重现性差。
国内有人用荧光分光光度法或反相高效液相色谱法
测定佛手、酵母细胞等的VB1[4-7]。本实验的目的是利用
和GB7628—87《谷物VB1测定方法》相同的原理，参
考了英国等国家的VB1的测定方法[8]，用高效液相色谱
分离效率高、灵敏度高、重现性好的特点对小米中的
VB1进行分离测定，在大量试验的基础上，建立起分析
测定小米中VB1的方法。
1 材料与方法
1.1材料、试剂与仪器
小米粉碎过80目筛。
VB1标准品 Dr. Ehrenstorfer公司；高峰淀粉酶(Taka-
Diastase) Fluka公司。甲醇为色谱级；水为重蒸馏水；
乙酸钠为分析纯。LC-20AB液相色谱[带荧光检测器RF-
10AXL、双元泵、色谱柱VP-ODS(250L×4.6)。
LC-Solution] 日本岛津公司；高速离心机2K15 Sigma
公司；高压锅；恒温箱。
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1.2方法
1.2.1原理
VB1在酸性条件下较稳定，在碱性条件下可被铁氰
化钾氧化成硫色素(图1反应方程式)，该产物在紫外光
激发下产生强大的蓝色荧光，其荧光强度与VB1的含量
成正比。
度-峰面积标准曲线，标准品在0.2～1.0μg/ml浓度范围
内峰面积与浓度的线性关系良好(图2) 。
1.2.2样品前处理
称取过80目筛的小米试样2g于50ml三角瓶中，准确
加25ml 0.1mol/L的HCl，将三角瓶放入高压锅中在121℃条
件下加热酸解30min，冷却至室温。将样液离心8min
(10000r/min)，弃去杂质。将上清液用2.5mol/L的乙酸
钠调其pH值为4 ，然后按每克试样加入0.1g高峰淀粉
酶的比例向试样中加入高峰淀粉酶，放试样于40～45℃
恒温箱保温酶解16～24h，其间振摇2次，使酶与样液
充分混匀。冷却至室温后用0.2μm水系膜过滤，取过滤
后样液1ml，用0.4g/L K3Fe(CN)6的NaOH溶液1ml进行衍
生，涡旋快速混合1min，反应5min后加入1ml异丁醇，
涡旋快速混合提取2min后，离心5min(10000r/min)，取
上清醇层用带荧光检测器的LC分析。
1.2.3色谱工作条件
流动相：甲醇：乙酸钠(0.5mol/L，pH4.5)=20:80；
流速：0.8ml/min；激发波长366nm，发射波长435nm。
进样量10μl，以保留时间定性，色谱峰面积定量。
1.2.4标准溶液的配制
精确称取VB1 0.01g于100ml容量瓶中，用0.1mol/L
HCl溶解稀释到刻度，配制成10μg/ml的标准储备液。
精密量取上述标准储备液1ml，用0.1mol/L HCl稀
释至100ml做标准工作液，标准工作液的浓度为1μg/ml。
梯度法依次取标准工作液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，
再依次加入0.1mol/L HCl 0.8、0.6、0.4、0.2ml，使每
个梯度标准液的终体积为1ml，然后再分别加入0.4g/L
K3Fe(CN)6的NaOH溶液1ml进行氧化，使VB1氧化成硫
色素，反应5min后分别加1ml异丁醇提取硫色素。
1.2.5标准曲线的建立
对1.2.4配制的梯度标准溶液上机测定，用岛津LC-
Solution工作站采用外标峰面积法定量，绘制出VB1浓
2 结果与分析
2.1加标回收实验
取同一品种小米，分别称取2.0g左右样品12份，
分别加入“1.2.4”中浓度为1μg/ml标准工作液0.5、
2、5ml，做低、中、高浓度三个水平的加标回收实
验，每个梯度浓度做4个平行，按“1.2.2”条件下
的样品处理方法进行处理。3个质量浓度的方法回收
率结果见表1。方法的回收率实验反映了测定方法的
准确性，从实验结果可见，方法回收率均大于90%，
RSD在0.47%～2.89%。VB1标准品色谱图见图3，小
米VB1色谱图见图4。
添加量(ml) 0.5 2.0 5.0
回收率(%)±标准偏差(SD%)93.19±2.5491.59±1.6794.27±1.23
相对标准偏差(RSD%) 2.89 1.53 0.47
表1 同一品种小米中添加三个浓度水平VB1的回收率(n=4)
Table 1 Methodological recovery of determination of VB1 in
same variety millet sample (n=4)
N
H3C C
C
C
C
H
N CH2
NH·HClN C
N+
Cl－
C CH3
C CH2
S
CH2OH+ K3Fe(CN)6
盐酸硫胺素
N
H3C C
C
C
C
H
N
硫色素
C
N C
CH3
C
S CH2CH2OH
C
H H
N
图1 反应方程式
Fig.1 Reactivity equation
2.2精密度测定实验
取不同品种小米6份，分别称取1.5g左右小米样品
36份，每个品种6个重复。按“1.2.2”条下的样品
处理方法进行处理，上机测定，测定结果见表2，相
对标准偏差在2.8%～5.9%。
2.3空白对照实验
不加任何试样，按1.2.2进行前处理，按1.2.3上机
测定，结果在硫色素相应保留时间的位置无色谱峰。由
此可见样品前处理过程不影响测定。
2.4最低检出限实验
以信噪比等于3时为方法的检出限，此方法的最
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
浓
度
(μ
g
/
m
l
)
峰面积
0
1
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
5
0
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
7
0
0
0
0
0
8
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
图2 标准工作曲线的相关性
Fig.2 Relativity of calibration curve
Y = aX + b，a=1.189539×10－6，b=－7.826432×10－3，R2=
0.9987933，R= 0.9993965，平均RF=1.167444×10－6，RF标准偏差
=2.456309×1 －8，RF相对标准偏差=2.104006%。
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30
25
20
15
10
5
0
0.05.010.015.020.025.0
电
压
(
m
V
)
时间(min)
VB1
图3 VB1标准品色谱图
Fig.3 Chromatogram of standard solution
30
25
20
15
10
5
0
0.05.010.015.020.025.0
电
压
(
m
V
)
时间(min)
VB1
图4 小米样品VB1色谱图
Fig.4 Chromatogram of millet sample
小米品种 1 2 3 4 5 6 相对标准偏差(%)
A 0.2870.3210.2880.2930.3260.314 5.7
B 0.3130.3130.3380.3260.3180.309 3.4
C 0.2290.2320.2220.2180.2170.230 2.9
D 0.3560.3530.4100.3810.3860.361 5.9
E 0.2890.2740.2740.2800.3000.299 4.1
F 0.3160.304.2720.2820.2960.312 5.8
表2 6个不同品种小米测定结果重现性实验(n=6)
Table 2 Precision of determination of VB1 in different variety
millet samples (n=6)
低检出限为1.56ng/ml，在我国小米中VB1的平均含量
为0.35mg/100g，所以此方法完全可以满足小米中VB1含
量的测定。
3 讨 论
3.1在小米中VB1是以硫胺素焦磷酸(图5)的结合态存
在的，高温高压下0.1mol/L HCl是将硫胺素焦磷酸提取
出来，只有用高峰淀粉酶经过16～24h的酶解才能将VB1
从结合态释放出来。所以测定原粮中VB1与测定食品中
添加的VB1的区别在于如何得到游离状态的VB1，同时
也是测定的难点。
3.2谷物中VB1的检测是用荧光分光光度计法，样品
前处理中需用柱层析法处理，样液上机测定需设空白对
照，过程繁琐，操作系统误差大。由于液相色谱柱的
分离功能可以将复杂的成分分离开，所以用高效液相色
P
N
H3CC
C
C H
C
N
C
NH2
CH3
CH2
C
S
CH2CH2
C
H
+N
O P O O H
O O
O－ O－
图5 硫胺素焦磷酸结构图
Fig.5 Generic structure of thiamine phosphate
谱法可以简化前处理步骤，从而提高方法的回收率。荧
光检测比紫外检测灵敏度高10～1000倍[9]，在摸索检测
方法的过程中，用紫外检测器分析，由于VB1属于阳离
子化合物，直接检测VB1用C18柱进行分离要选择离子
对试剂，离子对试剂不易购买而且价格昂贵。小米中
VB1的含量很少，用紫外检测器分析已达到仪器的检测
底限，所以重现性很差。本实验利用硫色素易溶于异
丁醇的性质萃取分离出硫色素，用荧光检测器测其荧光
来定量。
3.3据文献[10-11]报道，碱性条件下氧化盐酸硫胺常用
的试剂有铁氰化钾、氯化汞和溴化氰，本实验用铁氰
化钾做氧化剂使VB1氧化为硫色素后随即用异丁醇进行
萃取，实验结果很稳定，还原性杂质对硫色素的干扰
甚少，考虑到氯化汞和溴化氰对人体和环境的二次污
染，没有用氯化汞和溴化氰作氧化剂。进一步的实验
将细致分析三者还原的区别。
3.4本实验的关键步骤为1.2.2，提取出的VB1用K3Fe
(CN)6的NaOH溶液进行氧化，因为VB1在碱性条件下
易被破坏，所以涡旋要快。实验中对K3Fe(CN)6的浓度
和用量设计了梯度试验，参考小米中VB1的含量，确
定0.4g/L K3Fe(CN)6的NaOH溶液1ml进行氧化最为合理。
4 结 论
本方法通过做加标回收、精密度、空白对照和最
低检出限实验，从相对标准偏差和回收率来看，该方
法完全可以用来检测小米中VB1的含量。
参考文献：
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