全 文 ：药 物 生 物 技 术
Pharmaceutical Biotechnology 2013，20(3) :245 ～ 249
正交实验联用响应面法优化脱皮马勃总生物碱提取的研究
童 心，王 勇，高 锐，汪维云
*
(安徽农业大学 生命科学学院，安徽 合肥 230036)
摘 要 为获取提取马勃总生物碱的最优方法，比较了酸性醇回流法和一般醇回流法提取马勃总生物碱的
效果，并结合使用正交设计和响应面法两种实验设计方法，研究酸性醇回流法提取脱皮马勃总生物碱时提取液乙
醇浓度、料液比、提取时间和提取次数的影响，建立了一个总生物碱得率与影响因子的多元二次回归方程，并依此
确定总生物碱的最佳提取条件。结果表明:酸性醇回流法优于普通醇回流法，最佳提取条件为 pH 2 的 78%乙醇，
料液比 1∶ 18，提取时间 188 min × 3。优化后提取方法相比于原始方法提高了总生物碱得率 30%。
关键词 脱皮马勃;总生物碱;正交设计;响应面法
中图分类号 Q5 文献标志码 A 文章编号 1005-8915(2013)03-0245-05
马勃为传统中药，中国药典(2005 年版)［1］收载的 3 种
正品马勃为脱皮马勃 Lasiosphaera fenzlii Ｒeich.、大马勃
Calvatia gigantea (Batsch:pers. )Lloyd. 和紫色秃马勃
Calvatia lilacina(Mont. et Berk. )Lloyd. 的干燥子实体。此
外，在民间，还有同为灰包科、以及硬皮马勃科和地星科中
数十种大型真菌也被当作马勃入药。
传统中医学认为，马勃有消肿、止血、解毒等功效，传统
上对马勃药理作用的研究主要集中在抑菌、止血、抗炎止咳
等方面［2］。现代国内外研究表明，马勃具有抗肿瘤［3-5］、生
长抑制［6］、抗氧化［7］等多方面的药理活性。
目前有报导，从马勃类中提取出酰胺类等生物碱类成
分，这些成分与马勃的抗肿瘤、抗炎等活性有关［8］，本实验
选用最常用的脱皮马勃作为实验材料，拟用正交设计和响
应面优化相结合的方式，优化选取醇回流法提取脱皮马勃
中总生物碱的工艺，获取最佳工艺条件。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
脱皮马勃(Lasiosphaera fenzlii Ｒeich. )成熟子实体购自
安徽亳州，由安徽农业大学中药与天然药物研究所鉴定;无
水乙醇、二氯甲烷等，均为分析纯。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 生物碱的原始提取工艺及含量测定方法 根据文
献［9］，在适当的递质中，生物碱类可与一些酸性染料结合
为有机络合物，随后用有机溶剂定量萃取，通过测定该有机
溶液吸光度可以计算生物碱的含量。马勃生物碱在国内外
尚未有标准品，但按照酸性染料比色法的原理，萃取液中生
物碱含量与其染色后吸光度在一定范围内呈线性关系。
将马勃子实体充分粉碎后，称取 10 g粉末于 250 mL圆
底烧瓶中，以 200 mL用 6 mol /L的盐酸溶液调节 pH值为 2
的 80%乙醇溶液 80 ℃加热回流提取 3 h。过滤，收集滤液，
真空加热浓缩后挥干至无乙醇味得浸膏。将浸膏加蒸馏水
定容到 100 mL，随后加入适量 6 mol /L 盐酸调节 pH 值至
2，过滤弃去酸不溶物，加 2 mol /L NaOH 调节溶液 pH 值到
10 后，用 50 mL二氯甲烷萃取，多次提取保存萃取液混合
备用，为原始工艺提取液(Ⅰ)。
称取溴百里酚蓝 0. 02 g，加 pH 4. 0 枸橼酸-磷酸氢二钠
缓冲液定容成 100 mL，摇匀溶解并过滤，即得 0. 02%溴百
里酚蓝染色液。
1. 2. 1. 1 测定波长的选择 取提取液(Ⅰ)5 mL，加入5 mL
0. 02%溴百里酚蓝染色液，充分振摇后静置，分取二氯甲烷
层，以同法处理二氯甲烷为空白对照，于 380 ～ 480 nm 范围
内扫描测定吸光度，马勃总生物碱的测定波长。
1. 2. 1. 2 生物碱浓度与吸光度线性关系的验证 取上述
提取液(Ⅰ)100 mL，蒸馏浓缩后定容至 5 mL 得浓缩液
(Ⅱ)。分别取 0. 125，0. 25，0. 5，0. 75，1 mL 浓缩液(Ⅱ)并
加入二氯甲烷定容至 5 mL，得样品溶液，其浓度倍数分别为
提取液(Ⅰ)0. 5，1，2，3，4 倍。在 410 nm处测定吸光度，以样
品浓度倍数为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归。
1. 2. 2 总生物碱提取优化
1. 2. 2. 1 醇回流 pH值的选择 分别用 6 mol /L 盐酸调节
80%乙醇的 pH 值为 1，2，4，6，自然 pH 值，按照 1. 2. 1 方
法，以 1∶ 20 的料液比提取 3 h并测定萃取液吸光度。
1. 2. 2. 2 乙醇浓度范围的确定 分别使用 60%，70%，
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* 收稿日期:2012-02-09 修回日期:2013-03-18
作者简介:童心(1988-) ，男，硕士研究生，研究方向为生物化学与生物制药。
* 通讯作者:汪维云，男，教授，E-mail:weiyunw@ 126. com。
药 物 生 物 技 术 第 20 卷第 3 期
80%，90%乙醇，用6 mol /L盐酸调节 pH值为2后按照1. 2. 1
方法，以 1∶ 20的料液比提取 3 h并测定萃取液吸光度。
1. 2. 2. 3 提取时间范围的确定 使用 80%乙醇，用 6 mol /L
盐酸调节 pH值为 2后按照 1. 2. 1方法，以 1∶ 20的料液比分
别提取 1，2，3，4 h并测定萃取液吸光度。
1. 2. 2. 4 正交设计 在单因素试验的基础上，选定提取初
pH值为 2，以乙醇浓度、提取时间、提取次数、料液比 4 个影
响因子采用 L9(3
4)正交表按照表 1 进行正交试验，将萃取
液吸光度 × 1 000 作为目的指标，数据分析使用 Design
Expert 7. 1. 6 软件进行。
1. 2. 2. 5 响应面分析结合 选取乙醇浓度 A、提取时间 B、
料液比 C 3个因素作为自变量，将萃取液吸光度 × 1 000 作
为目的指标 Y进行 Box-Behnken响应面优化，自变量的试验
水平以 －1，0，1进行编码，试验设计与统计分析数据分析使
用 Design Expert 7. 1. 6软件进行。试验设计见表 2和表 3。
2 结果与分析
2. 1 生物碱的原始提取工艺及含量测定方法
2. 1. 1 测定波长的选择 结果如图 1 所示，结果表明马勃
总生物碱提取液可用溴百里酚蓝溶液染色，染色后二氯甲
烷相在 410 nm处有最大吸收。
Fig 1 Absorbance spectra of extract liquor after color reaction
2. 1. 2 生物碱浓度与吸光度线性关系的验证 结果如图 2
所示，结果表明染色后吸光度与样品中马勃总生物碱浓度
在总生物碱浓度为提取液(Ⅰ)0. 5 ～ 4 倍范围内呈现良好
的线性关系(Ｒ2 = 0. 999 4) ，吸光度可以直接体现原提取液
中生物碱的含量。为便于计算，在 2. 2 结果分析中，采用染
色后二氯甲烷相 410 nm处吸光度作为优化指标。
Fig 2 Linear relation of absorbance of extract liquor
2. 2 总生物碱提取优化
2. 2. 1 醇回流 pH值的选择 结果如图 3 所示，结果表明
提取液初始 pH 值对萃取液染色后吸光度，即其中总生物
碱含量影响较大，pH 2 时萃取液吸光度最大，说明酸性醇
回流法优于中性醇回流法。
Fig 3 Effect of pH value of ethanol solution on the
absorbance of extract liquor
2. 2. 2 乙醇浓度范围的确定 结果如图 4 所示，结果表明
乙醇体积分数为 80%时萃取液染色后吸光度最大，即总生
物碱含量最高。
Fig 4 Effect of concentration of ethanol on
the absorbance of extract liquor
2. 2. 3 提取时间范围的确定 结果如图 5 所示，结果总生
物碱获得量随提取时间延长而上升，但 3 h 后上升已不明
显，最适总生物碱提取时间为 3 h左右。
Fig 5 Effect of extraction time on the
absorbance of extract liquor
2. 2. 4 正交设计 实验结果和极差分析结果见表 1。影响
生物碱获得量的主次因素为 B ＞ C ＞ D ＞ A，最佳组合是
A2B2C3D3。然而，D2(料液比 1∶ 15)和 D3(料液比 1∶ 20)结
果相差很小，于响应面法中进一步优化。回流次数过多不
利于节约原则，且作为离散型变量不宜使用响应面方法，因
此选定回流次数 3 次。
642
童 心等:正交实验联用响应面法优化脱皮马勃总生物碱提取的研究
Tab 1 The results of orthogonal test
Treatment
Factors
A
(Concentration of ethanol)
(%)
B
(Extraction time)
(h)
C
(Times of reflux)
D
(Ｒatio of solid to liquid)
Absorbance of
extract liquor
(× 1000)
1 75 2. 5 1 1∶ 10 70
2 75 3 2 1∶ 15 140
3 75 3. 5 3 1∶ 20 146
4 80 2. 5 2 1∶ 20 103
5 80 3 3 1∶ 10 142
6 80 3. 5 1 1∶ 15 112
7 85 2. 5 3 1∶ 15 109
8 85 3 1 1∶ 20 118
9 85 3. 5 2 1∶ 10 114
K1 118. 667 94 100 108. 667
K2 119 133. 333 119 120. 333
K3 113. 667 124 132. 333 122. 333
Ｒ 3. 45 39. 33 19 11. 66
Best combination A2 B2 C3 D3
2. 2. 5 响应面分析 试验结果和分析见表 3 和表 4。使
用二次多项式回归，拟合得到萃取液吸光度(× 1 000)Y
对 3 个因素乙醇浓度 A、提取时间 B、料液比 C的二次多项
式方程为:
Y = 154. 00 － 4. 87A + 13. 00B + 5. 13C + 2. 00AB +
3. 25AC +1. 50BC －3. 13A2 － 24. 38B2 － 4. 12C2(Ｒ2 = 0. 986 7)
该模型 F = 57. 63，P ＜ 0. 0001，表明该模型方程极显
著，失拟项 F = 1. 07，P = 0. 456 2 ＞ 0. 05，表明失拟项不显
著。二次项中 B2 对萃取液吸光度影响极显著(P ＜ 0. 01) ，
C2 影响显著(P ＜ 0. 05) ，表明各因素对萃取液吸光度的影
响不是简单的线性关系。模型修正后 Ｒ2 = 0. 969 6，说明该
模型能反映 96. 96%响应值的变化。
为考察各因素对萃取液吸光度的影响，将一个因素设
为中心值，描绘对应两因素的三维响应面图，结果如图 6 所
示。由图 6 可知萃取液吸光度在本实验设定范围内存在最
大值，即三维曲线的最高点，等高线的中心点。通过软件分
析得到 Y取最大值时 A = － 0. 44，B = 0. 26，C = 0. 50，此时
乙醇体积分数为 77. 8%，提取时间 3. 13 h，料液比 1∶ 17. 5，
Y预测值为 158. 055。考虑到可行性，将其修正为乙醇浓度
78%，提取时间 188 min，料液比 1 ∶ 18，此时 Y 预测值为
158. 02，为验证结果的可靠性，以此条件进行 3 次验证性试
验，结果见表 5。最终 3 次测定结果萃取液吸光度平均值为
0. 156，与预测值接近，相对标准偏差为 1. 6%，将吸光度
0. 156 带入图 2(萃取液浓度和吸光度线性关系图)所得线
性方程中计算，得浓度倍数为 1. 305 5，即该工艺比 1. 2. 1
中原始工艺总生物碱获得量提高了 30%。
Tab 2 Experimental design of ＲSM with 3 factors and 3 levels
Levels
Factors
A(Concentration
of ethanol)
(%)
B
(Extraction time)
(h)
C(Ｒatio of
solid to liquid)
－ 1 75 2. 5 1∶ 10
0 80 3 1∶ 15
1 85 3. 5 1∶ 20
Tab 3 Design and results of ＲSM
Treatment
Factors
A B C
Absorbance of extract
liquor(× 1000)
1 － 1 － 1 0 121
2 1 － 1 0 109
3 － 1 1 0 140
4 1 1 0 136
5 － 1 0 － 1 150
6 1 0 － 1 132
7 － 1 0 1 155
8 1 0 1 150
9 0 － 1 － 1 108
10 0 1 － 1 134
11 0 － 1 1 114
12 0 1 1 146
13 0 0 0 153
14 0 0 0 155
15 0 0 0 150
16 0 0 0 158
17 0 0 0 154
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药 物 生 物 技 术 第 20 卷第 3 期
Tab 4 Ｒesults of variance analysis
Source Sum of squares df Mean square F value P-value Prob ＞ F
Model 4 538. 515 9 504. 279 4 57. 631 93 ＜ 0. 000 1
A 190. 125 1 190. 125 21. 728 57 0. 002 3
B 1352 1 1352 154. 514 3 ＜ 0. 000 1
C 210. 125 1 210. 125 24. 014 29 0. 001 8
AB 16 1 16 1. 828 571 0. 218 4
AC 42. 25 1 42. 25 4. 828 571 0. 064 0
BC 9 1 9 1. 028 571 0. 344 3
A2 41. 118 42 1 41. 118 42 4. 699 248 0. 066 8
B2 2 501. 645 1 2501. 645 285. 902 3 ＜ 0. 000 1
C2 71. 644 74 1 71. 644 74 8. 187 97 0. 024 3
Ｒesidual 61. 25 7 8. 75
Lack of fit 27. 25 3 9. 083 333 1. 068 627 0. 456 2
Pure Error 34 4 8. 5
Total 4 599. 765 16
Ｒ2 = 0. 986 7 Adj Ｒ2 = 0. 969 6
Fig 6 Ｒesponse contour and 3D surface by different factors
Tab 5 Ｒesults of verifying experiment
No. Absorbance of extract liquor Mean value ＲSD
1 0. 156
2 0. 154 0. 156 0. 016
3 0. 159
3 小结与讨论
目前已有部分对马勃生物碱类成分及其活性的报导，
但是对其提取方法优化的报导很少。生物活性成分有效的
提取方法是对其进一步开发利用、纯化、结构鉴定和药理作
用研究的基础，目前对生物碱提取的研究主要使用传统单
因素试验，使用正交设计或响应面分析方法优化马勃总生
物碱提取工艺未见报道。
传统的正交设计方法是一种用线性数学模型进行设计
的设计方法，可以找出多个因素水平的最佳组合。但是正
交设计只能分析离散型数据，具有精度不高，预测性不佳的
缺点。响应面法采用非线性模型，能求得高精度的回归方
程，进行合理预测来找出最优工艺条件。本实验结合使用
正交设计和响应面法两种方法，以能直接反映萃取液中生
物碱含量的萃取液染色后吸光度作为替代指标，用正交设
计进行初步优化、逼近最优工艺条件后，建立响应面方程并
进行更为精确的预测，并结合单因素实验结果和工艺实际，
最终确立最佳工艺条件为提取液初始 pH 2，乙醇体积分数
78%，料液比 1∶ 18，提取时间 188 min，提取次数 3 次。经过
验证，该工艺结果与预测值接近，重现性良好，比原工艺生
物碱获得量提高了 30%，从而建立了一个稳定可靠的脱皮
马勃总生物碱提取工艺流程，为马勃总生物碱进一步开发
利用打下了基础。
参 考 文 献
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842
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Optimization of Extraction Conditions of Total Alkaloids from Lasio-
sphaera Fenzlii by a Combination of Orthogonal Design with Ｒesponse
Surface Method
TONG Xin，WANG Yong，GAO Ｒui，WANG Wei-yun*
(School of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)
Abstract In order to get an optimized method of the extraction of total alkaloids from Lasiosphaera fenzlii，the effect of acidity alcohol
reflux and normal alcohol reflux were compared in this article． To optimize the extraction condition，several factors，including concen-
tration of ethanol，ratio of solid to liquid，extraction time and times of reflux were chosen as indices by the combination of orthogonal
design and response surface method(ＲSM)． A quadratic polynomial mathematical model with good correlation was constructed with
mathematical analysis software and employed to the optimization of extract conditions． The results showed that the acidity alcohol
reflux works better than normal alcohol reflux in the extraction of total alkaloids from Lasiosphaera fenzlii，and the best extraction
condition in acidity alcohol reflux was ethanol with 78% concentration and pH value 2，1 ∶ 18 ratio of solid to liquid and extract for
188 min × 3． Compared with the original method，the optimized extraction method increased the yield of total alkaloids by 30%.
Key words Lasiosphaera fenzlii，Total alkaloids，Orthogonal design，
櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗
Ｒesponse surface method
·信 息·
2013 －28 全基因组关联研究的里程碑 全基因组关联研究(Genome-wide sociationSmdy，简称 GWAS)是一种用来寻找基因变
异与表型之间关系的遗传学方法，最近几年在人类医学遗传学领域中发展迅速。到目前为止，虽然世界各地的研究人员已经对数
百种疾病进行了 GWAS分析，确定了大批疾病易感区域和相关基因，发现了一些与疾病相关的基因突变位点。然而到目前为止，这
些通过 GWAS研究发现的疾病风险位点所显示的效应规模(effectsize)通常不大，同时提供的生物过程信息也非常的有限。
来自德国、英国、美国以及澳大利亚等国家 20 多所研究机构的研究人员，组成的一个国际研究小组在新研究中将 GWAS与血
液代谢物(作为功能性中间体表现型)的分析综合在了一起。这是目前利用 GWAS 技术针对血液代谢物的人类基因组遗传变异的
最大型研究项目，该项目综合了来自德国 KOＲAF4和英国 TwinsUK两个人群的研究数据。研究人员针对人体血液中超过 250 种代
谢物包括脂肪、糖类、维生素、氨基酸等相关基因位点进行了筛查，结合覆盖 2 820 人的 60 个生物化学通道的非定向“代谢组学”数
据，研究人员识别出了 37 个与血液代谢物浓度相关的基因位点。其中 25 个显示了异常高的效应规模，每个等位基因均可导致代谢
物水平发生 10% ～ 60%的差异。
在新研究中，研究人员发现一种天然糖类甘露糖与糖尿病相关的遗传变异存在关联性:发现了影响肾脏排毒功能并可能引发
肾脏病的 NAT8基因:揭示了与凝血与血栓形成相关的遗传变异。此外，研究人员还证实这一方法有助于确定遗传变异对药物反应
及疗效的影响，使药物研发人员在药物开发试验中发现可能存在的副作用，以改良药物配方减小这些副效应。
在过去的研究中，科学家们通常只能观测一个或几个代谢物的水平。例如，胆固醇水平或血糖水平，以此作为疾病诊断的依
据。在这一新研究中，科研人员实现了高通量的代谢物分析，获得了与疾病症状或发病相关的潜在分子图谱。这一详细的图谱将
推动研究人员更深入地了解遗传变异对于疾病的影响。
英国剑桥大学韦尔科姆基金会桑格学院的研究人员 NicoleSoranzo博士说:“我们的研究发现为研究者们提供了很多疾病的关
联，包括与心血管病和肾病、2-型糖尿病、癌症、痛风、静脉血栓和克罗恩病相关的关联，在功能方面提供了新的认识，为制定个体化
治疗策略提供了重要的信息。”
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