全 文 ：［收稿日期］ 20150318(027)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(31160074)
［第一作者］ 胡文超，在读硕士，从事天然产物化学研究，Tel:15701923001，E-mail:hwchhuwenchao@ 163. com
［通讯作者］ * 万传星，博士，教授，从事天然产物的农用及医用研究，Tel:13565169329，E-mail:wanchuanxing@ 163. com
中药一支箭 HPLC指纹图谱
胡文超，孟庆艳，万传星*
(新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，
塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)
［摘要］ 目的:建立中药一支箭 3 种基源植物尖头瓶尔小草(Ophioglossum pedunculosum)、狭叶瓶尔小草(O． thermal)和
瓶尔小草(O． vulgatum)的 HPLC 指纹图谱，为科学评价药材质量提供依据。方法:采用 HPLC 方法，Waters Xbridget 色谱柱
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相甲醇(A)-0. 3%甲酸水(B)梯度洗脱，流速 1. 0 mL·min －1，柱温 40 ℃，检测波长 260 nm，进
样量 10 μL，用聚类分析、相似度分析和主成分分析方法对一支箭指纹图谱进行分析。结果:15 批一支箭中药材归为 3 类，确
定 14 个主要共有峰，在亲缘关系上狭叶瓶尔小草和瓶尔小草较近，离尖头瓶尔小草较远，利用 4 个对照品瓶尔小草醇，3-O-甲
基槲皮素，瓶尔小草醇 4-O-β-D-葡萄糖苷和 3-O-甲基槲皮素 7-O-β-D-葡萄糖基-4-O-β-D-葡糖糖苷的相对含量作为化学分类
学标签可区分 3 个种。结论:一支箭 HPLC指纹图谱的构建为其基源植物的质量控制和品种鉴定提供了参考。
［关键词］ 一支箭;尖头瓶尔小草;狭叶瓶尔小草;瓶尔小草;指纹图谱
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2016)06-0061-05
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2016060061
Fingerprint Analysis of Ophioglossum by HPLC
HU Wen-chao，MENG Qing-yan，WAN Chuan-xing*
(Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Ｒesources in Tarim Basin of
Xinjiang Production ＆ Construction Corps，School of Life Science，Tarim University，Alar 843300，China)
［Abstract］ Objective:To establish the HPLC fingerprints of Ophioglossum pedunculosum，O． vulgatum
and O． thermal of O． and provide basis for its quality evaluation． Method:HPLC method was used on Waters
Xbridget column (4. 6 mm × 250 mm，5 μm)with the mobile phase of methanol (A)-0. 3% methanoic acid
solution (B)for gradient elution． The flow rate was 1. 0 mL·min －1 and the column temperature was 40 ℃ ． The
detection wavelength was set at 260 nm，and the injection volume was 10 μL． The fingerprints of Ophioglossum
were analyzed by cluster analysis，similarity comparative analysis and principal component analysis． Ｒesult:
Fifteen batches of Ophioglossum were classified into three kinds，and 14 main common peaks were identified in the
fingerprints． The genetic relationship of O． vulgatum and O． thermal was close to each other，while far away from
O． pedunculosum． Four control substances including ophioglonol，3-O-methylquercetin，ophioglonol4-O-β-D-
glucopyranoside， and 3-O-methylquercetin7-O-β-D-glucopyranosyl-4-O-β-D-glucopyranoside can be served as
chemotaxonomy tags for distinguishing the above three kinds． Conclusion:The establishment of HPLC fingerprint
of Ophioglossum provides a reference method for quality control and species identification of its original plants．
［Key words］ Ophioglossum; Ophioglossum pedunculosum; Ophioglossum thermal; Ophioglossum
vulgatum;fingerprint
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中药一支箭［1］为瓶尔小草科瓶尔小草属的蕨
类植物，该属植物主要分布于东北、四川、江苏、云
南、贵州、广西和台湾等地，被列为国家二级保护植
物［2］。中药一支箭具有清热解毒、活血散瘀之功
效，主治毒蛇咬伤、痈肿疮毒、疥疮身痒、跌打损伤、
瘀血肿痛、烧烫伤、瘀滞腹痛、肝炎、肺炎等［3］，在台
湾地区称之为“药王”［4］。现代研究发现主要含有
黄酮、甘油酯类和氨基酸等化学成分，其特征化合物
为高黄酮及其苷类化合物，此类黄酮在 C 环或 B 环
骨架上通过 C-C键多连一个碳而有别于黄烷酮、黄
酮醇、查耳酮等其他类型黄酮，具有抗炎和抗乙型肝
炎病毒(HBV)活性［5-6］，因而备受关注。中药一支
箭通常只有一片全缘的叶片，孢子体在形态上虽然
极为简单，然而在细胞学上却具有生物界最高的染
色体数目(400 ～ 600) ，正是由于形态过于简单，反
而给分类造成很大困难［7］。目前关于瓶尔小草种
属的鉴别仅限于植物形态学上，而从化学分类学角
度鉴别尚未见报道，本论文拟通过 HPLC 指纹图谱
的建立为中药一支箭的鉴别和质量控制提供依据。
1 材料
1. 1 仪器 LC-20AT 型高效液相色谱仪(含 LC-
20AT二元高压梯度泵，SPD-M20A 型紫外检测器，
Lab Solutions色谱工作站，日本岛津公司) ，BT125D
型电子分析天平(德国塞多利斯公司) ，XT-250A 型
中药粉碎机(浙江省永康市溪安五金厂)。
1. 2 试药 瓶尔小草醇，3-O-甲基槲皮素，瓶尔
小草醇 4-O-β-D-葡萄糖苷和 3-O-甲基槲皮素 7-
O-β-D-葡萄糖基-4-O-β-D-葡糖糖苷对照品为本
课题组从尖头瓶尔小草中分离得到，经 NMＲ 鉴
定其结构，纯度均 ＞ 95%。15 批一支箭药材来源
见表 1，经塔里木大学万传星教授鉴定为尖头瓶
尔小 草 Ophioglossum pedunculosum，瓶 尔 小 草
O． vulgatum和狭叶瓶尔小草 O． thermale 的干燥
全草。
表 1 一支箭药材来源
Table 1 Sources of Ophioglossum Spp．
No． 来源 产地 采集日期 No． 来源 产地 采集日期
S1 狭叶瓶尔小草 河北保定 2014-07 S9 狭叶瓶尔小草 广西宜州 2014-08
S2 狭叶瓶尔小草 贵州贵阳 2014-07 S10 瓶尔小草 四川阿坝 2014-07
S3 狭叶瓶尔小草 湖北咸宁 2014-09 S11 瓶尔小草 四川绵阳 2014-08
S4 狭叶瓶尔小草 四川眉山 2014-08 S12 瓶尔小草 广西河池 2014-09
S5 狭叶瓶尔小草 广西南宁 2014-07 S13 瓶尔小草 广西宜州 2014-07
S6 狭叶瓶尔小草 四川穹窿 2014-08 S14 尖头瓶尔小草 云南昆明 2014-07
S7 狭叶瓶尔小草 四川攀枝花 2014-07 S15 尖头瓶尔小草 云南大理 2014-09
S8 狭叶瓶尔小草 福建仙游 2014-07
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Waters Xbridget C18色谱柱(4. 6
mm × 250 mm，5 μm) ，检测波长 260 nm，流动相甲
醇(A)-0. 3% 甲酸水(B)梯度洗脱(0 ～ 30 min，
10% ～50% A;30 ～ 50 min，50% ～ 80% A;50 ～ 60
min，80% ～100%A;100% A 保持 10 min) ，柱温 40
℃，流速 1. 0 mL·min －1，进样量 10 μL。
2. 2 对照品溶液制备 精密称取 3-O-甲基槲皮素
7-O-β-D-葡萄糖基-4-O-β-D-葡糖糖苷 1. 5 mg，瓶尔
小草醇 2. 0 mg，3-O-甲基槲皮素 1. 5 mg和瓶尔小草
醇 4-O-β-D-葡萄糖苷 1. 5 mg 置 10 mL 量瓶中，加
50%甲醇至刻度，摇匀，配成质量浓度分别为 0. 15，
0. 20，0. 15，0. 15 g·L －1的混合对照品溶液。
2. 3 供试品溶液制备 称取尖头瓶尔小草、狭叶瓶
尔小草和瓶尔小草的干燥品(过 100 目筛)各 5. 0
g，分别用 75%甲醇溶液 150 mL，80 ℃热回流提取
4 h，室温冷却后，取 1 mL提取液过 0. 45 μm的微孔
滤膜，备用。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 精密度试验 取同一供试品溶液(S1) ，按
2. 1 项下方法重复进样 6 次，结果各主要色谱峰的
相对保留时间和相对峰面积的 ＲSD 均 ＜ 3. 0%，表
明仪器精密度良好。
2. 4. 2 重复性试验 取 S1 药材粉末 6 份，按 2. 3
项方法平行制备 6 份供试品溶液，按 2. 1 项下色谱
条件进样分析，各主要色谱峰的相对保留时间和相
对峰面积的 ＲSD 均 ＜ 3. 0%，表明本方法重复性
良好。
2. 4. 3 稳定性试验 取同一供试品溶液(S1) ，按
2. 1 项下色谱条件，分别在 0，4，8，12，24 h 进样，各
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主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的 ＲSD
均 ＜ 3. 0%，表明供试品溶液 24 h内稳定。
2. 5 样品测定 取 9 批狭叶瓶尔小草、4 批瓶尔小
草及 2 批尖头瓶尔小草药材样品，按 2. 3 项下方法
制备供试品溶液，在 2. 1 项下色谱条件依次进样测
定，记录 HPLC 色谱图。所有药材的 HPLC 指纹图
谱，见图 1。
2. 6 指纹图谱分析
2. 6. 1 相似度评价［8］ 将 S1 ～ S15 样品色谱图导
入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004 版软
件，通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，得到
15 批一支箭药材提取物色谱指纹图谱，并根据匹配
结果确定了 14 个主要共有峰，以 S1 样品图谱作为
参照图谱，进行相似度计算，见表 2。狭叶瓶尔小草
共有模式之间的相似度除 S8 外均 ＞ 0. 90，瓶尔小草
4 个样本间的相似度均 ＞ 0. 70，尖头瓶尔小草 2 个
样本之间的相似度为 0. 95，从上述结果可以看出不
同地区同种一支箭药材相似度较高但存在一定的
差异。
图 1 中药一支箭 HPLC指纹图谱
Fig． 1 HPLC fingerprint chromatograms of Ophioglossum Spp．
表 2 15 批次样品相似度评价
Table 2 Similarities for 15 batches of samples
批次 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 Ｒ
S1 1. 00 0. 97 0. 94 0. 99 0. 96 0. 94 0. 99 0. 87 0. 94 0. 59 0. 71 0. 63 0. 60 0. 44 0. 50 0. 97
S2 0. 97 1. 00 0. 98 0. 96 0. 96 0. 99 0. 97 0. 74 0. 88 0. 68 0. 78 0. 72 0. 70 0. 46 0. 52 0. 99
S3 0. 94 0. 98 1. 00 0. 93 0. 98 0. 98 0. 94 0. 70 0. 89 0. 69 0. 78 0. 73 0. 71 0. 45 0. 51 0. 98
S4 0. 99 0. 96 0. 93 1. 00 0. 96 0. 94 0. 99 0. 87 0. 94 0. 57 0. 70 0. 62 0. 59 0. 43 0. 49 0. 97
S5 0. 96 0. 96 0. 98 0. 96 1. 00 0. 94 0. 96 0. 80 0. 96 0. 59 0. 71 0. 64 0. 60 0. 41 0. 46 0. 98
S6 0. 94 0. 99 0. 98 0. 94 0. 94 1. 00 0. 94 0. 68 0. 84 0. 72 0. 81 0. 75 0. 74 0. 46 0. 53 0. 98
S7 0. 99 0. 97 0. 94 0. 99 0. 96 0. 94 1. 00 0. 85 0. 93 0. 60 0. 71 0. 64 0. 62 0. 47 0. 53 0. 97
S8 0. 87 0. 74 0. 70 0. 87 0. 80 0. 68 0. 85 1. 00 0. 92 0. 26 0. 42 0. 35 0. 32 0. 33 0. 38 0. 77
S9 0. 94 0. 88 0. 89 0. 94 0. 96 0. 84 0. 93 0. 92 1. 00 0. 44 0. 59 0. 51 0. 47 0. 38 0. 42 0. 91
S10 0. 59 0. 68 0. 69 0. 57 0. 59 0. 72 0. 60 0. 26 0. 44 1. 00 0. 94 0. 77 0. 81 0. 61 0. 65 0. 66
S11 0. 71 0. 78 0. 78 0. 70 0. 71 0. 81 0. 71 0. 42 0. 59 0. 94 1. 00 0. 79 0. 80 0. 66 0. 70 0. 77
S12 0. 63 0. 72 0. 73 0. 62 0. 64 0. 75 0. 64 0. 35 0. 51 0. 77 0. 79 1. 00 0. 95 0. 56 0. 70 0. 70
S13 0. 60 0. 70 0. 71 0. 59 0. 60 0. 74 0. 62 0. 32 0. 47 0. 81 0. 80 0. 95 1. 00 0. 58 0. 73 0. 69
S14 0. 44 0. 46 0. 45 0. 43 0. 41 0. 46 0. 47 0. 33 0. 38 0. 61 0. 66 0. 56 0. 58 1. 00 0. 95 0. 47
S15 0. 50 0. 52 0. 51 0. 49 0. 46 0. 53 0. 53 0. 38 0. 42 0. 65 0. 70 0. 70 0. 73 0. 95 1. 00 0. 54
Ｒ 0. 97 0. 99 0. 98 0. 97 0. 98 0. 98 0. 97 0. 77 0. 91 0. 66 0. 77 0. 70 0. 69 0. 47 0. 54 1. 00
2. 6. 2 聚类分析 将 15 批一支箭基源植物色谱峰
相对峰面积导入 SPSS 19. 0 软件对其进行系统聚类
分析，采用组间联接聚类法，度量标准采用欧氏距
离，聚类结果见图 2，样品被聚为 3 类，S1 ～ S9 狭叶
瓶尔小草聚为一类，S10 ～ S13 瓶尔小草聚为一类，
S14 ～ S15 尖头瓶尔小草聚为一类。当 0≤Ｒ≤10
时，狭叶瓶尔小草除 S8 以外已聚在一块，说明狭叶
瓶尔小草间的相似度较高，当 Ｒ = 19 时狭叶瓶尔小
草和瓶尔小草聚为一块，而当 Ｒ = 25 时 3 个种才能
图 2 中药一支箭样品聚类分析
Fig． 2 Hierachical cluster analysis of Ophioglossum Spp． samples
聚为一块，可以认为狭叶瓶尔小草和瓶尔小草的亲
缘关系较近，离尖头瓶尔小草较远。
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2. 6. 3 主成分分析 以 S1 ～ S15 15 个样品 14 个
共有峰相对峰面积为变量，采用 SPPS 19. 0 软件进
行主成分(PCA)分析，一共提取 3 个主成分，对于主
成分 1，狭叶瓶尔小草除 S8 的贡献系数在 0. 521，其
余样品贡献系数均 ＞ 0. 8，瓶尔小草的贡献系数均 ＞
0. 7，对于主成分 2 尖头瓶尔小草的贡献系数均 ＞
0. 6，见表 3。从三维主成分图来看，主要聚集在 3
部分;S1 ～ S9，S10 ～ S13 和 S14 ～ S15，可以区分 3
个种且这 3 组之间有不同程度的离散，说明一支箭
表 4 中药一支箭对照品相对峰面积
Table 4 Ｒelative contents of reference substances of Ophioglossum Spp． %
品种
3-O-甲基槲皮素 7-O-β-D-
葡萄糖基-4-O-β-D-葡糖糖苷
瓶尔小草醇 4-O-β-D-
葡萄糖苷
瓶尔小草醇 3-O-甲基槲皮素
狭叶瓶尔小草 16. 77 13. 61 7. 71 6. 46
瓶尔小草 24. 94 5. 46 1. 90 3. 43
尖头瓶尔小草 8. 19 10. 61 4. 23 2. 39
基源植物常见 3 个种间有不同程度的差异，见图 3。
表 3 3 种主成分矩阵
Table 3 Component matrix
No． 1 2 3
S1 0. 943 － 0. 319 0. 041
S2 0. 982 － 0. 103 － 0. 082
S3 0. 983 － 0. 068 － 0. 099
S4 0. 937 － 0. 326 0. 064
S5 0. 952 － 0. 270 － 0. 047
S6 0. 975 0. 005 － 0. 139
S7 0. 947 － 0. 289 0. 084
S8 0. 521 － 0. 702 0. 371
S9 0. 812 － 0. 542 0. 175
S10 0. 795 0. 461 － 0. 246
S11 0. 798 0. 453 － 0. 195
S12 0. 742 0. 555 － 0. 174
S13 0. 723 0. 591 － 0. 163
S14 0. 352 0. 648 0. 629
S15 0. 430 0. 724 0. 515
2. 6. 4 对照指纹图谱及相对含量分析 将 9 份狭
叶瓶尔小草、4 份瓶尔小草和 2 份尖头瓶尔小草分
别建立指纹图谱，将其与对照指纹图谱进行比较。
在 40 ～ 60 min，尖头瓶尔小草比瓶尔小草多出 2 个
明显的色谱峰(15，18 号峰) ，比狭叶瓶尔小草多出
4 个色谱峰(15 ～ 18 号峰) ，见图 4。通过对比 4 个
对照品在 3 个种中的相对峰面积。瓶尔小草主要含
图 3 中药一支箭主成分分析
Fig． 3 PCA analysis of Ophioglossum samples
有 3-O-甲基槲皮素 7-O-β-D-葡萄糖基-4-O-β-D-葡
糖糖苷，狭叶瓶尔小草和尖头瓶尔小草主要含有 3-
O-甲基槲皮素 7-O-β-D-葡萄糖基-4-O-β-D-葡糖糖
苷和瓶尔小草醇 4-O-β-D-葡萄糖苷，瓶尔小草醇和
3-O-甲基槲皮素的相对含量较低，而尖头瓶尔小草
的化学成分较复杂，通过对比一支箭基源植物 3 个
种的对照指纹图谱及对照品的相对含量，可以看出
种间差别是比较明显的，见表 4。
A．混合对照品;B． 狭叶瓶尔小草;C． 瓶尔小草;D． 尖头瓶尔小草;
4. 3-O-甲基槲皮素 7-O-β-D-葡萄糖基-4-O-β-D-葡糖糖苷;7. 瓶尔小
草醇 4-O-β-D-葡萄糖苷;12. 瓶尔小草醇;14. 3-O-甲基槲皮素
图 4 中药一支箭对照特征谱图及混合对照品 HPLC
Fig． 4 HPLC chromatograms of Ophioglossum samples and mixed
reference substances
3 讨论
比较了热回流、超声等提取方法，热回流的提取
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效果最佳，分别对提取溶剂50%，75%，100%甲醇进
行了考察，结果表明，以 75%甲醇提取的样品，色谱峰
个数较多，且峰面积较大，提取时间分别考察了 2，3，
4，5 h，最终提取方法确定用 75%甲醇热回流 4 h。
分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0. 3%甲酸
水和甲醇-0. 3%甲酸水等溶剂系统，流动相选择甲
醇-0. 3%甲酸水分离效果最佳，使用二极管阵列检
测器对样品进行 190 ～ 400 nm 全波长扫描，重点考
察了 260，330，350，380 nm 的图谱［9］，结果显示，
检测波长在 260 nm 下出峰较多，各峰分离效果较
好，特征峰明显。
本论文采用 HPLC 指纹图谱方法将 15 批一支
箭中药材归为 3 类，确定了一支箭 3 种基源植物的
14 个主要共有峰，在 3 个种的种间亲缘关系上，狭
叶瓶尔小草和瓶尔小草较近，离尖头瓶尔小草较远。
采用瓶尔小草醇，3-O-甲基槲皮素，瓶尔小草醇 4-
O-β-D-葡萄糖苷和 3-O-甲基槲皮素 7-O-β-D-葡萄糖
基-4-O-β-D-葡糖糖苷 4 种对照品的相对含量来区
分 3 个种，HPLC 指纹图谱的建立为中药一支箭品
种鉴定和质量控制提供了依据。
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liquid chromatography with diode array detection and
electrospray ionisation tandem mass spectrometry［J］．
Phytochem Anal，2013，24(6) :541-549.
［责任编辑 顾雪竹
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《中国实验方剂学杂志》入选 2015—2016 年度 CSCD(E)
经过中国科学院“中国科学引文数据库(Chinese Science Citation Database，简称 CSCD)”定量遴选、专家
定性评估，《中国实验方剂学杂志》入选 2015—2016 年度 CSCD(E)。
2015—2016 年度 CSCD收录来源期刊 1200 种，其中中国出版的英文期刊 194 种，中文期刊 1006 种。
CSCD来源期刊分为核心库和扩展库两部分，其中核心库 872 种(以备注栏中 C 为标记);扩展库 328 种(以
备注栏中 E为标记)。
CSCD具有建库历史最为悠久、专业性强、数据准确规范、检索方式多样、完整、方便等特点，自提供使用
以来，深受用户好评，被誉为“中国的 SCI”。CSCD是我国第一个引文数据库，曾获中国科学院科技进步二等
奖。该数据库已在我国科研院所、高等学校的课题查新、基金资助、项目评估、成果申报、人才选拔以及文献
计量与评价研究等多方面作为权威文献检索工具获得广泛应用。
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第 22 卷第 6 期
2016 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 22，No． 6
Mar．，2016