全 文 ：收稿日期:2014-07-13
基金项目:贵州省科学技术基金项目(黔科合 J字［2010］2213 号);贵州省重点支持建设学科项目(2011231) ;教育部生物资源科学专业综
合改革试点项目(2012287)
作者简介:甘秀海(1976-)，男，副教授，研究方向:中药化学成分及质量控制研究;E-mail:gxh200719@ 163. com。
* 通讯作者:梁志远，Tel:0851-5816647，E-mail:gzwh24000@ sina. com。
·鉴别·
冷水花药材的 HPLC指纹图谱研究及指标成分含量测定
甘秀海1，梁志远1* ，姜金仲1，周 欣2，赵 超2
(1. 贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州 贵阳 550018;2. 贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，
贵州 贵阳 550001)
摘要 目的:建立冷水花药材的 HPLC指纹图谱及指标成分含量测定方法。方法:采用 Agilent Zorbax SB-C18色
谱柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，柱温:30 ℃，流速:0. 8 mL /min，检测波长:330 nm，乙腈(A)-0. 2%冰醋酸(B)梯度
洗脱分析冷水花的指纹图谱;利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004 A 版)软件，对 24 批冷水花药材进
行比较分析，同时测定了冷水花中木犀草苷和大波斯菊苷的含量。结果:建立了冷水花药材的指纹图谱，其中有 10
个共有峰，利用对照品指认了 2 个主要共有峰，不同产地冷水花药材图谱及木犀草苷和大波斯菊苷的含量均存在
一定的差异。结论:该方法具有良好的精密度、稳定性和重复性，可用于冷水花药材的鉴别及质量控制。
关键词 冷水花;HPLC指纹图谱;相似度;聚类分析
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)02-0275-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 02. 017
HPLC Fingerprint Study and Quantitative Determination of Index Components of Pilea aquarum
GAN Xiu-hai1，LIANG Zhi-yuan1，JIANG Jin-zhong1，ZHOU Xin2，ZHAO Chao2
(1. School of Chemistry and Life Sciences，Guizhou Normal College，Guiyang 550018，China;2. Ｒesearch Center for Quality Control of
Natural Medicine，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China)
Abstract Objective:To establish an HPLC fingerprint and a quantitative determination method for determination of index compo-
nents of Pilea aquarum. Methods:The HPLC fingerprint of Pilea aquarum were determined on an Agilent Zorbax SB-C18 column(250
mm ×4. 6 mm，5 μm)，eluted with mobile phase containing of acetonitrile-0. 2% acetic acid in a gradient mode. The temperature of col-
umn was 30 ℃ ． The flow rate was 0. 8 mL /min and the detection wavelength was set at 330 nm. The chromatograms of 24 batches of
Pilea aquarum were compared by the software of Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese
Medicine(version 2004 A). The contents of luteoloside and cosmosiin were also determined simultaneously. Ｒesults:The HPLC finger-
print of Pilea aquarum had been established. There were ten common peaks，two chromatographic peaks of which were identified by ref-
erence substances. The samples of Pilea aquarum from different habitats can be distinguished from their fingerprints，the contents of
luteoloside and cosmosiin varied greatly. Conclusion:This method has desirable precision，stability，repeatability，and can be applied for
identification and quality control of Pilea aquarum.
Key words Pilea aquarum Dunn;HPLC fingerprint;Similarity;Hierarchical cluster analysis
冷水花为荨麻科冷水花属植物湿生冷水花
Pilea aquarum Dunn的全草，为贵州苗族常用药材品
种之一，全草入药，具有利湿、清热、退黄等功效，用
于治疗黄疸、肺结核等疾病〔1〕。冷水花属植物全球
约 600 余种，仅贵州省就有 28 种〔2〕。目前有关冷水
花的研究较少，质量控制方面仅有本课题组关于其
薄层指纹图谱鉴别的报道〔3〕。因此，在缺乏系统化
学成分研究的前提下，建立冷水花药材的高效液相
色谱指纹图谱方法是冷水花属植物分类的重要依
据，更是评价不同产地冷水花药材质量的有效手段。
本研究旨在建立贵州不同产地冷水花药材的 HPLC
指纹图谱，同时测定其指标成分的含量，以期更好地
控制冷水花药材的品质，为其药材的 GAP规范化种
植提供依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Aglient 1200 型高效液相色谱仪，包括
G1314B检测器、G1311A 四元泵、G1322A 在线真空
脱气装置、Aglient 化学工作站(美国安捷伦科技有
限公司);DZF-6020 型真空干燥箱(杭州蓝天化验仪
器厂);DFY-200 型高速万能粉碎机(温岭市林大机
械有限公司);AL204 型电子分析天平(梅特勒-托利
多有限公司);DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市
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泰斯特仪器有限公司)。
1. 2 试药 木犀草苷和大波斯菊苷对照品，本课
题组自制，质量分数均大于 99%(HPLC归一化法测
定);24 批冷水花药材样品采自贵州省境内(见表
1)，经贵州师范学院化学与生命科学学院朱富寿教
授鉴定为湿生冷水花 Pilea aquarum Dunn的全草。
乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析
纯。
表 1 冷水花药材样品来源
样品编号 产地 采集时间 样品编号 产地 采集时间
S1 贵州纳雍 2011. 10 S13 贵州赤水 2011. 09
S2 贵州正安 2011. 08 S14 贵州贵阳龙洞堡 2011. 10
S3 贵州大方 2011. 09 S15 贵州盘县红果 2011. 10
S4 贵州凯里 2011. 09 S16 贵州盘县城关 2011. 08
S5 贵州天柱 2011. 08 S17 贵州思南 2011. 09
S6 贵州贵阳白云 2011. 10 S18 贵州黔西 2011. 10
S7 贵州贵阳黔灵公园 2011. 10 S19 贵州贵定 2011. 10
S8 贵州赫章 2011. 08 S20 贵州玉屏 2011. 08
S9 贵州贵阳花溪 2011. 09 S21 贵州雷山 2011. 09
S10 贵州遵义 2011. 10 S22 贵州施秉 2011. 10
S11 贵州息烽 2011. 10 S23 贵州平坝 2011. 10
S12 贵州织金 2011. 08 S24 贵州仁怀 2011. 08
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)-0. 2%冰
醋酸(B)，梯度洗脱(0 ～ 15 min，8% ～ 11% A;15 ～
20 min，11% ～ 21% A;20 ～ 35 min，21% A;35 ～ 41
min，21% ～43% A;41 ～ 58 min，43% ～ 55% A;58 ～
62 min，55% ～ 90% A);柱温:30 ℃;流速:0. 8 mL /
min;检测波长:330 nm;进样量:20 μL。
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 对照品溶液的制备:分别精密称取干燥至
恒重的木犀草苷、大波斯菊苷对照品适量，置量瓶
中，加甲醇制成质量浓度分别为 70、35 μg /mL 的对
照品溶液，进样前经 0. 45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2. 2. 2 供试品溶液的制备:取冷水花药材粉末(过
20 目筛)1. 0 g，精密称定，置于 100 mL 具塞锥形瓶
中，精密加入 80%乙醇 30 mL，称重，于 80 ℃水浴回
流提取 2. 0 h，放冷，用乙醇补足减失的重量，滤过，
取续滤液，经 0. 45 μm 微孔滤膜过滤，作为供试品
溶液。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 精密度试验:在“2. 1”项色谱条件下，精密
吸取 S2 供试品溶液，连续进样 6 次，以大波斯菊苷
峰(6 号峰)为参照峰，考察各共有峰的相对保留时
间及相对峰面积的 ＲSD。结果相对保留时间的
ＲSD ＜0. 3%，相对峰面积的 ＲSD ＜ 2. 2%，符合指纹
图谱研究的要求。
2. 3. 2 稳定性试验:在“2. 1”项色谱条件下，精密
吸取 S2 供试品溶液，每 8 h测定 1 次，重复 6 次，结
果各共有峰相对保留时间的 ＲSD ＜0. 4%，相对峰面
积的 ＲSD ＜3. 2%，说明供试品溶液在 48 h内稳定。
2. 3. 3 重复性试验:按“2. 2. 2”项下方法同时制备
S2 样品的供试品溶液 6 份，按“2. 1”项下色谱条件
进行测定。结果各共有峰相对保留时间的 ＲSD ＜
1. 5%，相对峰面积的 ＲSD ＜3. 5%，说明方法重复性
好。
2. 4 指纹图谱的建立 分别取 S1 ～ S24 样品按
“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 1”项下色
谱条件分析，得到 24 批不同产地冷水花药材的
HPLC图(如图 1)。采用“中药色谱指纹图谱相似
度评价系统”(2004 A版)，以样品 S2 的色谱图为参
照图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成冷水花
药材指纹图谱共有模式 Ｒ，24 批样品有 10 个共有
峰(如图 2)，将所得样品图谱与共有模式图谱比较，
根据保留时间指认图谱中的 4 号峰为木犀草苷，保
留时间为 26. 96 min，6 号峰为大波斯菊苷，保留时
间为 31. 71 min。
2. 5 相似度评价分析 将共有模式的对照指纹图
谱及 24 批冷水花样品图谱导入“中药色谱指纹图
谱相似度评价系统”(2004 A 版)软件，采用相关系
数法对样品的相似度进行评价，各样品图谱(S1 ～
S24)相对于对照图谱的相似度结果见表 2。
由表 2 可知，除 S6、S7、S9、S12、S13 和 S20 外，
其他不同产地的冷水花药材的相似度均在 0. 9 以
上。
2. 6 聚类分析 利用 DPS2000 数据统计软件，以
24 批不同产地冷水花指纹图谱中获得的 10 个共有
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图 1 24 批冷水花药材 HPLC指纹图谱
图 2 混合对照品(A)及冷水花药材
共有模式(B)HPLC图
4. 木犀草苷 6. 大波斯菊苷
表 2 24 批冷水花药材相似度
样品编号 相似度 样品编号 相似度
S1 0. 983 S13 0. 875
S2 0. 970 S14 0. 986
S3 0. 979 S15 0. 974
S4 0. 945 S16 0. 974
S5 0. 923 S17 0. 972
S6 0. 463 S18 0. 975
S7 0. 807 S19 0. 963
S8 0. 982 S20 0. 823
S9 0. 410 S21 0. 969
S10 0. 959 S22 0. 968
S11 0. 980 S23 0. 956
S12 0. 434 S24 0. 963
峰面积为特征，通过平方根转换数据，采用欧氏距离
法，以最短距离作为测度对样品聚类，其聚类分析结
果如图 3。从树状图可以看出，24 批样品大体聚为
3 类，第一类包括样品 S1、S12、S15、S21、S4、S20、S3、
S18、S10、S6、S7、S13、S5、S11、S9、S14，第二类包括
样品S8、S16、S17、S19、S23、S24，第三类包括样品
图 3 24 批不同产地冷水花药材聚类分析结果
S2、S22。
2. 7 指标性成分含量测定
2. 7. 1 线性关系考察:分别精密量取“2. 2. 1”项下
的对照品溶液 1、2、5、10、25、50 μL，按“2. 1”项下色
谱条件进样，测定峰面积，以峰面积(Y)对进样量
(X)进行线性回归，得木犀草苷的回归方程为:Y1 =
2130. 7X1 － 7. 624，r = 0. 9999;大波斯菊苷的回归方
程为:Y2 = 2373. 7X2 + 20. 778，r = 0. 9999。结果表
明木犀草苷、大波斯菊苷分别在 0. 07 ～ 3. 50 μg、
0. 035 ～ 1. 75 μg 进样量范围内与峰面积呈良好的
线性关系。
2. 7. 2 精密度试验:分别精密吸取对照品溶液 20
μL，在“2. 1”项色谱条件下，连续进样 6 次，木犀草
苷、大波斯菊苷峰面积的 ＲSD分别为 1. 2%、1. 6%，
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表明仪器精密度良好。
2. 7. 3 稳定性试验:精密量取供试品溶液 20 μL，
在“2. 1”项色谱条件下分别于 0、2、4、8、12、24 h 进
行测定。结果木犀草苷、大波斯菊苷峰面积的 ＲSD
为 1. 1%、1. 3%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 7. 4 重复性试验:精密称取 S1 号样品 6 份，按
“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 1”项下色
谱条件测定。结果木犀草苷、大波斯菊苷含量的
ＲSD分别为 1. 6%、1. 8%，表明此方法重复性良好。
2. 7. 5 加样回收率试验:精密称取 S1 号样品 6
份，分别精密加入木犀草苷和大波斯菊苷对照品适
量，按“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 1”
项下色谱条件测定，结果木犀草苷平均加样回收率
为 96. 5%，ＲSD为 1. 3%;大波斯菊苷平均加样回收
率为 98. 2%，ＲSD为 0. 8%。
2. 7. 6 含量测定结果:将 24 批冷水花样品按
“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 1”项下色
谱条件测定，计算药材中木犀草苷和大波斯菊苷的
含量，具体结果见表 3。
表 3 24 批冷水花药材中木犀草苷和
大波斯菊苷的含量(%)
样品编号 木犀草苷 大波斯菊苷
S1 0. 060 0. 060
S2 0. 280 0. 164
S3 0. 044 0. 034
S4 0. 077 0. 026
S5 0. 109 0. 166
S6 0. 006 0. 005
S7 0. 021 0. 013
S8 0. 173 0. 128
S9 0. 008 0. 007
S10 0. 037 0. 034
S11 0. 118 0. 065
S12 0. 007 0. 001
S13 0. 196 0. 101
S14 0. 032 0. 021
S15 0. 149 0. 092
S16 0. 070 0. 040
S17 0. 205 0. 132
S18 0. 211 0. 144
S19 0. 045 0. 037
S20 0. 229 0. 112
S21 0. 019 0. 018
S22 0. 069 0. 072
S23 0. 294 0. 157
S24 0. 225 0. 108
由表 3 可知，不同产地的冷水花药材中两种成
分的含量差异较大，其中两种成分含量较低的有 S6
(贵州贵阳白云)、S9(贵州贵阳花溪)、S12(贵州织
金)3 个产地的药材，这与相似度计算结果相一致。
3 讨论与结论
从冷水花药材指纹图谱和相似度评价结果可
知，不同产地的冷水花药材具有差异性，其中贵州贵
阳白云、贵州贵阳花溪、贵州织金 3 个产地的冷水花
药材图谱与共有模式图谱比较相似度低于 0. 5，与
其他产地冷水花药材相比具有明显的差异，这主要
是因为这 3 个产地冷水花药材中 10 个特征指纹峰
的含量最低;贵州贵阳黔灵公园、贵州赤水和贵州玉
屏 3 个产地的冷水花药材图谱与共有模式图谱比较
相似度为 0. 8 ～ 0. 9，其余产地的冷水花药材的相似
度均在 0. 9 以上。由以上结果说明中药相似度评价
软件虽然能在一定程度上评价冷水花药材的质量品
质，但当样品中出现极值(极小值)的时候就会影响
到冷水花药材的相似度评价结果。
从聚类分析可知，24 批样品被聚为 3 类，其中
共有峰面积最小的为第一类，而最大的为第三类，第
二类样品的共有峰面积于第一类和第三类之间，这
与相似度分析结果基本一致，但也有一定的差异，结
合色谱图可看出相似度较低的贵州贵阳白云、贵州
贵阳花溪、贵州织金、贵州贵阳黔灵公园、贵州赤水
和贵州玉屏并没有全部被单独聚为一类，而是与其
他样品一起被聚为了第一类。由相似度分析、聚类
分析及含量测定结果说明，由于地理环境中光照、水
分、土壤等因素不同，冷水花中的化学成分及成分的
含量存在一定的差异。
本实验建立了 24 批不同产地冷水花药材的
HPLC-DAD指纹图谱，共标定出 10 个共有峰，并指
认了其中 2 个主要共有峰，均为黄酮苷。HPLC 指
纹图谱研究方法的建立为有效控制冷水花药材的质
量提供了一种有效手段，该方法精密度、重复性、稳
定性较好，可用于冷水花药材的质量综合评价，这为
冷水花进一步的质量标准研究提供了依据。
参 考 文 献
［1］邱德文，杜江 . 中华本草·苗药卷［M］．贵阳:贵州科技
出版社，2005.
［2］李永康 . 贵州植物志［M］．第四卷 . 贵阳:贵州科技出
版社，1988.
［3］甘秀海，梁志远，王婕 . 冷水花药材的薄层指纹图谱研
究［J］．贵州师范学院学报，2010，26(3):34-35.
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