全 文 ：DOI∶10． 13192 / j． issn． 1000-1719． 2016． 05． 048
葛根和粉葛高效液相色谱指纹图谱及化学模式识别
李生茂1，刘琳2，谭睿3，甄汉深4
(1. 川北医学院药学院，四川 南充 637000;2. 川北医学院附属医院内分泌科，四川 南充 637000;
3. 西南交通大学医学院，四川 成都 610031;4. 广西中医药大学，广西 南宁 530001)
摘 要:目的:建立并比较葛根和粉葛的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，为其质量控制提供依据。方法:采用
HPLC法，色谱柱为 Kromasil C18(4. 6 mm × 200 mm)，流动相为乙腈 － 0. 03 mol /L 醋酸铵溶液(梯度洗脱)，流速为 0. 9
mL /min，柱温为 40 ℃，检测波长为 250 nm，进样量为 20 μL。收集 16 批次的葛根和粉葛样品进行测定，采用《中药色谱
指纹图谱相似度评价系统 2004A版》软件进行相似度评价，采用聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行化学模式识别
研究。结果:16 批葛根和粉葛药材的指纹图谱有 6 个共有峰，经对照指认出葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素的色
谱峰。相似度分析结果显示葛根和粉葛的相似度较高，均在 0. 910 以上;聚类分析将葛根和粉葛样品分别归为两类;主
成分分析提取得到 8 个主成分，累计方差贡献率达到 93. 548%，前 3 个主成分得分投影结果与聚类分析基本一致。结
论:葛根和粉葛所含化学成分既有一定的相似性，也存在一定差异，该方法可作为葛根和粉葛的质量控制及临床应用的
依据。
关键词:葛根;粉葛;HPLC指纹图谱;聚类分析;主成分分析
中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1000-1719(2016)05-1034-04
HPLC Fingerprint and Chemical Pattern Ｒecognition of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii
LI Shengmao1，LIU Lin2，TAN Ｒui3，ZHEN Hanshen4
(1． School of Pharmacy，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China;2． Department of Endocrinology，
Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China;3． Southwest Jiao Tong University，
College of Medicine，Chengdu 610031，Sichuan，China;4． Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，Guangxi，China)
Abstract:Objective:To establish and compare HPLC fingerprints of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii． Methods:HPLC
was used to analyze16 batches of samples． The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted
of acetonitrile － 0． 03 mol /L ammonium acetate with gradient elution at the flow rate of 0． 9 mL /min． The detection wavelength
was 250 nm and column temperature was set at 40 ℃ ． The sample size was 20 μL． TCM fingerprint evaluation software (2004 edi-
tion)was used to evaluate the similarity of 16 batches of samples． Hierarchical cluster analysis (HCA)and principal component
analysis (PCA)were applied to chemical pattern recognition． Ｒesults:There were 6 common peaks of fingerprints of Pueraria lo-
bata and Pueraria thomsonii． Four components were identified as Puerarin，Daidzin，Daidzein and Genistein． The similarities of 16
batches of samples were proved to be higher than 0． 910． Sixteen batches of Pueraria lobata sample and Pueraria thomsonii ware
classified into two groups (Pueraria lobata sample and Pueraria thomsonii sample)based on HCA． Eight principal components
(PC)were observed via PCA and the values of 8 principal components accounted for 93． 548% of the total variance． The classifi-
cation result according to PCA was consistent with the HCA． Conclusion:The components of Pueraria lobata and Pueraria thomso-
nii are different． The method can be used for identification and quality evaluation of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii．
Keywords:Pueraria lobata;Pueraria thomsonii;HPLC fingerprint;HCA;PCA
收稿日期:2015 － 12 － 09
基金项目:2012 年四川省教育厅科研项目(12ZB216)
作者简介:李生茂(1981 －)，男，四川成都人，讲师，博士，研究方向:中
药药效物质基础及质量标准化研究。
通讯作者:谭睿，教授，博士，研究方向:中药、民族药及复方药效物质基
础及质量标准化研究，E － mail:93230430@ qq． com。
葛根和粉葛分别来源于豆科葛属植物野葛［Puer-
aria lobata (Willd. )ohwi］和甘葛藤(Pueraria thomso-
nii Benth. )的干燥根［1］，长期以来两者均作为葛根药
材使用［2 － 4］，具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止
泻，通经活络，解酒毒之功效［1］。现代研究显示，葛根
和粉葛均含有葛根素、大豆苷和大豆苷元等异黄酮类
活性成分，但由于基源的不同，两者所含化学成分及药
理作用存在一定差异［5 － 8］，《中华人民共和国药典》从
2005 年版开始也将葛根和粉葛分别单列。目前，有关
葛根和粉葛化学成分比较的研究大多采用紫外光谱
法［9 － 11］、红外光谱法［12］、薄层色谱法［13 － 14］、高效液相色
谱法［5 － 6，10 － 11，15 － 19］等对二者的总黄酮等大类成分或部
分活性成分的定性或定量的对比，未能更深入对葛根
和粉葛药材化学成分异同进行系统比较分析。因于
此，本实验采用高效液相色谱法建立葛根和粉葛的指
·4301· 辽宁中医杂志 2016 年第 43 卷第 5 期
纹图谱，并结合聚类分析和主成分分析对指纹图谱进
行模式识别，以期为进一步系统比较这二者化学成分
的异同，并为更为合理使用葛根药材提供一定的依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器
岛津 LC － 10A 高效液相色谱仪包括两个 LC －
10A泵、DGμ － 12A 在线脱气机、SPD － 10A 检测器、
SIL － 10A 自动进样器、CTO － 10A 柱温箱(日本岛
津);Sartoius BS110 电子分析天平(北京赛多利斯仪器
有限公司);KQ3200DB 型数控超声波清洗器(昆山市
超声仪器有限公司)。
1. 2 试药
实验所用葛根药材经西南交通大学生命科学与技
术学院宋良科副教授鉴定为豆科植物野葛［Pueraria
lobata(Willd．)Ohwi］或甘葛藤(Pueraria thomsonii
Benth. )的干燥根，药材来源详见表 1。葛根素、大豆
苷对照品(中国药品生物制品检定所)、大豆苷元对照
品(SHENZHZN TAVTO BIOTECH CO. ，LTD，CHINA)
以及染料木素对照品(成都曼斯特生物技术有限公
司)，纯度均大于 98%。乙腈为色谱纯，其余试剂为分
析纯，水为超纯水(自制)。
表 1 药材来源
样品 品种 来源 样品 品种 来源
s1 Pueraria lobata (Willd.)Ohwi 云南昆明 s9 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 四川平武
s2 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 广西南宁 s10 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 四川北川
s3 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 四川广元 s11 Pueraria thomsonii Benth. 广西南宁
s4 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 四川凉山 s12 Pueraria thomsonii Benth. 广西贺州
s5 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 四川简阳 s13 Pueraria thomsonii Benth. 云南昆明
s6 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 四川彭州 s14 Pueraria thomsonii Benth. 云南大理
s7 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 四川彭州 s15 Pueraria thomsonii Benth. 四川成都
s8 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 四川成都 s16 Pueraria thomsonii Benth. 四川成都
2 方法与结果
2. 1 色谱条件
色谱柱:Kromasil C18(4. 6 mm × 200 mm);流动
相:A为乙腈，B为 0. 03 mol /L 醋酸铵溶液，梯度洗脱
(0 ～ 25 min，10%A;25 ～ 60 min，10%→25% A;60 ～ 80
min，25%→40% A;80 ～ 90 min，40→58% A);流速:
0. 9 mL /min;柱温:40 ℃;检测波长:250 nm;进样量:
20 μL。
2. 2 溶液制备
2. 2. 1 混合对照品溶液制备 分别精密称取葛根素、
大豆苷、大豆苷元和染料木素对照品适量，置具塞容量
瓶中，加入 30%乙醇制成葛根素、大豆苷和大豆苷元
0. 2 mg /mL 以及染料木素 0. 16 mg /mL 的对照溶液，
摇匀，测定时适当稀释，即得。
2. 2. 2 供试品溶液制备 取葛根粉末(过四号筛)约
0. 1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入 30%乙醇 100
mL，称定重量，超声处理 30 min，放冷，再称定重量，分
别加入 30%乙醇补足减失的重量，摇匀，0. 45 μm 微
孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2. 3 参照峰的选择
精密吸取“2. 2”项下混合对照品溶液和供试品溶
液各 20 μL，按“2. 1”项下色谱条件进样测定，记录色
谱图。其中葛根素色谱峰的峰面积最大，且与相邻峰
分离良好，出峰位置适中。故选定葛根素的色谱峰为
指纹图谱参照峰 S。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 精密度实验 取同一供试品，按“2. 2”项下方
法制备供试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件连续进样 5
次，记录色谱图，以葛根素色谱峰的保留时间和峰面积
为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间、相对峰面
积及 ＲSD。结果表明各主要色谱峰的相对保留时间
和相对峰面积的 ＲSD 均小于 5%，表明仪器的精密度
良好。
2. 4. 2 稳定性实验 取同一供试品，按“2. 2”项下方
法制备供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、24 h 6 个时间
点按“2. 1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以葛根素
色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱
峰的相对保留时间、相对峰面积及 ＲSD。结果表明各
主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的 ＲSD 均
小于 5%，表明样品在 24 h内稳定。
2. 4. 3 重复性实验 取葛根药材粉末 5 份，精密称
定，按“2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 1”项下
色谱条件测定，记录色谱图，以葛根素峰色谱峰的保留
时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留
时间、相对峰面积及 ＲSD。结果表明各主要色谱峰的
相对保留时间和相对峰面积的 ＲSD 均小于 5%，表明
本方法的重复性良好。
2. 5 葛根和粉葛指纹图谱的建立及相似度评价
分别取 16 批葛根或粉葛药材粉末约 0. 1 g，精密
称定，按“2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 1”项
下色谱条件依次测定指纹图谱，记录 HPLC 色谱图。
将色谱数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱
相似度评价系统 2004A 版》软件进行分析。以 s1 药
材的图谱为参照，采用中位数法多点校正得到 16 批葛
根药材的对照指纹图谱，共有 6 个共有峰，并计算得到
16 批葛根药材的共有模式指纹图谱。经与对照品比
对，指认了其中葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素
在药材中的色谱峰，结果见插页Ⅲ图 1。
直观比较发现，葛根 HPLC 色谱图中的色谱峰在
24 min ～ 38 min、42 ～ 48 min和 78 ～ 80 min 3 个时间段
内较粉葛色 HPLC色谱图中相应位置的色谱峰数量或
峰面积分别增加，成分更为复杂。相似度计算结果显
示，16 批葛根药材 HPLC 指纹图谱相似度依次为:
0. 985、0. 976、0. 993、0. 959、0. 942、0. 990、0. 982、
0. 991、0. 934、0. 988、0. 975、0. 975、0. 919、0. 969、
0. 963 和 0. 973，均在 0. 910 以上，表明各批次葛根总
体相似度较好。
2. 6 模式识别研究
2. 6. 1 聚类分析 16 批葛根和粉葛 HPLC 色谱图色
谱峰面积数据导入 SPSS 13. 0 统计软件，采用中间数，
平方欧式距离进行聚类。结果显示，16 批样品聚为两
类，第一类为粉葛，包括 s11、s12、s13、s14 、s15 和 s16;
第二类为葛根包括 s1、s2、s3、s4 、s5、s6、s7、s8、s9 和
·5301·辽宁中医杂志 2016 年第 43 卷第 5 期
s10，结果见图 2。
2. 6. 2 主成分分析 以 16 批葛根和粉葛药材 HPLC
指纹图谱中色谱峰峰面积为变量，采用 SPSS 13. 0 软
件对其进行原始数据标准化处理及主成分分析，主成
分的提取原则为特征值大于 1。16 批葛根药材共提取
到 8 个主成分，8 个主成分累积贡献率达到 93. 548%，
可较好的代表 16 批葛根和粉葛药材 HPLC 图谱信息，
结果见表 2、表 3。
图 2 葛根和粉葛系统聚类分析结果
表 2 特征值与贡献率
PCA 特征值 贡献率(%) 累积贡献率(%)
1 11. 940 36. 183 36. 183
2 6. 017 18. 235 54. 418
3 3. 314 10. 043 64. 461
4 2. 668 8. 086 72. 547
5 2. 513 7. 616 80. 163
6 1. 886 5. 714 85. 877
7 1. 381 4. 185 90. 062
8 1. 150 3. 486 93. 548
表 3 葛根与粉葛样品的主成分得分
样品 PCA1 PCA2 PCA3 PCA4 PCA5 PCA6 PCA7 PCA8
s1 0. 174 0. 023 － 0. 086 － 0. 068 － 0. 011 0. 089 － 0. 011 0. 010
s2 0. 088 0. 021 0. 186 － 0. 044 0. 001 0. 023 － 0. 015 0. 008
s3 0. 168 － 0. 130 0. 007 0. 114 － 0. 044 － 0. 007 0. 041 0. 015
s4 0. 000 － 0. 015 － 0. 025 0. 029 0. 132 0. 013 － 0. 026 － 0. 007
s5 － 0. 028 0. 025 0. 024 － 0. 006 0. 027 0. 047 0. 071 － 0. 033
s6 － 0. 025 － 0. 015 0. 005 0. 036 0. 093 － 0. 020 － 0. 004 0. 006
s7 0. 030 － 0. 067 0. 004 － 0. 033 － 0. 018 － 0. 058 － 0. 052 － 0. 042
s8 0. 073 － 0. 065 － 0. 037 － 0. 104 0. 016 － 0. 075 0. 047 0. 029
s9 0. 148 0. 219 － 0. 022 0. 049 － 0. 018 － 0. 050 － 0. 009 － 0. 002
s10 0. 012 － 0. 078 － 0. 019 0. 017 － 0. 037 0. 030 － 0. 058 － 0. 032
s11 － 0. 116 0. 015 － 0. 007 0. 002 － 0. 022 0. 013 0. 048 － 0. 043
s12 － 0. 119 0. 000 0. 000 0. 016 － 0. 017 0. 023 － 0. 016 0. 094
s13 － 0. 088 0. 026 － 0. 009 0. 001 － 0. 029 0. 014 0. 000 － 0. 005
s14 － 0. 111 0. 012 － 0. 015 0. 003 － 0. 028 0. 006 － 0. 012 － 0. 003
s15 － 0. 095 0. 018 0. 002 － 0. 006 － 0. 021 － 0. 033 0. 005 0. 003
s16 － 0. 110 0. 011 － 0. 008 － 0. 005 － 0. 023 － 0. 017 － 0. 010 0. 001
以第 1、2、3 个主成分建立坐标系，进行投影得到 16 批
葛根和粉葛药材主成分得分 3 维图，从图 3 中可见，6
批粉葛样品在空间中比较集中，而 10 批葛根样品在空
间中较为分散，但大致可分为 2 类，其结果与聚类分析
结果较为相似。
图 3 葛根和粉葛主成分得分图
3 讨论
3. 1 供试品溶液的制备
葛根化学成分复杂，富含异黄酮类成分，分析难度
较大。为了较为全面的反映其化学信息，实验优化了
提取主要条件:提取溶剂(甲醇、乙醇、水以及不同浓
度的乙醇溶液)、提取方式(冷浸、超声和加热回流)及
提取时间(15 min、30 min 和 45 min)，最终选择用
30%乙醇超声 30 min。所用方法简便快捷，得到的色
谱图信息丰富。
3. 2 色谱条件考察
实验还重点考察了影响 HPLC分离效果的几个主
要因素:流动相(甲醇 － 水、乙腈 － 水和乙腈 － 0. 03
mol /L醋酸铵)、流速(0. 8 mL /min、0. 9 mL /min 和 1
mL /min)、柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃和 40 ℃)、检测波
长(205 nm、230 nm、250 nm、280 nm、300 nm)。最后
确定以柱温为 40 ℃，乙腈 － 0. 03 mol /L醋酸铵按 0. 9
mL /min流速梯度洗脱，检测波长为 250 nm时，色谱峰
数量多，主要色谱峰形好、分离度高。
3. 3 指纹图谱分析
实验建立葛根和粉葛 HPLC 指纹图谱，从 HPLC
色谱图直观分析来看，不同批次的葛根和粉葛 HPLC
色谱图存在一定相似性，均具有葛根素、大豆苷和大豆
苷元等主要活性成分色谱峰，同时也有一定的差异，葛
根在部分时间段内色谱峰数量明显较粉葛明显增多，
且 10 批葛根普遍存在染料木素的色谱峰，而 6 批粉葛
仅一批样品检测到该成分。
相似度计算结果显示，葛根和粉葛药材的 HPLC
指纹图谱相似度均较高，达 0. 910 以上，表明从指纹图
谱的相似度角度来看，葛根和粉葛内在化学成分存在
较好的共性。
进一步采用聚类分析和主成分分析的化学模式识
别方法对葛根和粉葛 HPLC色谱图的数据进一步挖掘
分析，发现葛根样品化学成分差异较大，其各自样品在
聚类分析树状图中距离较远，在 PCA投影图中投影点
较为分散，而粉葛样品化学成分较为一致，其各自样品
在聚类分析树状图中距离近，在 PCA投影图中投影点
也比较集中。但总体来看，两种分析方法判断结果较
为一致，均将16批样品分为两类(葛根和粉葛)，可较
·6301· 辽宁中医杂志 2016 年第 43 卷第 5 期
好地区分葛根和粉葛的样品。
实验结果表明，葛根的化学成分较粉葛更复杂，这
与陈珺等［18］研究结果相似，提示在临床使用中应注意
区别运用。通过指纹图谱相似度评价并结合聚类分
析、主成分分析两种化学模式识别方法，在一定程度上
反映葛根和粉葛内在化学成分的一致性和差异性，可
用于葛根、粉葛药材的质量控制。
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通讯作者:许枬(1968 －)，女，辽宁丹东人，教授，硕士研究生导师，博
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DOI∶10． 13192 / j． issn． 1000-1719． 2016． 05． 049
天雄的炮制与功用辨析
曹佳，许枬，张凡，林晓彤，张婷婷，陈俏
(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)
摘 要:天雄的炮制始于汉代，用热草木焖熟，剥去外皮及尖底，干燥。唐宋时期产生了醋腌、盐腌、童便渍等方法，
明清时炮制方法最多，除沿用各代方法外，还新产生了大豆煮等方法。诸多炮制方法之目的无外乎防腐、解毒及缓和药
性，其中“炮”法沿用最久。天雄、附子、乌头同源，性效有异，天雄善守，重于补下焦之阳，乌头性轻疏气雄烈，逐寒止痛之
力更强，附子走而不守，长于温化在脏腑之寒湿。通过天雄的文献资料剖析，为天雄的炮制方法传承及临床应用提供了
可靠的文献依据。
关键词:天雄;炮制;功效;临床应用
中图分类号:Ｒ283 文献标志码:A 文章编号:1000-1719(2016)05-1037-03
Discrimination on Processing and Application for Aconitum carmichneli
CAO Jia，XU Nan，ZHANG Fan，ZHANG Tingting，CHEN Qiao
(School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，Liaoning，China)
Abstract:In Han dynasty，Aconitum carmichneli (Tianxiong)was putting in unburned out ash of grass and wood until the
cortex of the medicine is broken，then the cortex and the root in bottom were stripped，which was called“Pao”in Chinese． From
that time to Qing dynasty，the processing method of Tianxiong is changed constantly，and the“Pao”is continuously used． The aims
for the processing all are anticorrosion，detoxification and ease of the drug． Tianxiong，monkshood and the rhizome of Chinese
monkshood are from same plant，but their function is different． Tianxiong is good for tonifying Yang． The chief function of rhizome
·7301·辽宁中医杂志 2016 年第 43 卷第 5 期
·Ⅲ·辽宁中医杂志 2016 年第 43 卷第 5 期