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不同产地松萝中多糖的分子量分布及活性研究



全 文 :西北林学院学报 2014,29(1):100~104
Journal of Northwest Forestry University
  doi:10.3969/j.issn.1001-7461.2014.01.20
 收稿日期:2013-05-02 修回日期:2013-06-17
 作者简介:孙长霞,女,实验师,博士,研究方向:食品分析与检测。E-mail:sxinghan@163.com
不同产地松萝中多糖的分子量分布及活性研究
孙长霞1,苏印泉2,张柏林3
(1.北京林业大学 理学院,北京100083;2.西北农林科技大学 林学院,陕西 杨陵712100;
3.北京林业大学 生物科学与技术学院,北京100083)
摘 要:对不同产地松萝中松萝多糖的理化性质、分子量分布及清除DPPH·的活性效果进行了比
较研究。结果表明,USP的各松萝纯化多糖的分子量均高于其他4种松萝的纯化多糖,各松萝纯
化多糖的分子量大多都在106 u以上。松萝粗多糖对DPPH·清除能力依次是:UMP>ULDP、
USP和USD>ULXP;对不同产地松萝粗多糖进行分离纯化,得到15种松萝纯化多糖,松萝纯化
多糖UMP-1,ULXP-1,USP-2,UDP-1清除DPPH·能力明显优于Vc,即松萝粗多糖与相对应的
纯化多糖对DPPH·清除能力之间没有必然的联系,这可能是由于抗氧化作用是一个协同作用的
结果。
关键词:松萝多糖;分子量分布;抗氧化;DPPH·
中图分类号:S718.521.2   文献标志码:A   文章编号:1001-7461(2014)01-0100-05
Studies on the Molecular Weight Distribution and Biological Activities of Polysaccharide
of Usneas from Different Locations
SUN Chang-xia1,SU Yin-quan2,ZHANG Bo-lin3
(1.Faculty of Science,Beijing Forestry University,Beijing100083,China;2.College of Forestry,Northwest A &F University,
Yangling,Shaanxi 712100,China;3.College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing100083,China)
Abstract:The molecular weight distribution of polysaccharides of Usneas from different locations and the
DPPH radical scavenging activities were studied.The results showed that the molecular weight(MW)of the
polysaccharide named USP was the highest among others.Generaly the MWs of al polysaccharide studied
were above 106 u.The DPPH·radical scavenging activity of the polysaccharides separated was in the order
of UMP>ULDP>USP>USD>ULXP,and further purified polysaccharides such as UMP-1,ULXP-1,
USP-2,and UDP-1demonstrated higher DPPH scavenging activity than Vc.No correlationships were found
between the raw polysaccharides and further purified ones on DPPH scavenging capability.
Key words:Usnea polysaccharide;molecular weight distribution;antioxidant;DPPH free radical
   松萝(Usnea)是子囊地衣纲、茶渍目、松萝科、
松萝属的一种地衣植物,主要生长于山地森林中,在
西藏,新疆,黑龙江等地均有分布[1-5]。松萝资源含
量很大,目前国内对松萝多糖进行的报道与研究的
文献很少。松萝具有清热解毒、止咳、化痰、消炎等
功效,研究表明松萝酸和地衣多糖是松萝的主要活
性成分。近年来,据国外文献报道,地衣多糖具有很
高的抗癌活性,而这种多糖的抗癌活性是通过提高
健康细胞的免疫能力,抑制癌细胞的病态增殖,从而
克服了一些抗癌药物对健康细胞的损伤副作用,即
所谓的“中间宿主免疫性”[1-5]。本研究对松萝多糖
的理化性质,松萝粗多糖和纯化多糖清除DPPH·
的能力进行了比较,希望可以为松萝的进一步开发
及利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
粗皮松萝(Usnea montis-fuji),于2005年8月
采自于陕西秦岭火地塘林场;长松萝(U.longissi-
ma),于2006年7月采自西藏色季拉山和黑龙江伊
春市带岭凉水林场;亚花松萝(U.subfloridana),于
2005年9月采自新疆阿勒泰喀纳斯国家级自然保
护区;环裂松萝(U.diffracta),于2006年7月采自
黑龙江伊春市带岭凉水林场。样品由西北植物所黎
斌教授鉴定为松萝科松萝属地衣植物,上述松萝样
品去除枯枝、叶梗、破损叶及其他地衣杂物后剪碎,
置于真空干燥箱中于50℃条件下干燥12h,放入封
口塑料袋中密封保存,保存于西北农林科技大学陕
西省经济植物资源开发利用重点实验室,备用。
1.2 试剂与仪器
UV-2000型紫外-可见分光光度计;SENOC R
系列旋转蒸发器;DK-98-型电热恒温水浴锅;DLSB-
5/20型低温冷却液循环泵;101-1型电热鼓风干燥
箱;ZK型恒温真空干燥箱,Hitachi 7000日本示差
折光检测器。试剂:氯仿,乙醇,正丁醇,无水葡萄
糖,苯酚,硫酸,牛血清蛋白(均为国产分析纯);DE-
AE-52纤维素(Pharmacia),Sephadex-G100(Phar-
macia),DPPH·(Sigma),透析袋(Solarbio)。
1.3 方法
1.3.1 提取及分离纯化  以长松萝(西藏,黑龙
江),粗皮松萝,亚花松萝和环裂松萝为研究对象,按
照下述方法进行提取、分离、纯化松萝,得到不同产
地各松萝的粗多糖和纯化多糖。
1.3.1.1 提取及分离方法  准确称取一定量的事
先处理好的粗皮松萝样品,氯仿索氏提取至无色以
进行脱脂处理。然后热水浸提脱脂液,抽滤,减压浓
缩,乙醇沉淀,乙醇和丙酮洗涤,真空干燥,得到松萝
粗多糖,备用。
按照苯酚-硫酸法[6]测定多糖含量,吸光度与多
糖含量(y)的方程为:y=0.009 882x-0.028,相关
系数为:R2=0.993 3。松萝多糖含量(mg·g-1)计
算公式如下:
多糖含量=
多糖浓度×体积×稀释倍数
样品质量
(1)
1.3.1.2 粗多糖纯化方法  粗多糖→脱蛋白→乙
醇沉淀→洗涤(无水乙醇、丙酮)→真空干燥→DE-
AE-52纤维素柱纯化→透析→Sephadex G-100柱
层析(纯度鉴定)→纯化多糖。
1.3.2 多糖纯度鉴定  本研究采用纸层析[7]和
Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱法[7]对纯化多糖的
纯度进行鉴定。
1.3.3 多糖分子量的测定 采用高效液相色谱法
对各松萝纯化多糖的分子量进行测定。
日本 Hitachi 7000(示差折光检测器),色谱柱:
PL gel MIXED-B(10μm,7.5×300mm I.D.Pol-
ymer Laboratories)。标准溶液:分别将分子量为
738u,122 00u,480 000u,380 000u的多糖分子量
测定标准品(cis-1,4-polyisoprene)与去离子水配制
成5.000mg·mL-1的标准溶液。柱温30℃,流速
为0.6mL·min-1,进样量20.000μL。将上述标
准溶液进样,由GPC专用软件SIC 480Ⅱ绘制标准
曲线,得 线 性 回 归 方 程,log Mw =10.185 07-
0.415 589 3tR,相关系数r=0.998 6,其中:Mw 为
重均相对分子质量,tR 为保留时间(min)。数据由
GPC专用软件进行处理即可直接得到各多糖级分
的重均相对分子质量(Mw)、数均相对分子质量
(Mn)及相对分子质量分布数值(D)。
1.3.5 松萝多糖的活性研究  测定参考 Manuel
Sandoval[8]等和L.P.Leong[9]等的方法,适当做了
一些调整。将DPPH·用无水乙醇配置成5×10-4
mol·L-1的溶液,冰箱保放。取适量的待测物配制
成不同浓度梯度,按照表1的方法进行操作,以抗坏
血酸做对照,反应体积为3.0mL,溶液摇均,室温下
静置20min,于517nm下测定各吸光度,每个试样
做3个平行,取平均值,按式(2)计算待测物对DP-
PH·的清除率。抗氧化剂清除DPPH·的能力用
IC50(半数抑制率浓度)值表示,IC50(mg·mL-1)的
计算采用DPS软件包进行处理。
清除率=(1-As-ArA0
)×100% (2)
表1 试验加样表
Table 1 Praparation of chemical reagents
吸光度 溶液组成
A0 1.5mLDPPH·溶液(乙醇配制)+1.5mL95%乙醇
As
1.5mL0.5mmol·L-1 DPPH·溶液(乙醇配制)+1.5
mL待测样品液(ULXCUA 经石油醚脱脂处理后,用
95%乙醇溶液配稀释至不同浓度梯度)
Ar 1.5mL95%的乙醇和1.5mL待测样品液
1.4 试验数据统计与分析
所有试验数据重复测定3次,所得结果为平均值
±标准差(SD)。试验结果利用DPS 11.5,SPSS和
MATLAB等数据分析和统计软件进行分析和处理。
2 结果与分析
2.1 松萝纯化多糖分子量
以长松萝(西藏,黑龙江),粗皮松萝,亚花松萝
和环裂松萝为研究对象,按照1.3.1进行试验,分别
得到粗皮松萝纯化多糖 UMP-1、UMP-2、UMP-3;
长松萝(黑龙江)纯化多糖 ULDP-1、ULDP-2、UL-
DP-3;环裂松萝纯化多糖 UDP-1、UDP-2、UDP-3;
长松萝(西藏)纯化多糖 ULXP-1、ULXP-2、ULXP-
101第1期 孙长霞 等:不同产地松萝中多糖的分子量分布及活性研究
3;亚花松萝纯化多糖 USP-1、USP-2、USP-3,然后
按照1.3.4进行试验,得到各松萝纯化多糖的分子
量(表2)。
表2 松萝纯化多糖的分子量分布
Table 2 Relative molecular weight distribution of purified
polysaccharides obtained fromUsneas
松萝名称 多糖名称 Mn/u  Mw/u  Mw/Mn
粗皮松萝 UMP-1  7.60×105  8.49×105  1.12
UMP-2  2.48×106  3.22×106  1.30
UMP-3  2.05×106  3.24×106  1.58
长松萝(黑龙江) ULDP-1  2.04×106  4.67×106  2.28
ULDP-2  5.22×105  3.23×106  6.20
ULDP-3  2.90×106  3.86×106  1.33
环裂松萝 UDP-1  1.32×106  2.96×106  2.25
UDP-2  2.22×106  3.68×106  1.66
UDP-3  2.12×106  3.36×106  1.58
长松萝(西藏) ULXP-1  4.45×106  5.76×106  1.29
ULXP-2  1.41×106  3.13×106  2.23
ULXP-3  2.66×106  3.50×106  1.32
亚花松萝 USP-1  3.24×106  3.48×106  1.07
USP-2  8.81×106  1.62×107  1.83
USP-3  2.48×106  3.41×106  1.38
注:u为分子量单位-道尔顿,Mn为数均分子量,Mw 为重均分子量,
Mw/Mn为分布系数。
从表2可以看出,各松萝纯化多糖的数均分子
量都在5.22×105 u~8.81×106 u之间有分布,
USP-2的数均分子量最高达8.81×106 u,ULDP-2
的数均分子量最小为5.22×105 u。从重均相对分
子质量上看,各松萝纯化多糖的重均分子量都在
8.49×105 u~1.62×107 u之间有分布,USP-2的
重均分子量最高达1.62×107 u,UMP-1的重均分
子量则最低为8.49×105 u。从Mw/Mn 上看,其大
多的分布系数都在1.07~6.20之间。从总的分子
量来看,USP的各松萝纯化多糖的分子量均高于其
他4种松萝的纯化多糖,各松萝纯化多糖的分子量
大多都在106 u以上。文献报道,地衣多糖是一类
线性聚合物,主要是β-D-葡萄糖通过1,3和1,4键
合构成的,相对分子质量为20 000~40 000[10-11],与
本试验结果有一定差异。出现这种现象的原因可能
是人为加工造成的多糖降解所致,因为不同植物、不
同提取方法都会造成植物多糖分子量相差很大。
2.2 松萝多糖活性
2.2.1 松萝粗多糖活性  以粗皮松萝、长松萝(黑
龙江,西藏)、亚花松萝、环裂松萝为研究对象,按照
1.3.1的方法进行提取,得到不同产地的松萝粗多
糖(UMP、ULDP、ULXP、USP、UDP),然后按照1.
3.5的方法进行试验,测定不同产地松萝粗多糖清
除DPPH·的能力(图1)。
图1 不同产地松萝粗多糖清除DPPH·的比较
Fig.1 Scavenging effects of extracted polysaccharides
from different Usneas on DPPH·free radicals
   由图1可以看出,各种松萝粗多糖均可以清除
DPPH·,在一定范围内随着浓度的升高,其对
DPPH·清除率逐渐增大,但与Vc相比较弱。几种
松萝粗多糖均是随着多糖质量浓度的增加,对DP-
PH·的清除作用增加。其中,对DPPH·清除作用
最强是UMCP(IC502.61mg·mL-1);其次是 UL-
DCP和USCP(IC504.12mg·mL-1和4.27mg·
mL-1);对 DPPH·清除作用最弱的是 ULXCP
(IC505.67mg·mL-1)。现有研究表明,在生物学
活性方面,多糖纯品与粗品是存在一定差异的,有的
研究表明多糖纯品的生物活性是低于粗品的,这可
能是由于在多糖分离纯化过程中,与多糖结合的活
性成分被去除,从而多糖的活性被降低了[12-13];而另
一些研究表明,多糖纯品的一些活性优于粗品,如中
央民族大学生命与环境科学学院的刘春兰[14]等人
对石崖茶中的多糖进行了研究,石崖茶多糖可以清
除羟基自由基和超氧自由基,且粗多糖的清除效果
比纯化后多糖差。舒媛[15]等对山药中的多糖进行
了研究,结果表明用Sevag法去除蛋白后得到的山
药多糖的抗氧化能力优于除蛋白前山药多糖的抗氧
化能力。
2.2.2 松萝纯化多糖活性  以长松萝(西藏,黑龙
江),粗皮松萝,亚花松萝和环裂松萝为研究对象,按
照1.3.1的方法纯化松萝粗多糖,得到各松萝纯化
多糖。本研究采用纸层析和凝胶色谱法对各纯化多
糖进行纯度鉴定,各松萝纯化多糖的纸层析结果均
为单一斑点,且凝胶色谱的洗脱曲线均为单一对称
峰,故可以认为各松萝纯化多糖均为相对均一的纯
多糖。然后按照1.3.5的方法对松萝纯化多糖的活
性进行试验(图2~图6)。
由图2~图6可知UMP-2,ULDP-2,ULDP-3,
201 西北林学院学报 29卷 
图2 UMP清除DPPH·的半抑制浓度
Fig.2 Scavenging effects of UMPs on DPPH·free-radicals
图3 ULDP清除DPPH·的半抑制浓度
Fig.3 Scavenging effects of ULCPs on DPPH·free-radicals
图4 USP清除DPPH·的半抑制浓度
Fig.4 Scavenging effects of USPs on DPPH·free-radicals
ULXP-2,USP-1,UDP-3对DPPH·的清除能力较
弱,半抑制浓度几乎全部达到200.00μg·mL
-1以
上;半抑制浓度在100.00~200.00μg·mL
-1之间
的松萝纯化多糖有 UMP-1,UMP-3,ULDP-1,UL-
XP-1,ULXP-3,UDP-2,USP-3;半 抑 制 浓 度 在
100.00μg·mL
-1以下的松萝纯化多糖有 USP-2,
UDP-1。由2.2.1可知,松萝粗多糖的半抑制浓度
均在3.00mg·mL-1以上,即松萝纯化多糖清除
DPPH·的能力优于松萝粗多糖。其中,松萝纯化
图5 ULXP清除DPPH·的半抑制浓度
Fig.5 Scavenging effects of ULXPs on DPPH·free-radicals
图6 UDP清除DPPH·的半抑制浓度
Fig.6 Scavenging effects of UDPs on DPPH·free-radicals
多糖中与Vc的清除DPPH·能力相似的有 UMP-
3,ULDP-1,USP-3,UDP-2;而清除DPPH·最好的
松萝纯化多糖有 UMP-1,ULXP-1,USP-2,UDP-1,
其清除DPPH·的能力明显优于Vc。同时可知,松
萝粗多糖清除DPPH·的能力较强,而从中分离纯
化的松萝纯化多糖清除DPPH·的能力不一定强,
如几种松萝粗多糖中 USCP和 UDCP清除DPPH
·的能力处于中间位置,而从中分离纯化的USP-2,
UDP-1清除DPPH·的能力却很强。从总的分子
量来看,USP的各松萝纯化多糖的分子量均高于其
他4种松萝的纯化多糖,各松萝纯化多糖的分子量
大多都在106 u以上。另一方面,植物多糖的抗氧
化能力与多糖的分子量大小有一定关系,普遍认为
分子量越大,其抗氧化能力越强;但也不完全是这
样,如对太白泡沙参等进行研究,发现相对分子量较
小的多糖却表现出很强的抗氧化能力,这一现象在
一般植物多糖中较为少见[16-17]。
3 结论与讨论
松萝是松萝科松萝属的一种地衣植物,具有清
热解毒、止咳、化痰、消炎等功效。研究表明,USP
301第1期 孙长霞 等:不同产地松萝中多糖的分子量分布及活性研究
的各松萝纯化多糖的分子量均高于其他4种松萝的
纯化多糖,各松萝纯化多糖的分子量大多都在106 u
以上。松萝粗多糖和松萝纯化多糖对DPPH·清除
能力依次是UMP>ULDP>USP>UDP>ULXP,
但均不如 Vc;松萝纯化多糖 UMP-1,ULXP-1,
USP-2,UDP-1清除DPPH·能力明显优于 Vc;因
此,粗多糖与相对应的纯化多糖对DPPH·清除能
力之间没有必然的联系,这可能是由于抗氧化作用
是一个协同作用的结果。
参考文献:
[1] ELIN S O,KRISTIN I.Polysaccharides from lichens:structur-
al characteristics and biological activity[J].Planta Medica,
2001,67(3):199-208.
[2] 靳菊情,石娟,葛萍,等.长松萝多糖对小鼠免疫功能的影响
[J].中国药学杂志,2003,38(6):431-433.
JIN J Q,SHI J,GE P,et al.Effects of Usnea longissima poly-
saccharide on immunologic function in mice[J].Chinese Phar-
maceutical Journal,2003,38(6):431-433.(in Chinese)
[3] TEIXEIRA A Z A,IACOMINI M,GORIN P A J.Chemotypes
of mannosecontaining polysaccharides of lichen mycobionts:a
possible aid in classification and identification[J].Carbohydrate
Research,1995:266(2):309-314.
[4] 常昕,杜双田,江微,等.博湖蘑菇多糖水提醇沉法提取工艺的
优化[J].西北林学院学报,2011,26(4):193-195.
CHANG X,DU S T,JIANG W,et al.Optimization of water
extraction and alcohol precipitate technology of polysaccharide
from Bohu Mushroom[J].Journal of Northwest Forestry Uni-
versity,2011,26(4):193-195.(in Chinese)
[5] 田庚元,冯宇澄,林颖.植物多糖的研究进展[J].中国中药杂
志,1995,7(20):441-444.
[6] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].杭州:浙江大学出版社,
1999:11-13.
[7] 丁长江.有机化学实验[M].北京:科学出版社,2006:377-396.
[8] SANDOVAL M,NATALY N O,FAUSTO M A,et al.An-
tioxidant activity of the cruciferous vegetable Maca(Lepidium
meyenii)[J].Food Chemistry,2002,79(2):207-213.
[9] LEONG L P,SHUI G.An invertigation of antioxidant capacity
of fruits in Singapore markets[J].Food Chemistry,2002,76
(1):69-75.
[10] 林源.松萝的研究现状[J].中国药业,2011,19(20):84-87.
[11] PAULSEN B S,ELIN S O,KRISTIN I.Chromatography
and electrophoresis in separation and characterization of poly-
saccharides from lichens[J].Journal of Chromatography A,
2002,967(1):163-171.
[12] 谢建华,谢明勇.青钱柳多糖提取工艺的研究[J].食品科学,
2007,10(28):188-191.
XIE J H,XIE M Y.Study on extraction technology of plysac-
charides from Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja[J].
Food Science,2007,10(28):188-191.(in Chinese)
[13] 李凤玲,何金环.植物多糖的结构与分离纯化技术研究进展
[J].中国农学通报,2008,10(24):276-280.
LI F L,HE J H.Research progress on plant polysaccharide
structure and its isolation and purification[J].Chinese Agri-
cultural Science Buletin,2008,10(24):276-280.(in Chinese)
[14] 刘春兰,杨霞,白冬梅,等.石崖茶水溶性多糖的提取及生物活
性研究[J].辽宁中医药大学学报,2010,6(12):10-13.
LIU C L,YANG X,BAI D M,et al.Study on the extraction
and biological activities of water soluble polysaccharide from
Adinandra nitride[J].Journal of Liaoning University of Tra-
ditional Chinese Medicine,2010,6(12):10-13.(in Chinese)
[15] 舒媛,刘安军,王丽霞.山药多糖结合蛋白质对抗氧化作用的
研究[J].食品研究与开发,2006,11(11):39-42.
SHU Y,LIU A J,WANG L X.The effects of protein-bound
polysaccharides from Chinese Yam on the antioxidant activi-
ties[J].Food Research and Development,2006,11(11):39-
42.(in Chinese)(in Chinese)
[16] 陈战国,赵朋飞,李鹏程.太白泡沙参中不同分子质量多糖的
分级及其抗氧化活性研究[J].陕西师范大学学报:自然科学
版,2010,38(6):45-49.
CHEN Z G,ZHAO P F,LI P C.Study on the rating separa-
tion and the antioxygenic actitity of polysaccharides with dif-
ferent molecular weight in A.potaninii Korsh[J].Journal of
Shaanxi Normal University:Natural Science Edition,2010,38
(6):45-49.(in Chinese)
[17] 张京芳,赵晓娟,史丽梅.柿多糖提取技术研究及其组成分析
[J].西北林学院学报,2005,20(4):137-139.
ZHANG J F,ZHAO X J,SHI L M.Extracting technology of
polysaccharides from persimmon and constituents analysis
[J].Journal of Northwest Forestry University,2005,20(4):
137-139.(in Chinese)
401 西北林学院学报 29卷