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六种蜜环菌固体培养基配方的筛选



全 文 :北方园艺2015(18):145~148 ·食用菌·
第一作者简介:刘太林(1983-),男,硕士,讲师,现主要从事药
用植物栽培育种与生物技术等研究工作。E-mail:huajizi83@
126.com. 
基金项目:天津天狮学院校内资助项目(K13005)。
收稿日期:2015-05-25
DOI:10.11937/bfyy.201518039
六种蜜环菌固体培养基配方的筛选
刘 太 林,李   黎,周 正 涛,黎   祥
(天津天狮学院 生物与食品工程学院,天津301700)
  摘 要:引种了6个蜜环菌菌种分别接种于8个不同配方的固体培养基中进行筛选试验。
从萌发时间、满皿时间、生长势、菌索干重等方面进行评价。结果表明:菌种AM7在培养基配方8
(马铃薯20g,木屑20g,麦麸20g,胡萝卜20g,蛋白胨5g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,琼脂10g,
KH2PO42g,MgSO41g,维生素B10mg,水1 000mL)上萌发时间最短,生长速度快,生长生物量
最大,与其它菌种和配方组合差异达显著或极显著水平,是最佳组合;菌种AM6和宁强A9菌种
在配方8培养基上生长生物量较高,与其它组合差异显著,也是较好的菌种。该研究筛选出的优
良品种和配方组合可以用于生产。
关键词:蜜环菌;菌种;固体培养基;筛选
中图分类号:S 646.9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2015)18-0145-04
  蜜环菌(Armi1laria melea)属担子菌亚门,层菌纲,
伞菌目,白蘑科,蜜环菌属(Amilaria(Fr.)Staude)的一
种药食两用真菌[1],又名蜜环蕈、青闪蕈等。其子实体
虽小但味道鲜美,富含多种营养素,菌丝、菌索在暗处会
发出荧光[2]且均可入药。蜜环菌与天麻和猪苓等名贵
中药材存在着特殊的共生关系[3],蜜环菌类似线绳的黑
色菌索侵入天麻块茎或猪苓等菌核后被消化利用,为天
麻或猪苓提供营养,供其生长所需[4-5]。
在自然界中,蜜环菌主要从富含枯枝落叶的土壤基
质中获取碳源、氮源、无机盐及维生素等营养物质。在
人工栽培培养基上不同的菌株表现出的生长特性差异
较明显[6-7],蜜环菌种类繁多,分布广泛[8],在中国用于天
麻、猪苓栽培伴生的蜜环菌种类报到较多[9-10]。蜜环菌
    
菌种的质量决定着二者的产量及品质。筛选优良的蜜
环菌菌株和培养基配方是生产高品质天麻的基础[11-12]。
该研究结合前人的研究基础,搜集国内几种主要蜜环菌
栽培菌种,采用不同的培养配方,以期筛选出质优菌种,
获得最佳培养配方。促进蜜环菌的扩大生产,进而为天
麻和猪苓等经济作物的人工栽培提供质优的菌株,提高
产量和产品品质。
1 材料与方法
1.1 试验材料
  供试6种蜜环菌菌株如表1所示。设有8个不同蜜
环菌培养基配方,如表2所示。仪器为高压灭菌锅,超
净工作台,电热恒温培养箱,组织捣碎匀浆机,电磁
炉等。
1.2 试验方法
1.2.1 固体培养基制备 将各个配方的马铃薯、胡萝
卜、麦麸、木屑、玉米粉按照比例称好,加入500mL左右
的去离子水,倒入组织搅拌匀浆机中匀浆15min,然后转
  
Abstract:Lycium barbarum L.was used as raw material,and spectrophotometry was used to determine content of
ammonium alkaloids in methanol extract of Lycium barbarum L.,based on the reaction of ammonium alkaloids with
Remecke salt.The aim was to establish a method for quantitative determination of ammonium alkaloids in methanol
extract of Lycium barbarumL.The results showed that the average recovery rate of filtrate and precipitation methods
was 97.57%and 98.06%,and relative standard deviation was 1.02%and 1.10%(n=6),respectively.Conclusion,the
results were consistent for determination of ammonium alkaloids by the two methods,and filtrate method was
comparatively simple.
Keywords:Lycium barbarum L.;ammonium alkaloids;Reinecke`s salt;spectrophotometry;filtrate method;precipitation
method 
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·食用菌· 北方园艺2015(18):145~148
移入电磁炉煮锅中大火煮沸,小火加热30min,加热过
程中及时搅拌。之后用3层纱布过滤,收集滤液,反复
冲洗残渣补足培养基为1 000mL,之后按照组分表加入
剩余的其它组分煮沸。倒入500mL三角烧瓶中,用胶
塞密封。高温、高压灭菌。最后置于超净工作台中倒入
事先灭菌的18mm×180mm的试管中,或直径12cm的
培养皿中,冷却凝固待用。
1.2.2 接种培养 将事先扩大培养的菌种在超净台下
定量接种到试管中或培养皿的中部,每水平接种重复
   
  表1 供试蜜环菌菌株来源
  Table 1 Selected source of Armillariastrains
编号Serial number 菌株Strain 来源Source
1 AM3 贵州遵义市
2 AM4 华中农业大学菌种中心
3 AM6 华中农业大学菌种中心
4 AM7 华中农业大学菌种中心
5 蜜A9 四川绵阳食用菌研究所
6 宁强A9 陕西省宁强县真菌研究所
    表2 蜜环菌固体培养基配方
  Table 2  Armillariasolid culture medium formulas
编号
Serial number
组分
Component
1 葡萄糖20g,琼脂10g,KH2PO42g,MgSO41g,维生素B110mg,木屑100g,水1 000mL
2 葡萄糖20g,琼脂10g,KH2PO42g,MgSO41g,维生素B110mg,麦麸100g,水1 000mL
3 葡萄糖20g,琼脂10g,KH2PO42g,MgSO41g,维生素B110mg,胡萝卜100g,水1 000mL
4 葡萄糖20g,琼脂10g,KH2PO42g,MgSO41g,维生素B110mg,玉米粉100g,水1 000mL
5 改良PDA:葡萄糖20g,琼脂10g,KH2PO42g,MgSO41g,维生素B110mg,马铃薯100g,水1 000mL
6 改良PDA+蛋白胨:葡萄糖20g,琼脂10g,KH2PO42g,MgSO41g,维生素B110mg,马铃薯100g,蛋白胨10g,水1 000mL
7 改良PDA+牛肉膏:葡萄糖20g,琼脂10g,KH2PO42g,MgSO41g,维生素B110mg,马铃薯100g,牛肉膏10g,水1 000mL
8 混合培养基:马铃薯20g,木屑20g,麦麸20g,胡萝卜20g,蛋白胨5g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,琼脂10g,KH2PO42g,MgSO41g,维生素B110mg,水1 000mL
3次。培养皿用封口膜封好,置于电热恒温培养箱中
25℃恒温培养。
1.3 项目测定
接种后每天观察蜜环菌的生长状况,记录每个处理
的萌发时间、满皿时间(满管时间)、生长情况,生长30d
后,将培养物转移到目筛中,用流水冲洗掉固态培养基,
纱布挤干水分,置于鼓风干燥箱中烘干,测量干重即为
蜜环菌生长生物量。
2 结果与分析
2.1 6种蜜环菌在不同配方培养基上的萌发时间差异
由表3可知,各个品种蜜环菌因培养基配方不同,
表现出萌发时间有较大差异,其中4号蜜环菌AM7在8
种培养基上的萌发时间均值较短,平均只有4.0d,其中
AM7在混合培养基中平均2.7d即开始萌发,与3号和
6号培养基萌发时间差异不显著,与其它4种培养基上
的萌发时间都达到了极显著差异水平。表明此菌种在
这种培养基中表现出高活力。6号菌种宁强A9在8种
培养基中的萌发时间平均值为4.5d,相对较短,在3种
附加牛肉膏或蛋白胨的培养基上萌发时间明显小于其
它几种,达到了显著差异水平(r<0.01),说明这个菌种
在含有蛋白胨和牛肉膏的培养基上表现出较高萌发活
力。6种蜜环菌中萌发时间较长的2号AM4,在不同培
养基中的平均萌发时间为7.8d,表明相对活力较弱。
其它3个菌种在8种不同培养基上的萌发时间差异不
明显,处于中间水平。
  表3  蜜环菌在不同培养基上的萌发时间
  Table 3 Germination time of Armillariaon diferent culture media  d
菌种
Strain
培养基 Medium
1  2  3  4  5  6  7  8
均值
Mean
1  5.7aA  4.7bAB  4.0bB  5.3abAB  5.0abAB  4.3bB  4.3bB  4.0bB  4.7
2  8.0abAB  7.3bAB  7.7abAB  7.7abAB  7.7abAB  8.3aA  8.7aA  6.7bB  7.8
3  7.0aA  7.0aA  6.0bA  6.3abA  6.7abA  6.3abA  6.3abA  5.7bA  6.4
4  4.7aAB  5.0aA  3.3bcB  4.7aAB  4.3abAB  3.3bcB  3.7bB  2.7cB  4.0
5  6.0bAB  5.7bB  6.0bAB  5.3bB  6.7aA  6.3aAB  6.3aAB  5.7bB  6.0
6  5.0aA  4.7aA  5.0aA  5.3aA  5.3aA  3.3bB  4.3aAB  3.3bB  4.5
均值 6.1  5.7  5.4  5.6  6.0  5.3  5.6  4.8
  注:表3是将数据均值进行Duncan多重比较。大写字母表示在0.01水平差异显著,小写字母表示在0.05水平差异显著。下表同。
2.2 蜜环菌AM7在不同培养基中生长速度差异
由表4可知,同一蜜环菌AM7在不同培养基上有
不同的生长速度,最短13.3d即可长满培养皿,最长得
将近1个月满皿。具体而言,蜜环菌在8号混合培养基
中的生长速度最快,平均为13.3d,多重比较分析表明与
所有其它各种培养基满皿时间都达到显著差异水平,且
与1~5号培养基数据达到极显著差异水平,表明蜜环
菌在这种培养基中具有最快的生长速度。其中在改良
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北方园艺2015(18):145~148 ·食用菌·
PDA附加牛肉膏或蛋白胨的培养基上生长速度相对也
较快,与其它培养基均达到极显著差异水平,表明蛋白
胨和牛肉膏更有利于为蜜环菌提供生长的营养素。由
表4分析得出,混合培养基和改良PDA附加牛肉膏或
蛋白胨的培养基比较适合作为蜜环菌的培养基。图1
为菌种在8种不同培养基上培养15d后的生长情况,图
中数字代表培养基编号。
表4 AM7菌种在不同培养基上的满皿时间
  Table 4 Dish ful time of AM7strain cultured on diferent media d
培养基
Medium
满皿时间Dish ful time
1  2  3
均值
Mean
1  28  27  28  27.7aA
4  27  27  27  27.0aA
3  23  23  24  23.3bB
5  19  20  22  20.3cBC
2  19  20  20  19.6cC
7  15  16  15  15.3dD
6  15  14  14  14.3deD
8  13  13  14  13.3eD
2.3 蜜环菌菌种在不同培养基上的生长情况评价
由表5可知,不同蜜环菌品种在不同培养基上生长
情况差异较大。就蜜环菌品种而言,4号AM7和6号宁
强A9在各种培养基上生长情况均最佳;从培养基来看,
3、6、7、8号培养基上的蜜环菌生长情况较好。具体而言
  
图1 蜜环菌在不同培养基上生长速度
Fig.1 Growth speed of Armillariaon diferent media
AM7在混合培养基上生长情况最好,菌索粗度及密度较
大,边缘比较整齐。在胡萝卜(3号)和附加蛋白胨(6号)
和牛肉膏(7号)的培养基上也表现较好。宁强A9在1、
3、6、7、8培养基上生长情况接近,表现也较好。其中在
含有木屑的1号培养基上表现出与其它菌种截然不同
的较好长势,可见能够很好的利用木屑培养菌种。
  表5  蜜环菌在不同培养基上的生长情况
  Table 5 Comprehensive evaluation of Armillariagrowth on diferent culture media
菌种
Strain
培养基 Medium
1  2  3  4  5  6  7  8
1 ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
2 ++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ +++
3 ++ ++ +++ ++ + +++ +++ +++
4 +++ +++ ++++ +++ ++ ++++ ++++ +++++
5 ++ ++ +++ + ++ +++ +++ +++
6 ++++ +++ ++++ ++ +++ ++++ ++++ ++++
  注:6个不同菌种在培养基上的生长情况主要考察指标有菌索的生长势、菌索粗度、密度、边缘整齐度和老化状况等综合评价。用“+”表示正向指标,“+”越多表示生长情
况越好。
2.4 蜜环菌在不同培养基中的生长生物量
由表6可知,AM7在各种培养基中的平均生长量
最高为0.355 3g;AM6次之为0.347 0g,宁强A9菌种
的平均生长量处于第3位,为0.335 4g。通过多重比较
得出AM7菌种在8号混合培养基和3号添加胡萝卜的
培养基上生长量较大,与其它培养基上的生物量都达到
了极显著差异水平,表明这2种培养基较适合培养
AM7。AM6菌种在各种培养基上的生长量差异较明
显,在改良PDA上生物量最低,且与其它组均达到极显
著差异水平,在混合培养基和添加胡萝卜的培养基上也
表现出较好的生长量。宁强A9在混合培养基上生物量
与在其它培养基上的生物量也都达到了极显著差异水
平,可见混合培养基比较适合培养宁强A9。不同培养
基上的生物量均值也差异较大,在8号混合培养基上生
图2 蜜环菌培养30d的生长状况
Fig.2 Growth of Armillariacultured for 30days
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  表6 蜜环菌在不同培养基中的生物量
  Table 6  Armillariabiomass on diferent media  g
菌种
Strain
培养基 Medium
1  2  3  4  5  6  7  8
均值
Mean
1  0.245 1bAB  0.236 2cB  0.252 3aA  0.244 3bB  0.238 8bcB  0.245 0bAB  0.246 1abA  0.252 2aA  0.245 0
2  0.302 4cC  0.298 3cC  0.334 2bB  0.289 0dD  0.299 1cC  0.341 3bB  0.348 1bB  0.381 1aA  0.324 2
3  0.352 3bB  0.334 5cC  0.374 5aA  0.342 1cBC  0.300 3dD  0.350 1bcB  0.350 4bB  0.372 1aA  0.347 0
4  0.372 7bB  0.302 4eD  0.400 2aA  0.334 5dC  0.308 0eD  0.354 0cC  0.363 5bcBC  0.407 4aA  0.355 3
5  0.321 7cC  0.341 3aA  0.347 1aA  0.289 1dD  0.298 1dD  0.334 3bB  0.324 1cC  0.338 1abAB  0.324 2
6  0.343 2bB  0.299 8cC  0.336 8bB  0.335 6bB  0.304 0cC  0.339 0bB  0.342 4bB  0.382 3aA  0.335 4
均值 0.322 9  0.302 1  0.340 9  0.305 8  0.291 4  0.327 3  0.329 1  0.355 5
物量平均值最高为0.355 5g,在3号培养基上次之为
0.340 9g。通过综合分析,AM7在8号和3号培养基表
现出极好的生长状态,生物量处于前2位;宁强A9在8
号混合培养基生长量也较高,AM6菌种在3号和8号培
养基上的生长量也比较好。可以考虑作为合适的培养
基配方和菌种搭配的组合。
3 结论与讨论
每个蜜环菌菌种均有适合的培养基,AM7在8号
混合培养基上萌发时间最短,生长速度快,生长量多,
是最佳的组合;其次宁强A9菌种相对活力也较好,生
长势较好,适合在混合培养基上培养;AM6在3号和8
号培养基上生长量较好,也可以作为选择方案。只是,
从菌种活力方面,表现出萌发时间慢,长势一般。培养
基中添加蛋白胨和牛肉膏蜜环菌菌索的粗度、密度及
顶端整齐度都有正效应,可以改善生长情况,减缓老
化。该研究重点考察蜜环菌的培养基配方的筛选,在
数据分析时主要以培养基配方为单因素进行分析,在
后续试验中将进行蜜环菌及配方、培养条件等多因素
组合进行研究,进一步筛选不同菌种不同的培养
条件。
参考文献
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Selection of Solid Media Formulations for Six Armilaria melea
LIU Tailin,LI Li,ZHOU Zhengtao,LI Xiang
(Bioengineering and Food Engineering Colege,Tianjin Tianshi Colege,Tianjin 301700)
Abstract:Six Armilaria meleastrains were introduced to culture in eight diferent solid media for selection.The time of
germination and overgrow of utensil,the growth potential and the shoestring dry weight were evaluated.The results
showed that the best combination was the AM7strain cultured in medium 8(potato 20g,sawdust 20g,wheat bran 20g,
carrot 20g,peptone 5g,beef extract 5g,glucose 20g,agar 10g,KH2PO42g,MgSO41g,vitamin B10mg,ddH2O
1 000mL),which had the shortest germination,fast growth,the largest growth biomass.There was a significant or
extremely significant diference with other combinations.The bacteria strains AM6and Ning Qiang A9in the formula
8medium had a significant diference with other combinations,which were also good strains.The good species and
formula combination selected by this study can be used for production.
Keywords:Armilaria melea;strain;solid medium;selection
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