全 文 ：第３８卷　第１１期
２０１０年１１月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．３８ Ｎｏ．１１
Ｎｏｖ．２０１０
异叶败酱多糖的体内抗肿瘤活性研究＊?
耿果霞ａ，陆文总ｂ，李青旺ｂ，李文烨ｂ
（西北农林科技大学ａ动物医学院，ｂ动物科技学院，陕西 杨凌７１２１００）
［摘　要］　 【目的】研究异叶败酱多糖抑制Ｕ１４宫颈癌实体瘤小鼠肿瘤生长的作用机制。【方法】建立小鼠宫
颈癌（Ｕ１４）实体瘤模型，以灌胃生理盐水和皮下注射环磷酰胺（２５ｍｇ／ｋｇ）分别作为阴性和阳性对照，观察异叶败酱多
糖不同剂量（３０，６０，９０ｍｇ／ｋｇ）灌胃给药１４ｄ后，对小鼠肿瘤生长抑制作用的影响；检测异叶败酱多糖对荷瘤小鼠血
清乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）和碱性磷酸酶（ＡＫＰ）活性的影响；用原位末端标记（ＴＵＮＥＬ）法检测肿瘤细胞的凋亡情况；利用
免疫组织化学法分析与细胞凋亡密切相关蛋白（突变型ｐ５３、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ）的表达情况。【结果】与阴性对照组相比，异
叶败酱多糖中、高剂量组瘤质量显著下降，荷瘤小鼠血清ＬＤＨ活性显著降低，Ｂａｘ蛋白表达量显著升高，突变型ｐ５３
和Ｂｃｌ－２蛋白表达量显著下降（Ｐ＜０．０５）；异叶败酱多糖各组肿瘤组织的细胞凋亡数较阴性对照组均显著提高（Ｐ＜
０．０５），荷瘤小鼠血清ＡＫＰ活性有所升高，但与阴性对照差异不显著（Ｐ＞０．０５）。与阳性对照组相比，异叶败酱多糖
中、高剂量组抗Ｕ１４宫颈癌效果接近于临床化疗药环磷酰胺。【结论】异叶败酱多糖具有抑制实体瘤 Ｕ１４生长的作
用，揭示该多糖可能通过调节细胞凋亡相关基因的表达，进而促进肿瘤细胞的凋亡而发挥其抗肿瘤作用。
［关键词］　抗肿瘤活性；异叶败酱多糖；细胞凋亡；宫颈癌小鼠
［中图分类号］　Ｒ２８５．５；Ｒ７３０．５２ ［文献标识码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１０）１１－００１４－０５
Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ
Ｐａｔｒｉｎｉａ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｌａ　Ｂｕｎｇｅ
ＧＥＮＧ　Ｇｕｏ－ｘｉａａ，ＬＵ　Ｗｅｎ－ｚｏｎｇｂ，ＬＩ　Ｑｉｎｇ－ｗａｎｇｂ，ＬＩ　Ｗｅｎ－ｙｅｂ
（ａ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｂ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｃｉｎｅ，
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆ　ｏｕｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｗａｓ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｐａｔｒｉｎｉａ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ
Ｂｕｎｇｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＰＨＢ－Ｐ）ｏｎ　Ｕ１４－ｂｅａｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｗａｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ
ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　Ｕ１４－ｂｅａｒｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｍｉｃｅ．Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｓａｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｇｉｖｅｎ　ｗｉｔｈ　ｃｙｃｌｏｐｈｏｓ－
ｐｈａｍｉｄｅ　２５ｍｇ／ｋｇ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＰＨＢ－Ｐ（３０，６０，９０ｍｇ／ｋｇ）ｆｏｒ
１４ｄａｙｓ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ＴＵＮＥＬ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｓｓａｙｓ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ＬＤＨ　ａｎｄ
ＡＫＰ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｋｉｔｓ．Ｉｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｐ５３，Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂａｘ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ＰＨＢ－Ｐ（６０，９０ｍｇ／ｋｇ），ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０５）；ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＨＢ－Ｐ（６０，９０ｍｇ／ｋｇ）ｇｒｏｕｐｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜
０．０５）；ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｕｍｏｒ　ｂｅａｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｓｅｒｕｍ　ＬＤＨ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ
ＰＨＢ－Ｐ（６０，９０ｍｇ／ｋｇ）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）；Ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ　ｏｆ　ＰＨＢ－Ｐ（３０，６０，９０ｍｇ／ｋｇ），ｓｅｒ－
＊ ［收稿日期］　２０１０－０７－０８
［基金项目］　河北省秦皇岛科技局转基因动物生产基因工程药物研究项目（Ｄ０８）
［作者简介］　耿果霞（１９６１－），女，陕西杨凌人，高级实验师，硕士，主要从事临床兽医学和抗癌药物研究。
［通信作者］　李青旺（１９５６－），男，陕西米脂人，教授，博士，博士生导师，主要从事动物生殖生理调控与生物技术研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｑｉｎｇｗａｎｇｙｓｕ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2010.11.033
ｕｍ　ＡＫＰ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
（Ｐ＞０．０５）；Ｂａｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜
０．０５），ｍｕｔａｎｔ　ｐ５３ａｎｄ　Ｂｃｌ－２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＰＨＢ－Ｐ（６０，９０ｍｇ／ｋｇ）ｇｒｏｕｐ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｅｇａ－
ｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＨＢ－Ｐ（６０，９０ｍｇ／ｋｇ）ｗａｓ　ｃｌｏｓｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｇｅｎｔ　ｃｙｃｌｏ－
ｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｏｕｒ　ｄａｔａ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＰＨＢ－Ｐ　ｍｉｇｈｔ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ
ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｐａｔｒｉｎｉａ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｌｌａ　Ｂｕｎｇｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｕｔｅｒｉｎｅ　ｃｅｒ－
ｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｍｉｃｅ
　　肿瘤是危害人体健康的重要疾病。随着人口老
龄化的加快，肿瘤的发病率也呈逐年上升趋势，因
此，寻找有效、安全的药物仍然是肿瘤治疗工作的重
要课题。目前，许多化学药物以诱导肿瘤细胞凋亡
为靶点而发挥作用［１］，但同时也存在损伤机体等副
作用，因此利用天然产物诱导肿瘤细胞凋亡的研究
成为人们关注的焦点。在过去的几十年中，人们已
经从蘑菇、海藻、苔藓等植物中分离出了多种多糖，
这些多糖均显示出强大的抗肿瘤活性和免疫调节活
性［２］。由于天然性多糖来源广、细胞毒性较低、毒副
作用小，因此对植物多糖抗肿瘤活性的研究是医药
界的热门领域。
异叶败酱（Ｐａｔｒｉｎｉａ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ　Ｂｕｎｇｅ）是我
国传统的中草药，主要分布于陕西、河南、河北和山
西等地。其根及全草均可入药，具有清热解毒、消肿
排脓和祛瘀止痛的功效，临床上广泛用于急性阑尾
炎初起、无名肿痛、宫颈糜烂、癌症等疾病的治疗。
研究表明，异叶败酱主要含有黄酮醇、齐墩果酸、异
香豆素糖苷、多糖和挥发性油［３－６］，其活性成分在体
外能抗人宫颈癌 ＨｅＬａ细胞生长［５］，在体内能抑制
大肠癌 ＨＴ－２９实体瘤生长［７］，具有较好的抗肿瘤活
性［８］。但是，有关异叶败酱多糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｏｆ
Ｐ．ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ　Ｂｕｎｇｅ，ＰＨＢ－Ｐ）在体内抗肿瘤的研
究，国内外目前尚未见报道。本试验通过建立小鼠
Ｕ１４宫颈癌实体瘤模型，研究异叶败酱多糖在体内
对实体瘤细胞生长的抑制作用及其诱导肿瘤细胞凋
亡的功能，同时分析了与肿瘤细胞凋亡密切相关基
因的表达情况，试图阐明异叶败酱多糖抗肿瘤作用
的机制，以期为异叶败酱多糖抗肿瘤药物的临床应
用提供理论和实践基础。
１　材料与方法
１．１　材　料
１．１．１　药品和试剂　环磷酰胺（ＣＴＸ）购于江苏恒
瑞医药股份有限公司，ＤＥＡＥ－纤维素、苏木精、伊红
购于美国Ｓｉｇｍａ公司，兔抗鼠单克隆抗突变型ｐ５３、
Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ购于美国Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司，脱氧核苷酸
末端转移酶介导ｄＵＴＰ缺口末端标记法（ＴＵＮＥＬ）
试剂盒购于美国Ｒｏｃｈｅ公司，ＳＰ免疫组化检测试剂
盒购 于 北 京 中 杉 金 桥 试 剂 公 司，乳 酸 脱 氢 酶
（ＬＤＨ）、碱性磷酸酶（ＡＫＰ）试剂盒购于南京建成生
物工程研究所，其他试剂均为分析纯。
１．１．２　异叶败酱多糖的提取　将异叶败酱全草
（５００ｇ）经氯仿－甲醇（体积比２∶１）混合液脱脂、脱
色后，蒸馏水回流（１ｈ／次）３次，合并回流液过滤，
滤液减压浓缩，用体积分数９５％乙醇沉淀，离心收
集沉淀物，Ｓａｖａｇ法去除蛋白，冷冻干燥即得异叶败
酱粗多糖。将异叶败酱粗多糖溶于蒸馏水进行ＤＥ－
ＡＥ－纤维素层析柱处理，收集洗脱液进行透析，冷冻
干燥后得精制异叶败酱多糖（７．５ｇ）。
１．１．３　细胞株和试验动物　宫颈癌细胞株（Ｕ１４）
购于中国医学科学院。清洁级昆明种雌性小鼠（６～
８周龄，（２０±２）ｇ）购于协和医科大学实验动物中
心，试验期间自由采食饮水。
１．２　方　法
１．２．１　接种、分组和给药　小鼠腹腔注射 Ｕ１４细
胞后７～９ｄ，用１ｍＬ一次性无菌注射器吸取处于
最佳生长状态的Ｕ１４腹水瘤（乳白色）传代细胞，调
整细胞密度至１×１０７／ｍＬ，按０．２ｍＬ／只接种于试
验小鼠左前肢腋下。接种后第２天将动物随机分为
５组，每组１０只，包括阴性对照组（灌胃生理盐水）、
阳性对照组（皮下注射环磷酰胺２５ｍｇ／ｋｇ）及异叶
败酱多糖高剂量组（灌胃９０ｍｇ／ｋｇ）、中剂量组（灌
胃６０ｍｇ／ｋｇ）、低剂量组（灌胃３０ｍｇ／ｋｇ），每天给
药１次，持续１４ｄ。
１．２．２　肿瘤抑制率的测定　停药次日脱颈处死小
鼠，剖取瘤块称质量并保存留作其他试验，按下式计
算肿瘤抑制率。
５１第１１期 耿果霞，等：异叶败酱多糖的体内抗肿瘤活性研究
肿瘤抑制率＝（１－给药组平均瘤质量／阴性对
照组平均瘤质量）×１００％。
１．２．３　肿瘤组织细胞凋亡的检测　根据ＴＵＮＥＬ
试剂盒的操作说明，进行肿瘤组织石蜡切片样品的
细胞凋亡检测。主要步骤如下：５７℃熔蜡５ｍｉｎ→
二甲苯和梯度乙醇脱蜡→蛋白酶 Ｋ 室温处理１５
ｍｉｎ→Ｈ２Ｏ２ 室温封闭５ｍｉｎ→加入标记反应混合物
３７℃孵育１ｈ→加入终止缓冲液终止反应→加入
Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ－ＰＯＤ试剂３７℃孵育１ｈ→加入３，３′－二
氨基联苯胺（ＤＡＢ）底物于２５℃作用１０ｍｉｎ→亚甲
基绿衬染，样品切片后在光学显微镜下观察。细胞
核呈棕褐色的视为阳性细胞，细胞核呈绿色的视为
阴性细胞，随机选择１０个视野，计数凋亡细胞数和
总细胞数，计算凋亡细胞数占总细胞数的百分率。
１．２．４　血清ＬＤＨ和 ＡＫＰ的测定　停药次日，各
组小鼠自眼眶取血；血样于４℃ 静置２ｈ，３　０００
ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集血清；根据ＬＤＨ、ＡＫＰ试
剂盒说明书测定各组血清中ＬＤＨ和ＡＫＰ的活性。
１．２．５　肿瘤组织突变型ｐ５３、Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ蛋白的
表达　应用免疫组织化学法分析各组肿瘤组织中突
变型ｐ５３、Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ蛋白的表达情况。操作流程
为：肿瘤组织石蜡切片样品经二甲苯、梯度酒精脱蜡
水化→抗原修复１５ｍｉｎ→体积分数３％ Ｈ２Ｏ２ 去离
子水孵育１０ｍｉｎ，去除内源性过氧化物酶活性→山
羊血清封闭１５ｍｉｎ→单克隆抗体突变型 ｐ５３（或
Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ）３７℃孵育３ｈ→生物素标记的二抗室温
下孵育１５ｍｉｎ→辣根酶标记链霉卵白素工作液室
温下孵育１５ｍｉｎ→ＤＡＢ显色液显色５ｍｉｎ→苏木精
复染１５ｍｉｎ→分化液分化５ｓ→梯度酒精脱水后加
拿大树脂封片。试验采用ＰＢＳ代替一抗作为阴性
对照，显色结果在显微镜下观察。细胞核（或膜）呈
褐色的视为阳性细胞，现蓝色的视为阴性细胞。计
数每个视野中阳性细胞数和总细胞数，计算１０个随
机视野中的阳性细胞率。
１．２．６　统计分析　试验数据以“平均值±标准差”
表示，利用Ｏｒｉｇｉｎ７．５统计软件进行分析，组间差异
显著性采用ｔ检验进行判定（Ｐ＜０．０５，表示统计学
差异显著）。
２　结果与分析
２．１　异叶败酱多糖对小鼠体内 Ｕ１４实体瘤的抑制
作用
表１结果表明，异叶败酱多糖低剂量组瘤质量
与阳性对照组差异极显著（Ｐ＜０．０１），与阴性对照
组差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明低剂量异叶败酱多
糖对荷瘤小鼠瘤质量影响不明显，而且作用效果远
差于临床化疗药ＣＴＸ。异叶败酱多糖中、高剂量组
瘤质量与阳性对照组差异不显著（Ｐ＞０．０５），与阴
性对照组差异显著（Ｐ＜０．０５），说明中、高剂量异叶
败酱多糖对瘤质量的影响接近于临床化疗药ＣＴＸ。
异叶败酱多糖低、中、高剂量组的肿瘤抑制率分别为
４．０７％，３１．３０％和４２．６８％，说明中、高剂量异叶败
酱多糖在小鼠体内具有显著的抗肿瘤效果，且存在
剂量依赖关系。
表１　异叶败酱多糖体内对小鼠肿瘤生长抑制的影响
Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＨＢ－Ｐ　ｏｎ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ
处理组
Ｇｒｏｕｐ
瘤质量／ｇ
Ｔｕｍｏｒ　ｗｅｉｇｈｔ
肿瘤抑制率／％
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ
阴性对照组Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　 ２．４６±０．１７ －
阳性对照组ＣＴＸ　 １．１３±０．１９＊＊ ５４．０６
异叶败酱多糖低
剂量组ＰＨＢ－Ｐ－ＬＤ ２．３６±０．２７　 ４．０７
异叶败酱多糖中剂
量组ＰＨＢ－Ｐ－ＭＤ １．６９±０．２５
＊ ３１．３０
异叶败酱多糖高剂
量组ＰＨＢ－Ｐ－ＨＤ １．４１±０．２９
＊ ４２．６８
　　注：与阴性对照组比较，＊表示Ｐ＜０．０５，＊＊表示Ｐ＜０．０１。
下表同。
Ｎｏｔｅ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，＊ｓｔａｎｄｓ　ｆｏｒ　Ｐ＜０．０５，
＊＊ｓｔａｎｄｓ　ｆｏｒ　Ｐ＜０．０１．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　ｂｅｌｏｗ．
２．２　异叶败酱多糖对荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响
由表２可见，与阴性对照组相比，异叶败酱多
糖各处理组显著提高了肿瘤组织的细胞凋亡率
（Ｐ＜０．０５）。阴性对照组肿瘤细胞自发凋亡率仅有
４．１５％，异叶败酱多糖低、中、高剂量组的肿瘤细胞
凋亡率则分别提高到８．２３％，１８．９６％和２０．８５％，
阳性对照组细胞凋亡率为２７．０３％。这说明异叶败
酱多糖可以在体内诱导Ｕ１４实体瘤细胞的凋亡。
表２　ＴＵＮＥＬ染色检测异叶败酱多糖
对荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响
Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＨＢ－Ｐ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌ　ｎｕｍｂｅｒ
ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｂｙ　ＴＵＮＥＬ　ａｓｓａｙ
处理组
Ｇｒｏｕｐ
细胞凋亡率／％
Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌ
阴性对照组Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　 ４．１５±１．８７
阳性对照组ＣＴＸ　 ２７．０３±２．３１＊＊
异叶败酱多糖低剂量组ＰＨＢ－Ｐ－ＬＤ　 ８．２３±２．６６＊
异叶败酱多糖中剂量组ＰＨＢ－Ｐ－ＭＤ　 １８．９６±２．２６＊＊
异叶败酱多糖高剂量组ＰＨＢ－Ｐ－ＨＤ　 ２０．８５±３．０１＊＊
２．３　异叶败酱多糖对荷瘤小鼠血清ＬＤＨ 和 ＡＫＰ
活性的影响
由表３可见，与阴性对照组相比，异叶败酱多糖
中、高剂量极显著降低了荷瘤小鼠血清ＬＤＨ的活性
（Ｐ＜０．０５），但与低剂量组和阳性对照组差异不显著
６１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第３８卷
（Ｐ＞０．０５）。相较阴性对照组，异叶败酱多糖各组和
阳性对照组荷瘤小鼠血清ＡＫＰ活性差异均不显著
（Ｐ＞０．０５），各处理组血清ＡＫＰ的活性稍有提高。
２．４　异叶败酱多糖对小鼠肿瘤组织突变型ｐ５３、
Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ蛋白表达的影响
由表４可见，与阴性对照组相比，异叶败酱多糖
中、高剂量组和阳性对照组小鼠肿瘤组织的Ｂａｘ蛋
白表达均显著提高（Ｐ＜０．０５），同时，突变型ｐ５３和
Ｂｃｌ－２蛋白表达均显著下降（Ｐ＜０．０５）。其中，异叶
败酱多糖中、高剂量组小鼠肿瘤组织的突变型ｐ５３
蛋白表达量分别降低了２４．３１％和３５．４４％，Ｂｃｌ－２
蛋白表达量降低了３１．８５％和３６．１８％，Ｂａｘ蛋白表
达量提高了６１．１２％和７３．９８％。但是，低剂量异叶
败酱多糖未能明显改变突变型ｐ５３、Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ蛋
白的表达量。
表３　异叶败酱多糖对荷瘤小鼠血清ＬＤＨ和
ＡＫＰ活性的影响
Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＨＢ－Ｐ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ＬＤＨ　ａｎｄ
ＡＫＰ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ－ｂｅａｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ　 Ｕ／Ｌ
处理组
Ｇｒｏｕｐ ＬＤＨ　 ＡＫＰ
阴性对照组 Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　 ４　３０７±１０１　 ６７．８２±１０．２３
阳性对照组ＣＴＸ　 ４　２７１±１１３　 ６９．２３±１３．８７
异叶败酱多糖低剂
量组ＰＨＢ－Ｐ－ＬＤ ４　１９８±１３７　 ６７．９４±１０．７７
异叶败酱多糖中剂
量组ＰＨＢ－Ｐ－ＭＤ 　 ３　５８１±１２９
＊＊ ７１．６５±１１．４５
异叶败酱多糖高剂
量组ＰＨＢ－Ｐ－ＨＤ 　 ３　２９６±１４２
＊＊ ７３．５７±１２．３１
表４　异叶败酱多糖对小鼠肿瘤组织突变型ｐ５３、Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ蛋白表达的影响
Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＨＢ－Ｐ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔ　ｐ５３，Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂａｘ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ
处理组
Ｇｒｏｕｐ
突变型ｐ５３阳性细胞率／％
Ｍｕｔａｎｔ　ｐ５３ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌ
Ｂｃｌ－２阳性细胞率／％
Ｂｃｌ－２ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌ
Ｂａｘ阳性细胞率／％
Ｂａｘ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌ
阴性对照组 Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　 ６９．５６±５．０３　 ７６．３２±８．２５　 １９．５２±４．３１
阳性对照组ＣＴＸ　 ３６．１２±６．７８＊＊ ５０．１９±７．４６＊ ４１．１３±７．５６＊＊
异叶败酱多糖低剂量组ＰＨＢ－Ｐ－ＬＤ　 ６１．９８±７．４４　 ７０．３２±６．８８　 ２２．３７±４．９６
异叶败酱多糖中剂量组ＰＨＢ－Ｐ－ＭＤ　 ５２．６５±５．５６＊ ５２．０１±７．０２＊ ３１．４５±５．０２＊
异叶败酱多糖高剂量组ＰＨＢ－Ｐ－ＨＤ　 ４４．９１±６．１２＊ ４６．７１±６．３４＊＊ ３３．９６±６．１２＊
３　讨　论
近年来，在植物中寻找有效而副作用小的抗肿
瘤药物，特别是对中草药抗肿瘤机理的探讨，已成为
国内外研究的重要课题。本研究结果显示，用不同
剂量的异叶败酱多糖治疗Ｕ１４宫颈癌荷瘤小鼠后，
肿瘤生长均受到不同程度的抑制，且肿瘤抑制率随
着异叶败酱多糖含量的升高而呈上升趋势，最高可
达４２．６８％，与阳性对照组抑瘤率差异不显著，表明
异叶败酱多糖在体内具有显著的抗肿瘤效果，且与
剂量存在一定的关系。
细胞凋亡是因内外环境的变化或死亡信号的触
发，并在基因调控下引发的细胞自主性死亡过程，是
正常胚胎发生过程和成人发育中细胞消除的正常途
径，凋亡过程的紊乱将导致发育异常并加快肿瘤的
发生［９］。细胞增生和细胞凋亡间的平衡是多细胞生
物体维持自身稳定的重要因素，如果肿瘤细胞的凋
亡受抑制，肿瘤细胞数则增加，表现出生长优势，这
是肿瘤发生的一个重要基础。细胞凋亡具有独特的
生物化学和形态学特征，生物化学上的主要变化表
现为内源性核酸内切酶被激活，细胞ＤＮＡ被切割
出现单链或双链缺口，产生与ＤＮＡ断裂点数目相
同的３′－ＯＨ末端。ＴＵＮＥＬ（脱氧核苷酸末端转移
酶介导ｄＵＴＰ缺口末端标记法）是检测凋亡细胞的
灵敏方法之一。本试验通过ＴＵＮＥＬ法检测到，异
叶败酱多糖可诱导Ｕ１４肿瘤细胞的凋亡，异叶败酱
多糖高剂量组诱导细胞凋亡率达到２０．８５％，表明
异叶败酱多糖在体内可通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑
制肿瘤生长。
细胞凋亡是级联式基因调控的结果，许多基因
参与了此过程，其中包括ｐ５３、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ 等［１０］。
ｐ５３基因是一种促进细胞凋亡的抑癌基因，可分为
野生型和突变型２种，均参与细胞凋亡调控，但作用
效果不同。野生型ｐ５３能修复细胞ＤＮＡ的损伤，
一旦ＤＮＡ难以修复时即启动凋亡进程，使具有癌
变倾向的细胞发生凋亡；而突变型ｐ５３丧失启动细
胞凋亡的功能，与野生型ｐ５３亚单位形成寡聚体，干
扰野生型ｐ５３的功能，从而使细胞增殖失控［１１］。研
究表明，约５０％的人类肿瘤发生ｐ５３的突变，一些
天然产物的抗肿瘤机理即是清除肿瘤细胞中的ｐ５３
突变细胞而保留ｐ５３正常细胞［１２］。Ｂｃｌ－２家族蛋白
在细胞凋亡的调控中也起重要作用，其中Ｂｃｌ－２抑
制细胞的凋亡，而Ｂａｘ促进细胞的凋亡，两者的比例
决定细胞凋亡的发生［１３］。激活的ｐ５３通常诱导
Ｂａｘ蛋白上调，从而活化下游ｃａｓｐａｓｅ－３等分子导致
细胞凋亡［１４］。本试验通过免疫组化染色分析表明，
异叶败酱多糖能够显著降低肿瘤组织中突变型ｐ５３
蛋白和Ｂｃｌ－２蛋白的表达，同时提高了Ｂａｘ促凋亡
７１第１１期 耿果霞，等：异叶败酱多糖的体内抗肿瘤活性研究
蛋白的表达。这提示异叶败酱多糖可能通过减弱或
解除Ｂｃｌ－２对细胞凋亡的抑制作用而促进细胞凋
亡，同时还可能下调突变型ｐ５３、活化正常的ｐ５３来
激活Ｂａｘ蛋白，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。
ＬＤＨ作为一种厌氧条件下催化丙酮酸到乳酸
盐可逆性反应的酶，其上调能确保肿瘤细胞有效地
进行厌氧生活、糖代谢，降低了肿瘤细胞对氧的依
赖［１４］。有研究表明，原发性肿瘤去除手术后１周
内，患者血清ＬＤＨ 快速降低，这表明血清ＬＤＨ 是
癌症患者体内肿瘤细胞的产物［１５］。本研究表明，高
剂量异叶败酱多糖可使Ｕ１４荷瘤小鼠血清ＬＤＨ活
性水平显著下降，说明异叶败酱多糖可能降低了肿
瘤细胞膜的通透性，干扰了肿瘤细胞的正常代谢，最
终导致肿瘤组织细胞释放到血清中的ＬＤＨ显著降
低。ＡＫＰ常被作为一种肝毒性的生物标记酶［１６］。
本研究结果表明，异叶败酱多糖未明显改变血清中
的ＡＫＰ水平，而且试验过程中也未发现试验小鼠
有中毒症状，这说明所选的异叶败酱多糖剂量对
Ｕ１４荷瘤小鼠是安全的，无明显毒副作用。
综上所述，异叶败酱多糖在 Ｕ１４荷瘤小鼠体内
具有显著的抗肿瘤作用，并且通过多种途径抑制肿
瘤细胞的生长。其作用机理可能是通过调节ｐ５３、
Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ等与凋亡相关基因的表达，以及影响
细胞膜通透性而发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。深
入研究异叶败酱多糖对 Ｕ１４肿瘤细胞凋亡相关基
因表达的影响，有助于进一步认识异叶败酱多糖抗
肿瘤的机制，从而为其临床应用提供理论依据。
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ｕｍ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　ｂｌｏｏｄ　ｕｒｅａ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｏｆ　ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ－ＨＳＡ　ｉｍ－
ｍｕｎｉｚｅｄ　ｇｏａｔｓ［Ｊ］．Ａｎｉｍ　Ｆｅｅｄ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈ，２００８，１４２（１）：７４－８８．
８１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第３８卷