全 文 ：　＊收稿日期:1999-02-02初稿;1999-04-05修改稿
　　　　河南省科委攻关项目
　食用菌学报　2000.7(1):1 ～ 7
　Acta Edulis Fungi
RAPD和酯酶同工酶技术在
香菇杂交育种中的应用＊
董昌金　江　涓
(湖北师范学院生物系 ,黄石　435002)
姚占芳
(河南农业大学生物工程学院 , 郑州　450002)
摘　要　利用 RAPD 和酯酶同工酶技术研究了 6 个香菇品种间的遗传差异和亲缘关系。通
过聚类分析发现 , 类间组合杂种优势强 , 类内组合杂种优势弱 ,因此 ,杂交亲本应选择不同类的菌
株。通过单孢杂交和出菇试验发现 ,杂交子代酶谱出现“互补型酶带”和“杂种新酶带” , 杂交后代
杂种优势强 ,容易选出优良品种。
关键词　香菇;RAPD;酯酶同工酶;单孢杂交;育种;杂种优势
香菇传统上是以菌落形态 、颜色 、子实体形态 、产量高低等表型特征加以分类和评价的 ,这
种方法在育种上盲目性大 ,工作量大 。80年代以来 ,杂交育种工作者希望优良性状的转移
(DNA 重组与交换)能通过分析同工酶质与量的变化 ,于分子水平鉴别外部形态性状难以鉴别
的遗传变异 。应用同工酶来鉴别杂种优势和远缘杂交杂种已有许多报道。Williams和Welsh
(1990)已成功地用以 PCR(Polymerase Chain Reaction)技术为基础发展的 RAPD(Random Am-
plified Polymorphic DNA)技术检测不同品种 DNA片段的多态性〔1 ,2〕 。
本研究针对香菇生产和育种中存在的问题 ,对目前香菇主栽品种进行 RAPD分析 ,并配
以聚类分析和酯酶同工酶分析 ,旨在揭示几个杂交亲本间的亲缘关系和遗传相关性。同时以
这 6个香菇菌株为亲本 ,利用单孢分离和杂交技术进行杂交育种 ,并对杂交亲本和子代进行酯
酶同工酶分析 ,根据子代和亲本酯酶同工酶酶谱的差异来预测杂交子代的杂种优势〔3〕并进行
栽培试验 。试验发现 ,杂交后代具杂交优势的理论与栽培试验结果完全吻合。
1　材料与方法
1.1　供试菌株
香菇主栽品种 Cr02(A)、7402(B)、45(C)、087(D)、465(E)、856(F)来自华中农业大学和
河南农业大学微生物教研室。
1.2　基因组 DNA 的提取
将供试菌株在马铃薯固体培养基上活化后转接于液体马铃薯培养基中 , 25℃,120r/min ,
振荡培养 ,14d后过滤收集菌丝体 ,采用经改良的 Lee和 Tay lor(1990)方法提取基因组 DNA ,
并在 756-MC 分光光度计上比色测定 DNA含量和纯度 ,根据测定结果进行稀释 ,使 DNA含
量达 5 ～ 10μg/μL 。
1.3　DNA扩增
1.3.1　PCR材料　所用 10个碱基的随机引物选自美国 Operon公司出品的随机引物试剂盒
A 中的 20个随机引物 ,其中引物OPA-04 5 -3 核苷酸序列为AATCGGGCTG。四种 dN TP 、
10×buffer 、Taq DNA多聚酶 、DNA 标准分子量 PGEM 均为 Promega公司产品 。琼脂糖(3∶1
Nusieve)是美国 FMC公司产品。
1.3.2　PCR扩增 　RAPD-PCR扩增反应在 PCR-100扩增仪(MJ Research Inc)上进行 ,每
25μL 反应液中含有 50mM KCl 、10mM Tric-HCl、0.001%(W/V)明胶 、2mM MgCl2 、200μM 的
各种 dN TP ;2个单位的 Taq DNA 多聚酶 ,0.2μM 引物 , 10μg 的模板 DNA。对照管不加模板
DNA ,而以等体积重双蒸水代替。
1.3.3　RAPD产物的检测　扩增产物用 1.4%琼脂糖凝胶电泳分离 ,以 PGEM 作为分子量标
记 ,EB染色后 ,紫外灯下观察结果并照相 。
1.3.4　数据处理分析　在琼脂糖凝胶上以 DNA片段的出现与否分别记为 1或 0 。以标准分
子量 PGEM 为对照 ,用 Gel软件计算出 DNA片段的分子量大小。
根据所统计的片段带的有无 ,用 NTSYS-PC 程序中的 Simqual软件算出菌株间遗传相似
系数;用平均连锁聚类分析方法(Unweighted Pair Group M ethod Clustering , UPGMA)进行聚
类分析 ,构建树状图 。
1.4　香菇菌株 A 、B 、C 、D 、E 、F 单孢分离及杂交试验
1.4.1　单孢分离和单核菌丝鉴别〔4 , 5〕　取八成熟的子实体 ,于无菌条件下收集孢子 ,梯度稀
释后倒平板 ,置 25℃温箱中培养 3 ～ 5d后 ,发现微小白星点时将其挑入新鲜斜面培养基 , 25℃
恒温培养 ,菌落长至 2 ～ 3cm 时 ,挑取边缘菌丝置载玻片上 ,用显微镜观察 ,若无锁状联合 ,可
初步认为是单孢萌发而成的单核菌丝 ,立即转入斜面培养基上培养。
1.4.2　配对杂交　将两个不同亲本的单核菌丝同时接种于平板培养基上 ,相距 1.0 ～ 1.5cm ,
培养 10 ～ 15d ,待两菌丝接触后 ,挑取接触部分的菌丝镜检 ,如发现锁状联合 ,立即将其转接到
新鲜斜面培养基上培养。
1.4.3　拮抗试验　平板内以亲本 、异核体 、亲本的方式接种 ,相距 2 ～ 3cm 。培养一个月后观
察拮抗现象。
1.5　杂交亲本及杂交新组合的酯酶同工酶电泳分析
挑选 33个杂交新组合与 6个亲本一起进行酯酶同工酶电泳 ,根据酯酶同工酶酶谱 ,比较
新组合与亲本的差异 ,进一步鉴定香菇杂种 ,并试图预测杂交新组合杂种优势的强弱 。
1.6　杂交亲本及杂交新组合的栽培试验
1.6.1　菌株　亲本 A 、B 、C 、D 、E 、F 及 33个杂交新组合
1.6.2　培养基　母种培养基为 PDA ;原种及栽培培养料为:阔叶树木屑 78%、麸皮 20%、蔗
糖 1%、CaCO3 1%,加水拌匀 ,使含水量达 60%, pH 自然。
1.6.3　方法　栽培袋 17×33cm ,两端接种 ,每袋装干料 400g ,置 25℃下培养 。待菌丝长满塑
料袋后 ,脱袋 ,进行出菇期管理 。每个香菇品种及杂交组合各挑选 10袋进行出菇对比试验。
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2　实验结果
2.1　DNA提取及 PCR扩增
提取 6个亲本菌株的 DNA ,其纯度测定符合进一步遗传分析的要求 。在所测试的 20个
随机引物中 ,引物OPA-04 、OPA -10 、OPA -13 、OPA -14 、OPA -20扩增效果较好 ,能扩增
除个别菌株外的所有菌株 ,且重复性好 。引物 OPA-04扩增香菇亲本 DNA带的结果见表 1。
表 1　引物OPA-04扩增 6个香菇亲本的 DNA带
Table 1　DNA band of six Lentinula edodes parent strains amplified by primer OPA-04
DNA带大小
DNA band size(kb)
菌株 St rains
A B C D E F
DNA带大小
DNA band size(kb)
菌株 St rains
A B C D E F
1.29 1 1 1 0 0 1 0.55 1 1 1 1 1 1
1.26 1 0 1 1 0 1 0.52 1 1 1 1 1 1
1.03 0 0 1 0 0 0 0.49 0 0 0 1 0 0
0.89 1 1 1 1 0 1 0.44 1 1 1 1 1 1
0.87 0 0 0 0 0 0 0.39 1 1 1 1 1 1
0.71 1 1 1 1 1 1 0.34 0 0 0 0 1 0
0.69 1 1 1 1 1 1 0.32 0 0 0 0 1 0
0.62 1 0 1 1 0 1 0.30 1 1 1 1 1 1
2.2　遗传相似系数的估算
将扩增的 DNA片段按材料与方法中的要求进行统计 ,然后以 5个引物扩增的总统计结
果为基础 ,计算各菌株间的相似系数 ,制成相似系数矩阵(表 2)。
表 2　6个香菇亲本菌株的相似系数矩阵
Table 2　The similarity coefficient matrix of six Lent inula edodes parent strains
A B C D E F
A 1.000 0.800 0.674 0.698 0.674 1.000
B 1.000 0.545 0.659 0.591 0.800
C 1.000 0.600 0.454 0.674
D 1.000 0.568 0.698
E 1.000 0.674
F
2.3　聚类分析
利用 UPGMA聚类法 ,将 6 个香菇亲本菌株两两菌株间相比较的相似系数进行聚类分
析 ,并构成树状聚类图(图 1)。
OTU6=〔OTU1 、OTU2〕　r1 ,2=0.800
OTU7=〔OTU4 、OTU6〕　r4 ,6=0.679
OTU8=〔OTU3 、OTU5〕　r3 ,5=0.454
OTU 最后=0.400
从图 1可以看出 , 6个香菇亲本菌株可分为四类 , E(465)为第一类 ,C(45)为第二类 , D
(087)为第三类 ,A(Cr02)、B(7402)、F(856)为第四类 ,其中A 、F 为同一菌株 ,说明A 、B 、F 相似
程度高 ,亲缘关系近 。第 1 、2与 3 、4类相似系数较低 ,亲缘关系较远 。
31 期　　　　　　　董昌金等:RAPD和酯酶同工酶技术在香菇杂交育种中的应用
2.4　同工酶测定
6个杂交亲本菌株及 33个杂交新组合菌丝经酶液提取 、电泳和染色 ,其酯酶同工酶图谱
见图 2 、图 3。杂交亲本及组合酯酶同工酶谱带相对迁移率(Rf)见表 3。
从图 2和图 3可知 ,杂交子代酶谱如果与亲本(或亲本之一)相似 ,则同源性强。若杂交子
代酶谱谱带显著减少(一般减少 2 ～ 3 条),且无杂种新酶带出现 ,则杂交子代杂种优势较弱 。
杂交子代酶谱如果出现“互补酶带”和“杂种新酶带”(杂种新酶带一般出现 1 ～ 2条),则杂交后
代杂种优势一般较强。根据上述结论推测 ,杂交后代出现强优势组合的有 BD1 、BD2 、BE4 、
CF1 、DF1 、EC1 。
图 1　6个香菇亲本菌株相似系数聚类图
Fig.1　Dendrogram of similarity coefficient of six Lentinula edodes parent strains
图 2　香菇亲本及杂交新组合酯酶同工酶酶谱
Fig.2　Esterase isoenzyme zymogram of Lentinula edodes parent strains and new cross combinations
图 3　香菇亲本及杂交新组合酯酶同工酶谱谱
Fig.3　Esterase isoenzyme zymogram of Lentinula edodes parent strains and new cross combinations
4 　　　　　　　　　　　食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　　7 卷
表 3　杂交亲本及组合酯酶同工酶谱带相对迁移率＊
Table 3　The relative Rf of esterase isoenzyme band of Lent inula edodes parent strains and crossing combinations
菌株
St rains
谱带 Band(Rf)
1 2 3 4 5 6
杂交亲本
C rossing
parents
酶谱与亲本异同
Simi larities and
dif ferences of
zymogram betw een
parent st rains
and crossbreed
杂种新酶带
New band of
crossb reed
杂交优势
Heterosis
A 0.538 0.635 0.683 0.740 0.769 0.981
B 0.538 0.635 0.644 0.683 0.740 0.769
C 0.538 0.635 0.740 0.769 0.971
D 0.538 0.606 0.635 0.740 0.769 0.981
E 0.538 0.740 0.769 0.981
F 0.538 0.635 0.683 0.740 0.769 0.981
AB1 0.538 0.740 A.B 异(D) 无 No 弱(W)
AB2 0.538 0.635 0.683 0.981 A.B 异(D) 无 No 弱(W)
BC1 0.538 0.740 0.971 B.C 异(D) 无 No 弱(W)
BC2 0.538 0.635 0.971 B.C 异(D) 无 No 弱(W)
CD 1 0.538 0.740 0.769 0.971 C.D 异(D) 无 No 弱(W)
CD 2 0.538 0.635 0.740 0.981 C.D 异(D) 无 No 弱(W)
CD 3 0.538 0.971 C.D 异(D) 无 No 弱(W)
CD 4 0.538 0.740 0.971 C.D 异(D) 无 No 弱(W)
DA 1 0.538 0.740 D.A 异(D) 无 No 弱(W)
DA 2 0.538 0.981 D.A 异(D) 无 No 弱(W)
FA 1 0.538 0.740 0.769 0.981 A.F 异(D) 无 No 弱(W)
CF1 0.538 0.692 0.740 0.769 0.981 C.F 异(D) Rf 0.692 强(S)
CF2 0.538 0.931 F.C 异(D) 无 No 弱(W)
EF1 0.538 0.740 0.769 0.981 E.F 异(D) 无 No 弱(W)
BE1 0.538 0.635 0.981 B.E 异(D) 无 No 弱(W)
BE2 0.538 0.740 0.981 B.E 异(D) 无 No 弱(W)
BE3 0.538 0.981 B.E 异(D) 无 No 弱(W)
BE4 0.538 0.721 0.740 0.788 0.952 0.981 B.E 异(D) Rf 0.721 、0.788 、0.952 强(S)
BD 1 0.538 0.606 0.721 0.981 B.D 异(D) Rf 0.721 强(S)
BD 2 0.538 0.712 0.769 0.913 0.981 B.D 异(D) Rf 0.712 、0.913 强(S)
DF1 0.538 0.606 0.635 0.673 0.769 0.981 D.F 异(D) Rf 0.673 强(S)
DF2 0.538 0.606 0.635 0.740 0.981 D.F 异(D) 无 No 弱(W)
DF3 0.538 0.635 0.981 D.F 异(D) 无 No 弱(W)
BF1 0.538 0.635 0.740 B.F 异(D) 无 No 弱(W)
BF2 0.538 0.740 0.769 B.F 异(D) 无 No 弱(W)
EA 1 0.538 0.740 0.769 0.981 E.A 异(D) 无 No 弱(W)
EA 2 0.538 0.740 0.981 E.A 异(D) 无 No 弱(W)
EC 1 0.413 0.538 0.692 0.981 E.C 异(D) Rf 0.413 、0.692 强(S)
EC 2 0.538 0.740 0.769 0.981 E.C 异(D) 无 No 弱(W)
EC 3 0.538 0.740 0.769 0.981 E.C 异(D) 无 No 弱(W)
ED 1 0.538 0.740 0.769 0.981 E.D 异(D) 无 No 弱(W)
ED 2 0.538 0.740 0.769 0.981 E.D 异(D) 无 No 弱(W)
ED 3 0.538 0.635 0.769 0.981 E.D 异(D) 无 No 弱(W)
＊D:di fferent , W:weak , S:strong
51 期　　　　　　　董昌金等:RAPD和酯酶同工酶技术在香菇杂交育种中的应用
2.5　杂交亲本与组合的栽培试验
2.5.1　亲本与杂交新组合出菇情况　6 个亲本杂交所产生的 33个新组合中 ,出现杂种新酶
带的杂交后代有 6个 ,其杂种新酶带 Rf 分别为 CF1(C 与 F 杂交)0.692;BE4(B 与 E 杂交)
0.721 、0.788 、0.952;BD1(B与 D杂交)0.721;BD2(B与 D杂交)0.712 、0.913;DF1(D与 F 杂
交)0.673;EC1(E与 C 杂交)0.413 、0.692 。
2.5.2　亲本与产量高于亲本杂交组合的性状比较　33个杂交新组合中 ,有 6个的袋平均产
量高于亲本 ,这 6个杂交新组合为 BD1 、BD2 、BE4 、CF1 、DF 1和 EC1 。6个亲本及单产高于亲本
杂交新组合的平均单产和生物学效率分别为 A .191.95g , 47.98%;B.212.33g , 53.08%;
C.182.97g ,45.74%;D.202.68g , 52.17%;E.192.08g , 48.02%;F.197.63%, 49.4%;
BD1.223.51g , 55.88%;BD2.256.13g , 64.03%;BE4.259.55g , 64.8%;DF1.238.3g ,
59.58%;DF1.230.4g ,57.6%;BC1.258.9g ,64.73%。
3　分析与讨论
3.1　根据香菇品种酯酶同工酶分析比较杂交亲本与杂交新组合同工酶酶谱 ,如果杂交后代酯
酶同工酶酶谱出现“互补型”酶带和“杂种”新酶带 ,就是强优势组合 ,否则就是弱优势或无优势
组合。根据预测结果 ,杂交后代产量上出现强优势的组合有 BD1 、BD2 、BE4 、CF1 、DF1 和 EC1 。
根据栽培试验结果 ,杂交后代产量高于双亲的新组合有 BD1 、BD2 、BE4 、CF1 、DF 1和 EC1 。理论
预测结果与实际栽培结果相吻合。
3.2　杂交育种中 ,首先面临的是亲本选择问题 ,除参考其经济性状外 ,还要分析其遗传差异的
大小 ,亲缘关系的远近和生理生化特征 。利用 RAPD技术和同工酶电泳分析 ,选择遗传差异
大 ,亲缘关系远 ,酯酶同工酶酶谱差异大 ,同源成分弱的两菌株作亲本 ,杂交后代就可能出现杂
种优势较强的新组合 。从本研究可以看出 ,亲缘关系近的 B(Cr02)菌株和 F(856)菌株没有产
生强优势组合 ,而 C(45)菌株和 E(465)菌株亲缘关系较远 ,就较易产生强优势组合(EC1)。亲
缘关系较近的菌株虽然也能产生较强的优势组合 ,但畸形菇特别多 ,有的甚至全部是畸形菇 ,
如 B(7402)、D(087)组合 ,这进一步说明了选择杂交亲本以亲缘关系较远为好 。
3.3　经过理论预测和栽培出菇试验 ,选育出新的优良香菇品种 HL 6(已通过鉴定 ,另文报道)。
参　考　文　献
1　Williams JGK , Kubelik AR , Rafalski JA , et al.Nucleic Acides Res , 1990 , 18:6531～ 6535.
2　McDermo tt JM , McDonald BA.Annu Rev phy topathol , 1993 , 31:353～ 373.
3　蒙义文.同工酶预测杂种优势.遗传与育种 , 1978 ,(4):23.
4　刘都才.平菇杂交育种研究.中国食用菌 , 1989 ,(2):12 ～ 14.
5　罗宽华.香菇品种杂交的研究.微生物通报 , 1980 ,(2):51 ～ 52.
6 　　　　　　　　　　　食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　　7 卷
Study on the Crossbreeding of Lentinula edodes
with RAPD and Esterase Isoenzyme Technique
Dong Chang jin　Jiang Juan
(The Biology Department of Hubei No rmal Colleg e, Huangshi　435002)
Yao Zhanfan
(The Biology Engineering Colleg e of Henan Ag ricultural University , Zhengzhou　450002)
Abstract　The genetic variance and genetic relationship of six Lentinula edodes strains were studied w ith
RAPD and esterase isoenzyme techniques.The result show ed that the heterosis was stronger when the cross combi-
nations were produced by parent strains in different groups , while the he terosis w as weaker when the cro ss combina-
tio ns w ere produced by parent strains in the same group.So parent strains in different g roups should be selected fo r
the cro ssbreeding.When mutually complementary enzyme bands and new enzyme bands of the new cross combina-
tio ns appeared in the zymogram of the crossbreeding filial generation through monospore crossbreeding and fruiting
experiment , the heterosis of the crossbreeding filial generation w as stronger and high quality strains could be selected
easily.
Key words　Lentinula edodes;RAPD;Esterase isoenzyme;Monospo re crossbreeding;Heterosis
《食用菌学报》2000年征订启事
《食用菌学报》系由国家科委批准 ,全国公开发行的学术类刊物 。主要为食用菌专业教学
和科研人员 、生产单位的技术人员及供销外贸系统和领导机关的专业干部提供食用菌遗传育
种 、驯化栽培 、菇房管理 、栽培材料 、病虫防治 、生理生化及产后加工等方面的最新研究成果。
《食用菌学报》为季刊 ,16开本 ,64页 ,每期 5.00元 。2000年出版 4期 ,全年 30.00元(含
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