全 文 ：食用菌学报 2006.13(4):1 ～ 5
收稿日期:2006-08-22 原稿;2006-10-11 修改稿
基金项目:福建省科技平台建设项目“福建省食用菌种质资源科技共享平台建设及相关研究”(编号:2006S1001)的
部分研究内容
作者简介:应正河(1979-),男 , 2006 年毕业于福建农林大学生命科学学院 ,硕士研究生 , 主要从事食用菌分子生物
学研究。
＊本文通讯作者
文章编号:1005-9873(2006)04-0001-05
香菇 SRAP反应体系的优化
应正河1 , 2 , 吴小平1 , 谢宝贵1＊ , 陈丽娜1 , 卢启泉1 , 高　巍1 , 孙淑静1
(1福建农林大学菌物研究中心 , 福建 福州 350002;　2福建省农业科学院植物保护研究所 , 福建 福州 350013)
摘　要:为建立并优化适于香菇(Lentinula edodes)SRAP(Sequence-related amplified po lymorphism , 相关序列
扩增多态性)分析的扩增体系 , 通过单因子实验分别研究了 dNTP 、Mg 2+、模板 DNA、引物浓度和 Taq 酶用量
对香菇 SRAP反应的影响。试验获得的 25 μL 优化扩增体系为 Mg 2+2.5 mmol/ L , dNTPs 250 μmol/ L , Taq
酶 1.5 U , 引物 0.5 μmo l/ L , 模板 DNA 20 ng , 10×PCR buffe r 2.5 μL , 此条件下 SRAP 扩增香菇菌丝 DNA 条
带清晰 ,多态性丰富。
关键词:香菇;SRAP;扩增条件优化
中图分类号:S646.120.1　　　　文献标识码:A
　　我国是香菇(Lentinula edodes)生产和出口
大国 ,但生产上菌种混乱 ,同种异名 、同名异种现
象普遍存在。分子标记技术可用于菌种鉴别 ,在
清理这种现象中发挥重要作用。目前常用的分
子标记 技术有 RFLP (Restrict ion Fragment
Length Polymorphism , 限制性片段长度多态
性)、RAPD(Randomly Amplified Polymorphic
DNA , 随机扩增多态性)、ISS R(Inter-Simple
Sequence Repeat , 简单序列重复间区)、AFLP
(Amplified Fragment Leng th Polymorphism ,扩
增片段长度多态性)、SSR (Simple Sequence
Repeat , 简 单 序 列 重 复)和 SNP (Single
Nucleotide Po lymo rphisms , 单核苷酸多态性)
等[ 1 ～ 3] 。以 PCR为基础的分子标记具有技术简
单 、快速的特点 ,但各种分子标记类型的技术原
理不同 ,其灵敏性 、稳定性和多态性不同 。
SRAP(Sequence-related amplified polymor-
phism ,相关序列扩增多态性)是 1种新型的基于
PCR的标记系统 ,由美国加州大学蔬菜系 LI 与
QUIROS 博士于 2001 年提出[ 4] ,又称基于序列
扩 增 多 态 性 (Sequence-Based A mplif ied
Polymo rphism , SBAP)[ 5] 。该技术用于扩增启
动子或内含子与外显子之间的序列 。不同生物
或不同个体间 ,内含子或启动子及外显子的长度
不同 ,存在丰富的多态性[ 4] 。引物序列由填充序
列 、核心序列(特异序列)和选择性序列 3 个部分
组成 。上游引物长 17 bp(10 bp 填充序列 +
CCGG+3个选择碱基),可结合于外显子上 ,下
游引物长 18 bp(11 bp填充序列+AAT T +3个
选择碱基),可结合于内含子区域或启动子区域 。
该技术具有简便 、稳定 、产率高 、在基因组中分布
均匀的特点 ,适用于基因定位 、基因克隆 、生物多
样性研究 、遗传图谱构建 、cDNA 指纹图谱 、预测
杂种优势 、比较基因组学等诸多研究领域 。
SRAP 标记已经在马铃薯 、水稻 、苹果 、柑橘类果
树 、樱桃 、梅子 、油菜 、大蒜 、莴苣 、芹菜[ 4] 、棉花[ 6]
等植物研究中应用。
1　材料和方法
1.1 供试菌株
　　供试菌株(见表 1)保藏于福建省食用菌种质
资源库。表中 8 号菌株用于 SRA P 扩增条件优
化试验 ,1 ～ 40 号菌株用于优化条件的多态性试
验。其中 1 号菌株由原三明食品工业研究所提
供;20 ～ 31 ,34 ,36 ～ 40 号菌株由福建省农业区划
所提供;其他菌株均由三明真菌所提供 。
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2006.04.001
食　用　菌　学　报 第 13 卷
表 1　供试菌株
Table 1　Strains tested
编号
No.
菌株
Strain
编号
No.
菌株
S train
1 087 21 申香 2号 Shenxiang No 2
2 135 22 申香 4号 Shenxiang No 4
3 Cr02 23 申香 7号 Shenxiang No 7
4 L26 24 申香 8号 Shenxiang No 8
5 L27 25 申香 9号 Shenxiang No 9
6 闽丰一号 Minfeng No 1 26 申香 10 号 Shenx iang No 10
7 Cr62 27 申香 12 号 Shenx iang No 12
8 7401 28 申香 93 号 Shenx iang No 93
9 7402 29 Cr52
10 日大 Rida 30 Cr66
11 L 秋 2 L-Qiu 2 31 Cr33
12 L11 32 Cr04
13 507 33 L42
14 L105 34 L66
15 L12 35 939
16 L18 36 9015
17 236 37 241-4
18 L03 38 庆科 20 Qingke 20
19 807 39 武香 Wuxiang
20 241 40 苏香 Suxiang
1.2 培养基
　　斜面培养基(PDA):马铃薯 200 g , 葡萄糖
20 g ,琼脂 20 g ,水 1000 mL ,pH 自然 。
液体培养基(PD):马铃薯 200 g , 葡萄糖
20 g ,水 1000 mL ,pH 自然。
1.3 试剂
　　10×PCR buf fer 、MgCl2 、Taq酶和 dN TP 购
自大连宝生物公司;SRAP 引物购自上海博亚生
物技术有限公司 。
1.4 基因组 DNA的提取
1.4.1 菌丝体制备
供试香菇菌种转接于 PDA 斜面培养基上活
化后 , 再转接到 PD 培养基中 , 25 ℃下 , 置于
130 r/min摇床培养6 d ,过滤收集菌丝体 ,用滤纸
吸干水分后 , -20 ℃贮存备用 。
1.4.2 DNA 提取
DNA 提取参照 CTAB 法[ 7] ,在下列三个方
面作了改良:样品用量为 1 g , CTAB浓度用 2%
(m/v),等体积的氯仿/异戊醇(24/1 , v/v)去蛋白
质 3次。
1.5 基础扩增反应体系和程序
　　基础扩增反应体系包括 1 μL 模板 DNA
(25 ng/μL), 2.5μL 10 ×buffer , 1.5 μL Mg2+
(25 mmol/ L), 2.5 μL dN TP(2.5 mmol/L),
1μL 引 物 (10μmol/L), 0.25μL Taq 酶
(5 U/μL),最后用 ddH2O将总体积补至 25μL。
模板 DNA 、dN TP 、Taq 酶和引物浓度试验
时 ,引物用 Me3/Em17;Mg 2+浓度试验时 ,引物
用 Me3/Em15。
扩增反应程序为94 ℃预变性 5 min;94 ℃变
性 1 m in ,35 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 1 m in ,5个
循环;94 ℃变性 1 min , 50 ℃退火 1 min ,72 ℃延
伸 1 min ,35个循环;最后 72 ℃延伸10 min ,扩增
产物 4 ℃保存。
1.6 SRAP扩增反应条件优化
　　为获得适于香菇 SRAP 扩增反应的最优体
2
第 4 期 应正河等:香菇 SRAP 反应体系的优化
系 ,对 25μL 扩增反应体系的各因子浓度设置了
如下梯度:模板 DNA 10 ～ 50 ng 共 9个梯度;引
物浓度 0.1 ～ 0.7 μmo l/L 共 7 个梯度;dN TP 浓
度 50 ～ 300 μmol/L 共 6 个梯度;Mg2+ 1.5 ～
4.0 mmol/ L共 6个梯度;Taq酶 0.5 ～ 3.0 U 共
6个梯度 。
在整个反应过程中 ,随比较因素梯度设置变
动 ,相应地调整 ddH2 O 量以保持反应体系为
25μL ,同时每个优化好的因素浓度用于下一个因素
的优化反应体系中 ,其余参数和反应条件同1.5。
1.7 供试香菇菌株 SRAP扩增多态性试验
　　使用引物 Em2和 Em12对 40个供试香菇菌
株进行 SRAP 扩增 ,扩增反应体系为优化试验所
确定的最优体系 ,反应程序同 1.5。
1.8 PCR产物的鉴定
　　取扩增产物 10 μL 在 1.5%琼脂糖凝胶(0.5
×TBE)上进行电泳分析(电压 4 ～ 5 V/cm),凝
胶成像分析系统拍照保存 。
2　结果与分析
2.1 模板 DNA浓度
　　试验结果发现 ,当模板 DNA 浓度为 10 ng/
25 μL和 15 ng/25 μL 时 ,条带相对较淡;20 ng/
25μL 时 ,条带数目最多;20 ng/25 μL 以上时 ,扩
增产物基本保持不变(见图 1);这说明 SRAP 扩
增对模板 DNA 浓度适应范围较宽 。通过比较 ,
模板 DNA用量20 ng/25μL 为佳 ,即可获得好的
图 1　不同模板 DNA浓度条件下的 8 号香菇菌株
SRAP 扩增产物
Fig.1　Effect of different template DNA concentrations on
SRAP products from L.edodes strain 7401(test strain No.8)
M:marker;1～ 9:10 , 15 , 20 ,25 , 30, 35 ,40 , 45, 50 ng DNA/ 25μL
扩增效果又节约 DNA 。
2.2 最适Mg2+浓度
　　Mg2 +是 PCR扩增反应中的一个重要因
素 , Mg2+浓度不但会影响酶的活性和合成的
真实性 ,还会影响引物与模板 DNA 的结合效
率 、模板 DNA 与 PCR产物的解链温度和产物
的特异性以及引物二聚体的形成等[ 8] 。扩增
结果(图 2)表明 , 随着 Mg2+浓度的提高 ,产物
的条带 数呈现明显的 变化 。 Mg2 +浓 度为
1.5 mmol/ L时 ,只有 1条强带 , 4条弱带;浓度
为 2.0 mmol/ L 时 ,出现 2 条强带 , 6 条弱带;
浓度为 2.5 mmol/L 时 ,有 2条强带 , 7 条弱带
都较清晰;Mg2 +浓度为 3.0 mmol/ L 以上时 , 2
条强带和 7条弱带 , 弱带稍有变淡 。比较扩增
结果 , Mg2+浓度 2.5 mmol/L 较为合适 , 条带
数丰富 、清晰且稳定 。
2.3 dNTP浓度对 SRAP扩增的影响
　　dN TP 作为 PCR反应的原料 ,浓度过高会
导致错误渗入 ,浓度过低则 SRAP 的产率偏
低 。其浓度的大小直接影响 SRA P 扩增产物
的产量 、特异性及可靠性 。由图 3 可知 , 当
dN TP 为 100 μmol/L 时 ,条带数目少且淡;当
dN TP 为 250 μmol/L 时 ,扩增产物的条带数目
最多 ,条带形和亮度最好 ,这时 DNA 的多态性
也最丰富;当 dN TP 为 300 μmo l/L 时 ,弱带明
显变淡 。本试验结果表明 , dN TP 适宜浓度为
250 μmo l/L。
图 2　不同Mg2+浓度条件下的 8 号香菇菌株
SRAP扩增产物
Fig.2　Effect of different Mg2+ concentrations on
SRAP products from L.edodes strain 7401(test strain No.8)
M:marker;1～ 6:1.5 ,2.0 , 2.5 , 3.0 , 3.5 , 4.0 mmol Mg2+/ L
3
食　用　菌　学　报 第 13 卷
图 3　不同 dNTP 浓度条件下的 8 号香菇菌株
SRAP 扩增产物
Fig.3　Effect of different dNTP concentrations on SRAP
products from L.edodes strain 7401(test strain No.8)
M:marker;1 ～ 5:100 , 150 , 200 , 250 , 300 μmol/ L
图 4　不同 Taq酶浓度条件下的 8 号香菇菌株
SRAP扩增产物
Fig.4 Effect of different Taq DNAPolymerase concentrations on
SRAP products from L.edodes strain 7401(test strain No.8)
M::marker;1～ 6:0.5 , 1.0 , 1.5 , 2.0 , 2.5 , 3.0 U / 25μL
2.4 Taq酶浓度对 SRAP的影响
　　Taq酶用量为 0.5 U时没有扩增产物 ,1.0 U
时有扩增产物但扩增条带不多 ,当 Taq 酶为 1.5 U
和2.0 U时 ,扩增条带清晰 ,扩增结果稳定(图 4)。
但考虑实际应用中成本因素 ,而且 Taq 酶浓度高
时也常常会产生非特异性扩增 ,本试验确定适合香
菇SRAP 扩增的 Taq 酶用量为1.5 U 。
2.5 引物浓度对 SRAP的影响
　　由图 5 可知 ,随着引物浓度的增加 ,产生的
条带数也相应增多。当引物用量在 0.1 μmo l/L
时 ,条带颜色浅 ,条带数目少;引物用量为 0.5 ～
0.7 μmo l/L 时 ,条带清晰 ,条带数最多 ,条带无差
异 ,为了节省引物 , 引物浓度以 0.5 μmo l/L
为佳 。
2.6 最优香菇 SRAP扩增体系及其多态性
　　综合上述单因素多水平试验结果 ,并从试验
扩增产物的产量 、稳定性 、特异性和经济性等方
面考虑 ,确定适于香菇 SRAP 扩增的 25 μL 反应
体系中含 Mg 2+ 2.5 mmo l/L ,dN TP 250μmol/ L ,
Taq 酶 1.5 U , 引物 0.5 μmol/ L , 模板 DNA
20 ng ,10×PCR buffer 2.5μL。
使用引物 Me2和 Eml2对 40个供试香菇菌
株进行 PCR ,扩增产物电泳结果如图 6所示 。试
验结果表明 ,该反应体系扩增的条带清晰 、多态
性丰富。关于 40个香菇菌株的 SRAP 分析将另
文报道。
图 5　不同引物浓度条件下的 8号香菇菌株 SRAP 扩增产物
Fig.5　Effect of dif ferent primer concentration on SRAP products from L.edodes strain 7401(test strain No.8)
M:marker;1 ～ 7:0.1 , 0.2 , 0.3 , 0.4 , 0.5 , 0.6 , 0.7 μmo l/ L
4
第 4 期 应正河等:香菇 SRAP 反应体系的优化
图 6　引物Me2/ Em12 的 40 个供试香菇菌株的 SRAP 扩增结果
Fig.6　SRAP products from forty L.edodes strains using primers Me2 and Em12
M:maker;1～ 40:菌株号同表 1　M:maker;Lanes 1～ 40:test stains as show n in table 1
3　讨　论
　　许多资料介绍 , PCR 反应各组分(dN TP 、
Mg 2+ 、引物 、模板 DNA 及 Taq酶)的浓度都会影
响到 PCR 结果灵敏度和稳定性 , 条件优化对
PCR十分必要 。本试验结果表明 ,dNTP 、Mg2+ 、
引物及 Taq酶浓度对 SRAP 扩增产物有显著的
影响 。在实际操作过程中 ,dNTP 、Mg2+ 、引物及
Taq酶都是浓度已知的试剂 ,仅需调整添加量就
可以控制其最终浓度 ,模板 DNA 的浓度控制常
被忽视。虽然 SRAP 对模板 DNA浓度有较大的
宽容性 ,但由于各样品提取的 DNA 得率不完全
相同 ,所以在 PCR之前测定 DNA 浓度 ,控制各
处理的模板 DNA 浓度 ,利于获得可比性强的结
果。此外 ,有些实验室提取DNA中的 RNA 含量
较高 ,使用 RNase 处理来降解 RNA ,PCR效果反
而不好。王正加认为 , RNase 中含有少量的
DNase ,会降解部分或全部 DNA [ 9] 。本试验提取
的 DNA 未使用 RNase 处理 ,虽然模板 DNA 量
达到 50 ng ,条带还是比较稳定 、清晰 ,进一步说
明少量的 RNA对 SRAP 结果并无显著影响。
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