全 文 ：收稿日期:2005-03-31原稿;2005-05-25修改稿
基金项目:国家自然科学基金资助项目“抗冷冻蛋白基因遗传转化草菇的研究”(编号:39960050), “草菇冷冻胁迫诱导
表达基因及其启动子的克隆分离”(编号:30060054),“食用菌外源基因表达系统的建立”(编号:30371000)和广东省自然科
学基金资助项目“食用菌外源基因表达系统的建立”(编号:032239)的部分研究内容
作者简介:于晓玲(1979-),女 , 2004年毕业于华南热带农业大学作物遗传育种专业 ,硕士 ,助理研究员 ,主要从事基因
工程与分子生物学研究。
＊本文通讯作者
食用菌学报 2005.12(3):15 ～ 20
Acta Edulis Fungi
文章编号:1005-9873(2005)03-0015-06
香菇 ras 和gpd 启动子的克隆与功能鉴定
于晓玲1 , 林俊芳1 ,2 , 郭丽琼1 ,2＊ , 王树昌1
(1 中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 , 热带生物技术研究所 ,海口 571101;
2华南农业大学食品学院生物工程系 ,广州 510640)
摘 要:以香菇基因组 DNA 为模板 , 利用 PCR 技术克隆了香菇 1 个 ras 启动子 Lras , 2 个
gpd 启动子 Lgpd1 和 Lgpd2。这3 个启动子的大小分别为 715bp 、1056bp 和 611bp ,与已报道的 ras
和 gpd 启动子的同源性很强。对这 3个启动子的分析结果表明 ,它们都含有丰富的启动子顺式作
用元件。将这些启动子片段分别与 GUS 基因连接构建了表达载体 , 并将这些表达载体导入草菇
菌丝体中 , 检测其活性 , 最终显示 3 个片段都有启动 GUS 基因表达的能力 , 其中 Lgpd1 启动子活
性最强 , L ras启动子次之 , Lgpd2 最弱。
关键词:香菇;ras启动子;gpd 启动子;原生质体转化;GUS 基因
中图分类号:S646.120.36 文献标识码:A
香菇 (Lent inus edodes Berk.Sing.)隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina),层菌纲(Hy-
menomycetes),伞菌目(Agaricales),口蘑科(Tricholomataceae),香菇属(Lentinus)[ 1] 。香菇营
养丰富 ,含有维生素 D等许多营养物质和抗癌物质[ 2 ,3] ,且价格较理想 ,故深受广大群众喜爱 。
如何提高香菇的种质以及获得新品种 ,已成为当今香菇育种的重点。
目前 ,食用菌转化体系还不完善 ,原因有很多 ,其中外源基因的表达调控是一个重要的制
约因素。早期担子菌转化借用曲霉的启动子 ,但转化效率低(Mooibroek H 等 , 1990)[ 4] 。为了
提高食用菌的转化效率 ,逐渐采用食用菌本身的调控序列 。对启动子的研究主要集中于使用
强启动子和同源启动子。强启动子有利于提高转化率;同源启动子有利于调控因子的识别 ,减
少甲基化 ,对提高转化率也有利 。食用菌遗传转化所采用的启动子主要有两种:ras基因的启
动子和gpd(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene)基因的启动子 。
食用菌 ras 基因最早从香菇中分离得到[ 5] , ras基因在许多真核生物细胞中都扮演着重
要的角色[ 6] 。ras启动子具有较强的调控外源基因表达的作用。gpd 基因编码的 3-磷酸甘油
醛脱氢酶为糖酵解途径中的一个关键酶 ,在 Saccharomyces cerevisiae 中 ,GPD蛋白的含量达到
细胞中可溶性蛋白总量的 5%[ 7] ,而且 2%～ 5%的 poly(A)+RNA为 GPD mRNA[ 8] ,由此可
见 , gpd 基因的启动子可能为一强启动子 ,属于组成型启动子 ,有很强的控制外源基因转录的
功能 ,在丝状真菌的转化上应用较多。gpd 启动子具有很强的调控异源基因表达的作用[ 9] 。
本试验从香菇总 DNA中克隆启动子片段 ,并进行分析 、鉴定及研究 ,这在利用基因工程
技术培育香菇新品种上具有重要意义 ,为建立香菇外源基因表达系统提供顺式元件 。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
香菇菌株苏香 1号和草菇(Volvariella volvacea)V34购自华中农业大学菌种实验中心国
家重点实验室林俊芳课题组保存。
1.1.2 培养基
菌丝生长基础培养基(PDA培养基):马铃薯 20%,磷酸氢二钾 0.3%,硫酸镁 0.15%,葡
萄糖 2%,琼脂 2%;选择培养基 I:基础培养基+潮霉素(Hygromycin B)40μg/mL ;选择培养
基 II:基础培养基(不加琼脂)+潮霉素 45μg/mL 。
1.1.3 试剂
实验所用限制性内切酶均购于大连宝生物工程公司。pGEM-T Easy Vector Kit购于美国
Promega公司。寡核苷酸引物由上海生工生物技术公司合成 。其它生化试剂和常规试剂均为
国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 香菇总 DNA的提取
收集生长于固体培养基上的香菇菌丝体 ,采用 FDEB法提取香菇菌丝体总 DNA[ 10] 。
1.2.2 香菇特异性启动子的扩增与克隆
1.2.2.1 引物的设计 根据已知 ras 启动子同源序列设计 1 对引物 rasF:5 -CTTCG-
CATAGCGGGAT-3 , rasR:5 -AGAAACAGTCGGCTCCT-3 ;根据已知 gpd 基因上游序列
设计 3个引物 LgpdF 1:5 -CGAAGT TTGAGGTGGT TG-3 , LgpdR:5 -ATTCAAGCAGT-
CAATGGA-3 ,LgpdF2:5 -TATGCTGGT TATCTGAG-3 。
1.2.2.2 PCR扩增 PCR扩增反应体系为 50μL ,模板 DNA 为 100ng ,引物各 25pmol ,2.5 U
Taq聚合酶和 50mmol/L dN TPs。反应参数为:94℃预变性 5min , 94℃变性 50sec , 55℃退火
50sec ,72℃延伸 90sec ,32个循环;最后在 72℃延伸 10min结束反应 。将 PCR扩增产物电泳回
收后连接到 pGEM-T Easy 载体上 ,形成重组质粒 pTR 、pTG1和 pTG2。
1.2.3 启动子(ras和gpd )表达载体的构建
1.2.3.1 接头设计 依据与限制性内切酶 SpeI 酶切后留下的粘性末端碱基相匹配并在接头
中间增加酶切位点(Pst I)的实验要求设计合成 2条寡聚核苷酸:5 -CTAGTATCTAGACT-
GCAGGC-3 (20bp);5 -CATGGCCTGCAGTCTAGATA-3 (20bp)。2条寡聚核苷酸经溶解
退火后即为连接接头 ,其中包括 S peI 、XbaI 、Pst I和 NcoI 4个酶切位点。接头由上海生物工
程公司合成。
1.2.3.2 表达载体构建 将含有目的片段 Lras 、Lgpd1 和 Lgpd2 的重组质粒 pTR、pTG1 、
pTG2分别用 SpeI和 EcoR I进行双酶切反应 ,回收得到启动子片段;再用 EcoR I和 Nco I双
16 食 用 菌 学 报 12 卷
酶切质粒 pCAMBIA1301 ,去除 35S 启动子片段 ,回收目的大片段 。在 T4 DNA 连接酶的作用
下将启动子片段 、pCAMBIA1301大片段与接头连接 ,构建得到含有香菇内源启动子的表达载
体pLRAS 、pLGPD1和 pLGPD2 。表达载体转化受体菌 DH5α进行繁殖扩增 ,之后提取质粒
DNA进行 PCR和酶切鉴定。
1.2.4 ras和gpd 启动子序列分析
ras和gpd 启动子序列采用美国生物技术信息中心 NCBI 的 Blastn进行核酸序列同源性
分析 ,并借助 Neural Network Promoter Prediction软件和 Signal Scan Search Request软件进行
启动子活性分析 。
1.2.5 启动子功能验证
1.2.5.1 表达载体转化草菇原生质体及转化子的筛选 采用电激转化法将含有目的启动子
片段的表达载体 pLRAS 、pLGPD1和 pLGPD2转化草菇的原生质体(原生质体制备过程参考
文献[ 11 ～ 14]),以含有 35S 启动子的表达载体 pCAMBIA1301为对照转化草菇原生质体 。转
化之后 ,先在基础培养基上预培养 5d ,然后将菌斑转接至选择培养基 I 中进行初筛 。将初长
出的新鲜菌丝移入选择培养基 II进行筛选 ,能在液体选择培养基中生长的菌丝即为假定转化
子。
1.2.5.2 假定转化子的 GUS(β-g lucuronidase)活性检测 挑选在选择培养基 II 中生长良好
的菌丝球 ,切取其中一小部分置GUS反应液(含0.1mol/L Na3PO4 缓冲液 , pH 7.0;10mmol/ L
EDTA ,pH7.0;5mmol/L 铁氰化钾;1.0mmol/L X-g luc及 0.1%Triton X-100)中 ,37℃培养过
夜 ,显微镜(Olympus IM T-2)观察 、照相 ,具体方法参照文献[ 15] 。
2 结果与分析
2.1 香菇基因组 DNA的 PCR扩增产物
香菇基因组 DNA的 PCR扩增结果见图 1(A .Lras启动子片段 , B.Lgpd1 启动子片段;
C.Lgpd 2启动子片段),各引物对的 PCR扩增结果是特异的 ,片段分别命名为 Lras 、Lgpd1和
Lgpd2。
图 1 PCR 特异扩增 ras和 gpd 启动子片段
Fig.1 PCR ampli fication of genomic DNA from L .edodes for gpd/ ras promoter fragments
173 期 于晓玲等:香菇 ras和 gpd 启动子的克隆与功能鉴定
2.2 香菇启动子的核苷酸序列分析
目的片段 Lras 、Lgpd1和 Lgpd2的测序结果表明 , Lras片段全长为 715bp , Lgpd1片段为
1056bp , Lgpd2片段为 611bp。片段 Lras 、Lgpd1和 Lgpd2的 blastn序列同源性搜索结果表明 ,
Lras的核苷酸序列与已报道的 ras启动子[ 4]的核苷酸序列同源性达 92%,将其提交GeneBank
(AY453854);Lgpd1和 Lgpd2的核苷酸序列与已报道的 gpd 启动子[ 11]的核苷酸序列同源性
分别达 96%和 97%,这初步说明了这些片段正是我们所要克隆的启动子。这些片段进一步采
用Molecular Analysis Sect ion软件 、Plant cis-acting regulatory DNA elements软件等进行分析 ,
发现序列含有很多真核生物启动子的重要顺式作用元件 ,如 A-box 、ACE 、CAAT-box 、TATA-
box 和GA-motif等;同时 ,每个启动子片段都含有一个或几个启动子的核心序列;采用 Tfsites-
can Service 软件对片段进行转录因子结合位点分析的结果显示 ,序列中含有多个转录因子的
结合位点 ,这些转录因子可能对这些启动子序列的活性有重要的调节作用 。
2.3 Lras、Lgpd1和 Lgpd2三个启动子片段与 GUS基因融合
表达载体 pLRAS 、pLGPD1和 pLGPD2的框架结构如图 2。图中 Promo ter区域分别为 3
个启动子 Lras 、Lgpd1和 Lgpd2 ,nos为终止子 。
图 2 表达载体结构示意图
Fig.2 Construction of the promoter-GUS gene
图 3 假定转化子 GUS活性的组织化学检测
Fig.3 Histochemical assays of GUS expression in putative transformants
18 食 用 菌 学 报 12 卷
2.4 假定转化子 GUS活性的组织化学检测
GUS染色结果表明(图 3 ,图片都是在 10X目镜 ,40X物镜下进行观察 ,3.3X照相目镜进
行显微摄影的结果),草菇假定转化子的菌丝在显微镜下可观察到呈明显的蓝色 ,而空白对照
组(图 3-A:非转基因对照菌丝)的菌丝则未被染成蓝色 ,这说明作者克隆的 Lras 、Lgpd1和
Lgpd2三个启动子片段均具有启动子的活性。从菌丝GUS 染色的颜色深浅(蓝色深浅显示为
墨的浓重程度 ,以下皆同)上分析 ,启动子 Lgpd1的活性最强(图 3-C:pLGPD1假定转化子菌
丝),图3-C中的草菇菌丝几乎完全被染成蓝色 ,说明 Lgpd1有较强的启动外源 GUS 基因表达
的能力;Lras启动子的表达能力次之(图 3-B:pLRAS 假定转化子菌丝), Lgpd2启动子和 35s
启动子的活性最弱(图 3-D:pLGPD2假定转化子菌丝 ,图 3-E:pCAMBIA1301假定转化-子菌
丝)。
3 讨论
典型的真核生物启动子由 TATA框 、CAAT 框和GC框等组成 ,这类启动子活性较高 。大
部分担子菌与酵母菌类似 ,都具有这些典型的结构 。香菇的转化体系尚不完善 ,难以直接利用
香菇来筛选 、克隆基因转录调控元件。本课题组已经建立了较完善的草菇转化体系 ,因此 ,本
实验尝试利用草菇的转化系统来鉴定从香菇基因组克隆的启动子片段 ,同时比较了包括 35S
启动子在内的活性。
本实验获得的 3个香菇启动子片段的功能鉴定结果表明 , Lgpd1启动子比 Lras启动子有
更强的启动外源 GUS基因表达的能力 ,这与 2000年 Hirano T 报道的相一致[ 9 ,16] ;Lgpd2启
动子的活性不及 Lgpd1启动子。采用不同的启动子分析软件对 Lgpd2进行分析显示 , Lgpd2
和 Lgpd1一样含有启动子的核心区域 ,并富含真核启动子的一些常见顺式作用元件 ,例如 ,
G -box 、GC 框 、CAAT 框和GATA框等 ,这说明启动子的分析软件只能是一种辅助的分析启
动子活性的手段 ,不能预测启动子活性强弱。Lgpd2启动子的活性低可能是由于片段较短 ,缺
少了一些重要的表达因子 ,至于在启动子区域中哪一些因子是至关重要的有待于进一步实验
研究 。
本实验的结果还表明 ,35S 启动子在草菇菌丝中的活性较低 ,这可能是因为 35S来源于植
物花椰菜病毒 ,相对食用菌来说为异源启动子 ,而异源启动子往往不容易被宿主细胞 RNA聚
合酶识别结合 ,不能充分调控外源基因的充分表达 ,导致启动子的活性降低[ 16] 。使用同源启
动子有利于调控因子的识别 ,减少甲基化 ,提高转化效率。
参 考 文 献
[ 1 ] 刘春如.香菇的分布概况及生物学特性[ J] .中国林副特产 , 2001 , 11(4):32 ～ 33.
[ 2 ] 曲章义 , 牛美娟 , 郭彩玲.香菇多糖抗肿瘤作用机理[ J] .中国食用菌 , 1997 , 16(5):3 ～ 5.
[ 3 ] 芮 菁.香菇多糖的药理作用和临床应用概况[ J] .天津药学 , 2000 , 12(1):34 ～ 36.
[ 4 ] Mooibroek H , Kuipers AGJ , Sietsma JH , et al.Introduction of hyg romycin B resistance into Schizophy llum
commune:Preferential methylation of donor DNA[ J] .Mol Gen Genet , 1990 , 222:41～ 48.
[ 5 ] Osamu Ishibashi , Kazuo Shishido.Nucleao tide sequence of a ras gene from the basidiomycete Coprinus
cinereus [ J] .Gene , 1993 , 125(2):233～ 234.
[ 6 ] Hori K , Kajiw ara S , Saito T , et al.Cloning , sequence analy sis and transcriptional expression of a ras gene of
193 期 于晓玲等:香菇 ras和 gpd 启动子的克隆与功能鉴定
the edible basidiomycete Lentinus edodes [ J] .Gene , 1991 , 105(1):91～ 96.
[ 7 ] Challen MP , Bhattiprolu GR, Warner PJ.Cloning the Coprumus bilannatus T RP2 gene and it use as a se-
lectable marker in transfo rmation[ J] .Mycology Research , 1994 , 98(2):179 ～ 185.
[ 8] Goodw en W , Pallas JA , Jenlins GI.T ranscripts o f a gene encoding a putative cell w all-plasma membrane link-
er protein are specifically cold-induced in Brassica napus [ J] .Plant Mol Biol , 1996 , 31:771～ 781.
[ 9] Hirano T , Sato T , Yaegashi K , et al.Efficient transformation of the edible basidiomycete Lentinus edodes
w ith a vector using a gly ceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase promo ter to hygromycin B resistance[ J] .
Molecular and General Genetics , 2000 , 263(6):1047 ～ 1052.
[ 10] 刘世强 , 杨丽卿 , 郭丽琼 , 等.草菇 ras 启动子区域的克隆及其序列分析[ J] .食用菌学报 , 2004 , 11
(1):1 ～ 6.
[ 11] 温海洋 , 肖洪东 , 黄剑波 , 等.草菇种内原生质体融合育种研究[ J] .北方园艺 , 2000 , 3:48 ～ 49.
[ 12] 王春晖 , 喻初权 , 张志光.外源 DNA 片段导入草菇原生质体的研究[ J] .食用菌学报 , 1999 , 6(4):1 ～ 6.
[ 13] 张志光 , 李东屏 , 方 芳.丝状真菌原生质体技术研究[ J] .湖南师范大学自然科学学报 , 1998 , 21(1):
60～ 65.
[ 14] 李东屏 , 张志光 , 张天晓.草菇 、银丝草菇原生质分离及再生试验[ J] .湖南微生物学通讯 , 1991 , 1(3):
9 ～ 14.
[ 15] 储成才 , 陈 帅 , 司丽珍.转基因表达的精细调控[ J] .杭州师范学院学报(自然科学版), 2001 , 18(4):
43～ 44.
[ 16] 郭丽琼 , 陈守才 , 林俊芳.食用菌遗传转化研究进展[ J] .食用菌学报 , 2001 , 8(4):47～ 53.
Cloning and Characterization of
ras and gpd Promoters from Lentinus edodes
Yu Xiao-ling1 , Lin Jun-fang1 , 2 , Guo Li-qiong1 ,2 , Wang Shu-chang1
(1State Key Laboratory of T ropical Crop Biotechnology , The Chinese Academy of
T ropical Agricultural Sciences and Institute of T ropical Biological Sciences , Haikou 571101 , China;
2Depar tment of Bioengineering , College of Food Sciences ,
South China Agricultural University , Guangzhou 510640 , China)
Abstract:The promo ter fragments of Lras , Lgpd1 and Lgpd2 were isolated from genomic DNA of Lentinus
edodes by PCR amplification.DNA sequencing results showed that these promo ter fragments have 715bp , 1056bp
and 611bp respectively.Blastn analysis results revealed that Lras , Lgpd1 and Lgpd2 have high homologous with re-
po rted promoters , ras and gpd .Analy sis results showed that they all contain many impo rtant cis-acting regula tory
elements.Fragments of L ras , Lgpd1 and Lgpd2 were constructed respectively with pCAMBIA1301 which 35S pro-
moter was deleted.Then the new expression plasmids containing GUS reporter gene were induced into Volvariella
volvacea by protoplast electroporation.GUS histochemistry assay results showed that Lgpd1 had the strongest pro-
moter activity , Lras had stronger activity and Lgpd2 had slight activity.
Key words:Lentinus edodes;ras promo ter;gpd promoter;P rotoplast transformation;GUS
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