全 文 ：食用菌学报 2006.13(4):10～ 15
收稿日期:2006-10-27 原稿;2006-11-20 修改稿
基金项目:浙江省重点攻关项目“香菇种质资源保存利用与快速分类鉴定关键技术研究”(编号:2005C22057)、“生
物技术在林木共生菌菌种快速分离鉴定上的应用研究”(编号:2004C22032)和院所重大研发专项“森林
食药用真菌 DNA指纹图谱构建及其应用研究”(编号:2006F11003)的部分研究内容
作者简介:付立忠(1974-),男 , 2004 年毕业于浙江大学农业与生物技术学院 , 博士 , 助理研究员 , 主要从事食用菌遗
传育种与生物技术方面的研究 , 发表主笔论文 2 篇。
＊本文通讯作者
文章编号:1005-9873(2006)04-0010-06
香菇 SRAP扩增体系的建立与优化
付立忠1 , 2 , 魏海龙1 , 2 , 李海波1 , 2 , 吴庆其1 , 2 , 吴大丰2 , 吴学谦1 , 2＊
(1浙江省林业科学研究院生物技术研究所 ,杭州 310023;
2丽水市食用菌研究开发中心 ,浙江益圣菌物发展有限公司 , 丽水 323000)
摘　要:为了建立稳定的香菇(Lentinula edodes)SRAP(sequence-r elated amplified polymorphism , 相关序列
扩增多态性)分子标记技术体系 , 以香菇(Lentinula edodes)为材料 , 采用 SDS-CTAB(sodium dodecyl sulfa te-
cetylr ime th ylammonium bromide)法提取菌丝体基因组 DNA , 用琼脂糖检测扩增产物 , 筛选优化了 SRAP 扩
增条件。可用于香菇 SRAP分析的最佳 PCR 条件为 20 μL PCR 反应体系中 , 模板 DNA 25 ng , Buffer l×,
Mg2+2.5 mmol/ L , dNTP Mix ture 0.2 mmol/ L ,引物 0.4 μmo l/ L , Taq DNA 聚合酶 1.5 U。优化后的 S RAP
体系目标条带增多 ,重现性好。
关键词:香菇;分子标记;扩增体系优化;SRAP
中图分类号:S646.130.1　　　　文献标识码:A
　　香菇(Lent inula edodes)作为 1 种可食用的
大型木腐担子菌 ,因其味美 、药用价值高而倍受
国内外消费者的喜爱 ,产量仅次于双孢蘑菇。中
国是香菇人工栽培的发源地 , 产量居世界第一
位 ,有着丰富的香菇种质资源。这些种质资源是
进一步培育优良菌种 、深入开发利用香菇产品的
基础 。但有关这些种质资源遗传关系的研究报
道较少而且不够全面[ 1] 。
近年来 ,以分子标记为重点的植物分子生物
学研究迅猛发展 ,为研究品种之间的遗传差异提
供了新的方法和手段 。目前 , RFLP(限制性片断
长度 多 态 性 , Restrict ion Fragment Leng th
Polymo rphisms)、RAPD(随机扩增 DNA 多态
性 , Random Amplif ied Polymo rphic DNA)、ISS R
(简单序列重复区间扩增多态性 , Inter-Simple
Sequence Repeat)、AFLP(扩增片断长度多态性 ,
Ampli fied Fragment Length Po lymo rphisms)、
SCA R(特 征 性 片 段 扩 增 区 域 , Sequence
Characterized Amplified Region)技术已被大量
的运用在食用菌的遗传研究上 。这些标记虽各
有特点 ,同时也存在实验操作过程复杂 、对 DNA
要求高 、用量大 、费用高或稳定性重复性差 、产率
低等缺点 ,限制了其发展应用 。
SRAP 是由美国加州大学 LI 和 QUIROS[ 2]
于 2001 年发展的 1种基于 PCR反应的新型标
记。该标记利用基因外显子 GC 含量丰富 ,而启
动子和内含子 A T 含量丰富的特点 ,通过独特的
双引物设计对基因的开放阅读框(open reading
f rames ,ORFs)的特定区域进行扩增 ,上游引物长
17 bp ,对外显子进行特异扩增;下游引物长
18 bp ,对内含子区域 、启动子区域进行特异扩增 。
因不同个体 、不同物种的内含子 、启动子及间隔
长度不同而产生多态性。SRAP 技术具有简便 、
稳定 、中等产率 、高共显性 、便于克隆测序目标片
段 、在基因组中分布均匀等特点 ,适用于遗传图
谱构建[ 2 , 3] 、比较基因组学[ 4] 、遗传多样性分
析[ 5 , 6] 、基因定位[ 2] 、杂种优势的预测[ 6] 等诸多研
究领域。SRAP 标记已在马铃薯 、水稻 、苹果 、柑
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2006.04.003
第 4 期 付立忠等:香菇 SRAP扩增体系的建立与优化
橘类果树 、樱桃 、梅子 、油菜 、大蒜 、莴苣 、芹菜[ 2] 、
棉花[ 3] 等植物和水稻稻瘟病[ 7]研究中应用 。
本研究以 22 个香菇栽培品种为试验材料 ,
对SRAP 扩增反应体系的各影响因素进行了优
化 ,为 SRAP 标记在香菇种质资源遗传多样性研
究中的应用提供技术支持 。
1　材料与方法
1.1 供试菌株
表 1　供试菌株及其来源
Table　L.edodes test strain
编号 No. 菌株 S train
1 申香 2 号 Shenxiang-2
2 申香 4 号 Shenxiang-4
3 申香 6 号 Shenxiang-6
4 申香 9 号 Shenxiang-9
5 申香 7 号 Shenxiang-7
6 申香 8 号 Shenxiang-8
7 申香 12 号 Shenxiang-12
8 苏香 Suxiang
9 武香 1 号Wuxiang-1
10 L26
11 L03
12 L66
13 241
14 241-4
15 庆科 20 Q ingke-20
16 Cr02
17 Cr04
18 闵丰 1 号 Minfeng-1
19 沪农 1号 Hunong-1
20 浙香 939-9 Zhexiang-939-9
21 浙香 939-6 Zhexiang-939-6
22 香九 Xiang jiu
　　优化反应体系所用的香菇菌株为申香 4号 、
241-4和沪农 1 号 ,验证优化条件所用的菌株为
表1中 22个菌株 ,其中 20 、21号菌株由吴学谦研
究员提供 ,其它菌株均由谭琦博士提供 。
1.2 基因组 DNA的提取
1.2.1 菌丝体培养
将供试香菇菌株的常规 PDA 斜面菌种转接
至液体培养基(1000 mL 液体培养基 , 马铃薯
200 g ,葡萄糖 20 g , KH2 PO 41 g ,MgSO4 0.5 g ,胰
蛋白胨 1.5 g , pH 自然)中 , 24 ℃、130 r/min 摇
床培养 12 d ,过滤收集菌丝体 ,用滤纸吸干水分
后提取 DNA 。
1.2.2 DNA 提取
按曾大兴[ 8] 的 SDS-CTAB 方法提取基因组
DNA 。 DNA 浓度及纯度用 GeneQuant Pro
DNA/ RNA(GE Healthcare)进行检测。稀释至
所需浓度后 , -20 ℃保存。
1.2.3 主要试剂和引物
dN TP Mixture 、10 ×Reaction Buf fer 、Taq
DNA 聚合酶 、MgCl2等 PCR扩增所用试剂购自
杭州博日科技有限公司 , DNA marke r(Gene
RulerTM 100 bp Ladder Plus)购自上海生工生物
工程技术服务有限公司 , SRAP 引物的合成亦由
上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.3 SRAP扩增反应条件优化
1.3.1 基本扩增反应体系
10×Reaction Buf fer(含 15 mmol/ L M g2+)
2μL ,dN TP Mixture(2.5 mmol/ L each)1.6 μL ,
Mg 2+(25 mmol/L)0.8 μL ,引物(10 μmol/ L)
0.8 μL ,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.3 μL ,模板
DNA(25 ng/μL)1 μL ,最后用 ddH 2O 将总体积
补至 20 μL。
1.3.2 扩增反应体系设计
根据香菇及相关作物研究报道 ,设计 Mg2+
浓度(1.5 、2 、2.5 、3 和 3.5 mmo l/L)、dNTP
Mix ture 浓度(0.1 、0.2 、0.3 和 0.4 mmo l/L)、
Taq DNA 聚合酶(0.5 、1 、1.5 和 2 U/20 μL)、引
物浓度(0.2 、0.3、0.4 、0.5 、0.6 、0.8和 1.0μmol/L)、
模板 DNA 浓度 (5 、 15 、 25 、 35 、 45 、 55 和
65 ng/20 μL)。
1.3.3 扩增程序
SRAP 扩增反应在杭州博日科技有限公司
XP 基因扩增仪上进行 。94 ℃预变性 3 min ,然
后前 5 个循环为 94 ℃变性 l min , 35 ℃退火
l min ,72 ℃延伸 90 s ,后30个循环仅将退火温度
升为 50 ℃,最后 72 ℃延伸 8 min 。反应体积
20 μL ,用 Me1和 Em16引物组合进行 PCR扩增
以确定最佳反应体系 。取4.5 μL SRAP 扩增产
物与溴酚蓝混合后在含有 EB(0.5 g/mL)的
1.5%的琼脂糖凝胶(1×TAE)上电泳 ,扩增图谱
采用上海培清科技有限公司 JS-380B全自动数码
凝胶成像分析仪摄取 。
2　结果与分析
2.1 模板 DNA浓度对 SRAP扩增的影响
　　从图 1可以看出 , 3个菌株在供试 7个模板
11
食　用　菌　学　报 第 13 卷
图 1　模板 DNA浓度对 SRAP 扩增结果的影响
Fig.1　Effect of genetic DNA concentration on SRAP amplif ication products
M:标记;CK:阴性对照;2 , 14 , 19:菌株编号;a , b , c , d , e, f , g:模板 DNA 浓度分别为 5 、15、25、35、45、55 和 65 ng DNA/20 μL
M:Marke r(Gene RulerT M100 bp DNA Ladder Plus);CK:Contro l;2 , 14 , 19:S train No.;a , b , c , d , e , f and g:
DNA concentration is 5 , 15 , 25 , 35 , 45 , 55 and 65 ng DNA/ 20 μL , r espectively
图 2　Mg2+浓度对 SRAP 扩增结果的影响
Fig.2　Effect of Mg2+ concentration on SRAP amplification products
M:标记;CK:阴性对照;2 , 14 , 19:菌株编号;a , b , c , d , e:Mg2+浓度分别为 1.5、2 、2.5 、3 和 3.5 mmol/ L
M:Marke r(Gene RulerT M100 bp DNA Ladder P lus);CK:Contr ol;2 , 14 , 19:Strain No.;a , b , c, d and e:Mg 2+
concentra tion is 1.5 , 2 , 2.5 , 3 and 3.5 mmol/ L , r espectively
DNA 浓度(5 ～ 65 ng/20 μL)下 , SRAP 产物几乎
完全一致 ,没有明显的差异 。为了节省 DNA 用
量和方便取样 ,本研究使用在 20 μL 体系中加入
25 ng DNA 模板。
2.2 Mg2+浓度对 SRAP扩增的影响
　　试验结果(见图 2)表明 , Mg2+浓度为
1.5 mmol/ L时 ,菌株申香 4号和 241-4几乎无扩
增产物 ,沪农 1号扩增条带清晰但条带很少;随
着 Mg2+浓度的增加 ,扩增产物谱带数也增加。
Mg 2+浓度为 2.5 mmol/L 时 , SRAP 条带数丰
富 、清晰且稳定 ,故确定为最适浓度 。
2.3 dNTP Mixture浓度对 SRAP扩增的影响
　　试验结果(见图 3)表明 ,不同 dN TP M ix ture
浓度扩增结果差别很大 ,在 0.1 mmol/ L 时 ,供试
3个菌株扩增产物谱带均较弱 , 0.2 mmol/L 和
0.3 mmol/ L时扩增效果较好 ,其中 0.2 mmo l/L
时谱带更为清晰 ,0.4 mmol/L 时谱带变弱 ,这一
点申香 4号菌株表现尤为明显 ,几乎没有扩增产
物。由此说明 ,dNTP M ix ture 作为 PCR扩增的
原料 ,必须达到一定浓度才能满足要求 ,但过高
也会与 T aq DNA 聚合酶竞争 Mg2+ , 造成 Taq
DNA 聚合酶活性降低[ 9] ,所以 dN TP Mixture浓
12
第 4 期 付立忠等:香菇 SRAP扩增体系的建立与优化
图 3　dNTP 浓度对 SRAP 扩增结果的影响
Fig.3　Ef fect of dNTP concentration on SRAP amplification products
M:标记;CK:阴性对照;2 , 14 , 19:菌株编号;a , b , c , d:dNTP Mix ture浓度分别为 0.1 、0.2、0.3 和 0.4 mmo l/ L
M:Marke r(Gene RulerT M 100 bp DNA Ladder P lus);CK:Control;2 , 14 , 19:S train No.;a , b , c and d:dNTP
Mix ture concent ration is 0.1 , 0.2 , 0.3 and 0.4 mmol/ L , respectiv ely
度确定为 0.2 mmol/L。
2.4 引物浓度对 SRAP扩增的影响
　　从图 4可以看出 , 3个菌株在供试 7个引物
浓度下 ,均能扩增出一致的条带 ,随着引物浓度
的升高 , 扩增条带由弱到强 , 当引物浓度为
0.4 μmo l/L时 ,反应稳定 ,条带清晰。考虑到引
物浓度过高会增加引物二聚体的形成几率 ,故将
引物浓度确定为 0.4 μmol/L。
2.5 Taq DNA聚合酶对 SRAP扩增的影响
　　从图 5可以看出 ,当 Taq DNA 聚合酶用量
为 0.5 U 时 ,扩增所得谱带较弱 ,并出现条带缺
失现象 ,当 Taq DNA 聚合酶用量为 1 U 时能够
扩增出一定数量的条带 ,但是有些条带较模糊 ,
而当 Taq DNA聚合酶用量为 2 U 时 ,扩增条带
较 Taq DNA 聚合酶用量为 1.5 U 时多态性降
低 ,扩增条带减弱 ,清晰度下降 。因此确定 SRAP
扩增反应体系中 Taq DNA 聚合酶的用量为
1.5 U比较合适。
图 4　引物浓度对 SRAP 扩增结果的影响
Fig.4　Effect of primer concentration on SRAP amplification products
M:标记;CK:阴性对照;2 , 14 , 19:菌株编号;a , b , c , d , e , f , g:引物浓度分别为 0.2 、0.3 、0.4 、0.5、0.6、0.8和 1.0 μmol/ L
M:Marke r(Gene RulerT M100 bp DNA Ladder Plus);CK:Contro l;2 , 14 , 19:S train No.;a , b , c , d , e , f and g:
Primerconcentration is 0.2 , 0.3 , 0.4 , 0.5 , 0.6 , 0.8 and 1 μmol/ L , respectiv ely
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食　用　菌　学　报 第 13 卷
图 5　Taq DNA 聚合酶对 SRAP 扩增结果的影响
Fig.5　Effect Taq DNA polymerase concentration on SRAP amplif ication products
M:标记;CK:阴性对照;2 , 14 , 19:菌株编号;a , b , c , d:Taq DNA 聚合酶浓度分别为 0.5 、1 、1.5 和 2 U/ 20 μL
M:Marke r(Gene RulerT M100 bp DNA Ladde r Plus);CK:Contro l;2 , 14 , 19:S train No.;a , b , c and d:P rimer
concentra tion is 0.5 , 1 , 1.5 and 2 U/20μL , respectiv ely
图 6　Me1 、Em16 引物的 SRAP扩增谱带
Fig.6　SRAP amplification profiles of 22 L.edodes genotypes using the primer pair Me1/ Em16
M:标记;CK:阴性对照;1 ～ 22:菌株编号
M:Marker(Gene RulerT M100 bp DNA Ladder P lus);CK:Contr ol;1 ～ 22:Strain No.
图 7　Me1、Em3 引物的 SRAP 扩增谱带
Fig.7　SRAP amplification profiles of 22 L.edodes genotypes using the primer pair Me1/Em3
M:标记;CK:阴性对照;1 ～ 22:菌株编号
M:Marker(Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder P lus);CK:Control;1 ～ 22:Str ain No.
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第 4 期 付立忠等:香菇 SRAP扩增体系的建立与优化
2.6 SRAP-PCR反应体系的确立
　　以上述确定条件 , 用 Me1 、Em16 和 Me1 、
Em3 2个组合引物在 22个供试香菇菌株中进行
扩增验证(图 6 、图 7)。由图 6 、图 7可见扩增谱
带清晰 ,菌株间有不同程度的多态性。
从结果稳定性和经济性出发 , 确立香菇
SRAP 扩增最佳反应体系模板 DNA 25 ng ,
Buffer l ×, Mg2+ 2.5 mmol/L , dN TP M ix ture
0.2 mmol/ L ,引物 0.4 μmo l/L , Taq DNA 聚合
酶 1.5 U ,反应总体积为 20 μL 。
3　讨　论
　　影响 PCR扩增效果的技术环节主要包括扩
增程序 、DNA的提取 、扩增体系和扩增产物的检
测。通常 ,扩增程序对 PCR扩增效果影响较大 ,
但是由于 SRAP 引物具有通用性 ,不同作物采用
的引物组合往往是相同的 , 因此扩增程序对
SRAP-PCR扩增结果影响不大 。目前在 SRAP-
PCR中使用的扩增程序有 2 种 。第 1 种是 LI
等[ 2]提出的退火变温法 ,即最初 5 个循环的退火
温度设为 35 ℃,后 30 个循环的退火温度升高为
50 ℃。第 2 种是 BUDAK 等[ 10] 所使用的程序:
94 ℃变性 l min , 47 ℃退火 1 min , 72 ℃延伸
1 min(35个循环), 72 ℃5 min。前者因为后 30
个循环中所用的退火温度比后者高 ,扩增结果更
稳定 。本试验采用的扩增程序与第 1种相近 ,最
初退火温度为 35 ℃的循环数仍为 5 ,随后退火温
度为 50 ℃的循环数则设定为 30 ,获得了较理想
的试验结果。
SRAP 标记是基于 PCR 标记系统的 , 故
PCR 扩增体系中 DNA 、Mg 2+ 、引物 、dNTP
Mix ture 、Taq DN A聚合酶等各组分的用量会影
响扩增结果 。本试验在优化 SRAP 扩增体系时
发现 , Mg 2+ 、引物 、dN TP M ix ture、Taq DNA 聚
合酶作为 PCR扩增的原料 ,有一个相对适宜的用
量范围 ,浓度过低 ,不能满足扩增要求 ,浓度过
高 ,组分间可能会产生竞争 ,影响扩增效果。在
对模板 DNA 进行优化时发现 SRAP 扩增对模板
DNA 的浓度要求较低 ,与任羽等对辣椒[ 11] 、武志
朴对小麦[ 12] 的研究结果类似 ,说明用 SDS-CTAB
法提取的 DNA 完全可以满足扩增的需要。
SRAP一般使用 PAGE 电泳检测 PCR产物 ,
本试验采用琼脂糖凝胶电泳检测 ,亦获得较丰富的
多态性。本试验优化的 SRAP 扩增反应体系在 22
个供试香菇菌株中均获得稳定 、清晰谱带 ,菌株间
表现不同程度多态性。SRAP 标记系统建立为该
技术在香菇等食用菌遗传多样性 、系统发育和育种
研究的广泛应用奠定了良好的基础。
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