全 文 ：第 33卷　第 5期
2009年 9月
南京林业大学学报(自然科学版)
JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalScienceEdition)
Vol.33, No.5
Sept., 2009
　收稿日期:2008-11-18　　　　修回日期:2009-04-28
　基金项目:江苏省科技支撑项目(BE2008404)
　作者简介:汤诗杰(1969—),副研究员 ,博士 ,研究方向为观赏植物与保护生物学研究。 E-mail:tangshijie69@yahoo.com.cn。
　引文格式:汤诗杰 ,郑玉红 ,汤庚国.基于 ISSR标记的 5个南京椴种群的遗传多样性分析 [ J] .南京林业大学学报:自然科学版 ,
2009, 33(4):51-54.
基于 ISSR标记的 5个南京椴种群的遗传多样性分析
汤诗杰 1 ,郑玉红1 ,汤庚国 2
(1.江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园),江苏　南京　210014;
2.南京林业大学森林资源与环境学院 ,江苏　南京　210037)
摘要:采用 ISSR标记技术分析了 5个南京椴种群共 147单株的遗传多样性。从 55条简单重复序列引物中筛选
出 11条多态性引物 ,共扩增出 80条带 , 其中 76条多态性带 , 多态性比率为 95.00%, 平均每条引物可扩增出7.0
条带。南京椴 Shannon多样性指数变化范围为 0.211 7 ～ 0.322 7,物种水平多样性为 0.407 7;Nei基因多样性为
0.140 5 ～ 0.211 9,物种水平为 0.264 3;有效等位基因数的变异范围为 1.240 3 ～ 1.356 6,物种水平的有效等位
基因数为 1.432 6。 AMOVA遗传变异巢式方差分析结果表明种群间变异占总变异的 34.99%, 种群内个体间的
变异占总变异的 65.01%,约为群体间变异的 2倍 , 说明南京椴群体内个体间的变异在其遗传变异中占主导地
位。遗传变异分析表明:种群内和种群间的变异系数分别为 0.257 1和 0.176 0;物种水平的基因分化系数为
0.315 4,种群间的基因流 Nm为 1.085 5。基于遗传相似系数的 UPGMA聚类分析将 5个种群明显聚为 3支。
关键词:南京椴;ISSR;遗传多样性;基因分化
中图分类号:S722　　　　文献标志码:A　　　　文章编号:1000-2006(2009)05-0051-04
StudyongeneticdiversityoffivepopulationsofTiliamiqueliana
Maxim.byusingISSRmarker
TANGShi-jie1 , ZHENGYu-hong1 , TANGGeng-guo2
(1.InstituteofBotany, JiangsuProvince＆ChineseAcademyofSciences, Nanjing210014, China;2.ColegeofForestResourcesand
Environment, NanjingForestryUniversity, Nanjing210037, China)
Abstract:GeneticdiversitiesforfivepopulationsofTiliamiquelianainChinawerestudiedbyusingISSRmarker.
Eightylociweregeneratedwith11 simplesequencerepeatprimersscreeningfrom 55 primers, outofthem, 76 were
polymorphicandthepercentageofpolymorphicbandswas95.00%;witheachprimersamplified7.0 bandsonaverage.
Shannonsindicesofdiversitywas0.407 7amongthespecieslevelwiththerangeof0.211 7— 0.322 7 amongpopula-
tions;Neisgenediversitywas0.264 3 amongthespecieswiththerangeof0.140 5— 0.211 9amongpopulations;the
effectivenumberofalleleswas1.432 6amongthespecieswiththerangeof1.240 3— 1.356 6amongpopulations.The
geneticvariationamongindividualswas65.01%, whichwasabouttwiceofthatamongpopulations(34.99%)by
AMOVA.Theresultsrevealedthatvariationamongindividualswasdominant.Geneticvarianceanalysisshowedthatthe
genediversityofspeciesandgenediversitywithinpopulationswere0.257 1and0.176 0.Thecoefficientofgenedifer-
entiationwas0.315 4 atspecieslevel, andthegeneflowwas1.085 5.TheresultsconsistedwiththatofAMOVA.Clus-
teranalysisindicatedthatfivepopulationscouldbedividedintothreegroups.Theresultsprovidedmoleculardataforthe
reasonableexploitation, utilizationandmolecularecologyofT.miquelianaresources.
Keywords:TiliamiquelianaMaxim.;inter-simplesequencerepeat;geneticdiversity;genedifferentiation
南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)为椴树科椴树属植物 [ 1] ,产于我国江苏 、浙江 、安徽 、江西等省 ,为庭
荫树 、行道树和蜜源树种 [ 2] ,更是一种优良的园林树种并具有广阔的应用前景 [ 3] 。根据对南京牛首山 、安
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 33卷
徽皇藏峪自然保护区和江苏宝华山等地的南京椴群落调查分析表明 ,群落中南京椴处于生长衰退期 ,天然
更新缺乏 ,在群落中处于很不稳定的地位 ,萌蘖是维持种群个体数量的主要方式 [ 4 -6] 。对南京椴的繁殖方
式初步研究结果表明种子繁殖和硬枝扦插繁殖很困难 [ 7] 。由于生理休眠的原因造成南京椴种子繁殖困
难 ,其果皮和种子中均存在萌发抑制剂;采取剪破种皮 、热水处理以及变温处理 ,均能不同程度打破种子休
眠 [ 8-9] 。这为南京椴种质资源的保持奠定了理论基础。
ISSR(inter-simplesequencerepeat,简单重复序列间区)目前已广泛用于植物的品种鉴定 、遗传作图 、遗
传多样性 、进化及基因定位等方面的研究 [ 10 -14] 。采用 ISSR分子标记研究南京椴遗传多样性 ,目前国内尚
不多见 。为此 ,笔者对 5个南京椴种群进行 ISSR分子标记研究 ,旨在探讨南京椴 DNA分子水平的变异和
遗传多样性 ,为南京椴的种群保护策略研究提供依据。
1　材料与方法
1.1　供试材料
表 1　南京椴 ISSR分子标记实验材料
Table1　MaterialsforISSRmolecularmarker
ofT.miqueliana
样品号
sample
采集地
locality
经度和纬度
longitudeandlatitude
海拔 /m
elevation
单株数 /株
individuals
1 宝华山 119°05′E, 32°10′N 156～ 320 38
2
皇藏峪自
然保护区 117°06′E, 34°06′N 180～ 248 37
3 紫金山 118°50′E, 32°02′N 54～ 370 20
4 牛首山 118°44′E, 31°53′N 186～ 209 29
5 琅琊山 118°18′E, 32°12′N 120～ 238 23
　　野外采集江苏 、安徽两省 5个种群(表 1)共 147
个南京椴单株叶片 ,实验选取植株生长状况良好的健
康嫩叶 , 70%的酒精擦去叶片表面的灰尘 ,去掉主脉 ,
提取总 DNA。
表 2　ISSR的引物序列及扩增结果
Table2　ISSRprimersandtheiramplificationresults
引物
primer
序列(5 -3 )
sequence
总位点数
totalsites
多态性位点数
polymorphic
sites
多态位点
百分率 /%
percentage
ISSR-8 (ATG)6 6 5 83.33
ISSR-9 (CTC)6 7 7 100.00
ISSR-17 (GACA)4CA 9 8 88.89
ISSR-24 (AC)8TC 6 6 100.00
ISSR-32 (AG)8AC 9 9 100.00
ISSR-43 (AC)8CT 6 6 100.00
ISSR-52 (TG)8GA 3 2 66.67
ISSR-58 (AG)8GA 9 9 100.00
ISSR-63 (AG)8TG 7 7 100.00
UBC-810 (GA)8T 10 9 90.00
UBC-825 (GGGGT)3 8 8 100.00
平均 7.27 6.00 95.00
1.2　实验方法
参照 Paterson等 CTAB法提取总 DNA[ 15] 。 DNA
溶解于灭菌双蒸水中 ,低温(-20℃)贮藏 ,备用 。
ISSR-PCR扩增与检测时 ,在 PE-9700 PCR仪
上进行 PCR, 反应条件参照改进的周延清等的方
法 [ 16] , 20 μL的反应体系包括 1 ×TagDNA酶缓冲液(10mmol/LTris-HCl, 50 mmol/LKCl, 0.1%TrionX-
100, pH=8.4), 2.5mmol/LMgCl2 , 1.0nkatTag酶 , 50ng模板 , 0.4μmol/L引物 ,各 0.4mmol/L的 dATP、
dGTP、dCTP和 dTTP。 PCR程序为:95℃预变性 3min;95℃变性 30s, 58℃退火 40s, 72℃延伸 1min, 35个
循环;最后 72℃保温 7 min, 4℃保存。 PCR产物在 1.2%的琼脂糖胶中电泳 1 h,溴化乙啶(EB)染色 ,凝胶
成像系统拍照。
引物筛选上海生物工程技术有限公司设计生产的 ISSR引物 55个 ,选取其中扩增条带丰富 、信号强的
11个引物进行扩增 。
1.3　数据分析
根据电泳图谱中 DNA条带的有无 , 将 ISSR扩增结果转化为二元数据(有带的量化为 1, 无带的量化
为 0)计算多态性。应用 POPGENE软件计算有效等
位基因数(Ne), Neis基因多样性指数(h), Shannon
多样性指数(I);以 UPGMA法对样品间的亲缘关系进
行聚类分析 。基于等位基因频率 ,计算基因分化系数
(Gst)和基因流(Nm)[ 16] 。
2　结果与分析
2.1　南京椴种群的 ISSR-PCR扩增结果
11条引物共扩增出 80个位点 ,平均每条引物扩
增出 7.27个位点 ,其中 76个多态性位点 ,多态百分
率(Percentageofpolymorphicsites, PPS)高达 95.00%
(表 2)。除引物 ISSR-8、ISSR-17和 ISSR-52各扩
增出 1条共有带外 ,其余引物扩增出的位点全部为多
态性位点。引物 UBC-810的扩增结果见图 1。
52
　第 5期 汤诗杰 , 等:基于 ISSR标记的 5个南京椴种群的遗传多样性分析
图 1　引物 UBC-810扩增的图谱
Fig.1　ISSRamplificationproductsgeneratedbyprimerUBC-810
1～ 38为江苏宝华山种群;39～ 75为安徽皇藏峪种群;76～ 95为江苏紫金山种群;96～ 124为江苏牛首山种群;125～ 147为安徽琅琊山种群
2.2　南京椴种群的遗传多样性分析
图 2　5个南京椴种群的聚类分析结果
Fig.2　Dendrogrambasedonthegeneticsimilaritycoef-
ficientsof5 populationsofT.miqueliana
表 3　5个南京椴种群的遗传多样性
Table3　Geneticdiversityamongthe5populationsof
T.miquelianabasedonISSRmarker
样品
sample
多态性条
带数量
number
多态性条带
百分率 /%
percentage
Ne h I
1 57 71.25 1.356 6 0.211 9 0.322 7
2 56 70.00 1.314 5 0.194 0 0.301 5
3 45 56.25 1.294 2 0.177 1 0.270 1
4 41 51.25 1.269 1 0.156 7 0.237 2
5 35 43.75 1.240 3 0.140 5 0.211 7
种内平均值 — — 1.432 6 0.264 3 0.407 7
种内标准误 — — 0.339 2 0.167 9 0.222 0
　　注:Ne.有效等位基因数 , h.Neis基因多样性指数(1973);
I.Shannons指数。
表 4　5个南京椴种群的遗传相似系数和遗传距离
Table4　Neisgeneticidentityandgeneticdistance
of5 populationsofT.miquelianabased
onISSRmarker
样品 sample 1 2 3 4 5
1 — 0.839 6 0.842 5 0.884 5 0.802 3
2 0.174 8 — 0.956 2 0.882 8 0.896 1
3 0.171 4 0.044 8 — 0.905 5 0.893 5
4 0.122 8 0.124 7 0.099 3 — 0.900 9
5 0.220 3 0.109 7 0.112 6 0.104 4 —
　　注:右上方为遗传相似系数 ,左下方为遗传距离。
　　南京椴各种群的遗传多样性和分化指数见表 3。
根据 PPB值 ,各种群遗传多样性由低到高排列为:安
徽琅琊山 、江苏牛首山 、江苏紫金山 、安徽皇藏峪 、江
苏宝华山。而根据 I值各种群遗传多样性高低排列与
按 PPB值的排序相同 。AMOVA遗传变异巢式方差分
析结果表明 ,种群间变异占总变异的 34.99%(平方和
416.67,均方104.17,方差组成 4.17),种群内个体间
的变异占总变异的 65.01%(平方和 929.24,均方
7.74,方差组成 7.74),约为群体间变异的 2倍 。说明
南京椴群体内个体间的变异在其遗传变异中占主导
地位。
2.3　5个南京椴种群的遗传距离和聚类分析
基于 ISSR标记的 5个南京椴种群遗传距离和遗
传相似系数见表 4。
基于遗传相似系数和遗传距离 ,通过 UPGMA法
聚类分析得到了 5个南京椴种群的聚类图(图 2)。 5
个种群明显聚为 3支:江苏宝华山种群首先独立出
来;安徽皇藏峪种群和江苏紫金山种群聚为一支;江
苏牛首山种群和安徽琅琊山种群聚为一支。 5个南京
椴种群的聚类结果没有表现出明显的地域性特征。
2.4　南京椴种群的基因分化
用 POPGENE软件在假设遗传平衡条件下对 5个
南京椴种群进行分析 ,计算出种水平(Ht)和种群水平
(Hs)的基因多样性分别为 0.257 1和 0.170 6。种群
间基因分化系数(Gst)为 0.315 4,即在总的遗传变异
中有 31.54%存在于群体间 ,而 68.46%的变异都存在
以群体的内部 ,这与 AMOVA方差分析的结果一致。
基因流(Nm +)为 1.085 5,说明种群间的遗传交换较
多 ,这与南京椴的生物学性质有关 。作为一种优良的
蜜源植物 ,昆虫的传粉在一定程度上加速了种群间的
基因交流 ,使种群间遗传相似性相对较高 。
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 33卷
3　讨　论
(1)南京椴种群间的遗传与分化 。虽然 5个南京椴种群 ISSR多态性条带百分率高达 95.00%,但各
种群内多态性条带百分率的平均值仅为 58.50%,其中安徽琅琊山种群内 PPB值仅 43.75%,宝华山种群
的 PPB值最高 ,也仅为 71.25%,这表明南京椴的遗传变异主要存在于种群间。其种群内部基因分化系数
为 0.315 4,也说明了这一点。但作为一种狭域分布的树种 ,南京椴种群间的遗传变异并不大 , 5个种群遗
传距离的平均值仅为 0.131 1;安徽皇藏峪种群和安徽琅琊山种群间的遗传距离最远 ,也仅 0.220 3,安徽
皇藏峪种群与江苏紫金山种群的遗传距离只有 0.044 8,这可能与南京椴本身的生物学特性有关 ,作为一
种重要的蜜源植物 ,昆虫的传粉在一定程度上加速了各种群间的基因交流 , 5个南京椴种群的基因流为
1.085 5,种群间的基因分化系数为 0.315 4,也从另一方面证实了这一点。也可能是基于这种频繁的基因
交流 , 5个种群的聚类分析结果未出现明显的地域特征 。
(2)南京椴的遗传多样性及其保护 。南京椴栽培历史悠久 ,用途广泛 ,而野生资源十分匮乏 ,因此 ,采
取保护性开发利用 ,维持南京椴资源可持续利用非常必要。有关研究表明 ,对于一个基因流比较小 , Gst值
为 0.60的物种 ,至少要取样 6个种群才能保存其 95%的遗传多样性;而对 Gst值为 0.20的物种 ,要达到同
样的效果则只需要取样 2个种群就足够 [ 17] 。根据南京椴 Gst值 ,必须保存江苏牛首山 、江苏紫金山 、安徽
皇藏峪 、江苏宝华山等几个遗传多样性稍高的种群才可以保存南京椴的种质多样性。
[ 　参　考　文　献　]
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(责任编辑　郑琰燚)
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