全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology，2013，33(11) :32-37
碳源和氮源对木蹄层孔菌产漆酶的
影响及酶学性质研究*
尚 洁1，2 吴秋霞2 练小龙2 王秋玉＊＊
(1 东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150040 2 北方民族大学生物科学与工程学院 银川 750021)
摘要 对不同碳源和氮源及碳氮比对木蹄层孔菌产漆酶的影响进行了研究，以提高漆酶产量，同
时分析了该漆酶的酶学性质。漆酶合成的最适碳源是麦麸，最适氮源是蛋白胨，C∶ N 为10． 4，优
化后漆酶产量增加了约 7． 88 倍;反应最适 pH为 3． 0，最适反应温度为 50℃，Km 为 0． 20 mmol /L，
Vmax为 2． 58 mmol /L·min;DTT 0． 1mmol /L和 NaN3 10mmol /L 几乎能抑制漆酶全部活性，终浓度
为 10mmol /L的 Ba2 +，Ca2 +，Co2 +和 Fe2 +也几乎能抑制该酶的全部活性。该研究将为木蹄层孔菌
漆酶的生产及在环境工程领域的应用提供基础信息。
关键词 木蹄层孔菌 漆酶 碳源和氮源 酶学性质
中图分类号 X172
收稿日期:2013-06-14 修回日期:2013-07-15
* 黑龙江省科技攻关重大项目资助(GA06B301)
＊＊通讯作者，电子信箱:wqyll@ sina． com
漆酶(EC 1． 10． 3． 2)是一类含铜氧化酶，现已发现
存在于多种植物和微生物中。漆酶也是白腐真菌降解
木质素的主要酶之一［1］。白腐真菌大多合成过氧化氢
酶和多酚氧化酶，它是已知的唯一能将木质素降为 CO2
和 H2O的一类微生物。白腐真菌酶系是非特异性和非
立体结构选择性酶，具有独特的降解机理，除对木质素
有降解作用以外，还对众多结构各异的有机物大分子
物质如多芳香族化合物［2］、氯化芳香族化合物、农药和
染料等表现出独特的降解敏感性。白腐真菌由于其独
特的降解能力，展现了巨大的潜在应用前景，引起了学
术界和工业界的极大兴趣。
木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)是担子菌纲
(Basidiomycetes)的一种白腐真菌。木蹄层孔菌降解木
质素所产的酶主要是漆酶(Lac)和锰过氧化物酶
(Mnp) ，而木质素过氧化物酶(Lip)所产的量很少。刘
欣等［3］研究发现木蹄层孔菌具有改造成造纸业原料处
理的工程菌的潜在优势。现今，白腐真菌己被广泛地
应用于污染物处理、染料脱色、生物燃料、制浆造纸、食
品和化妆品等多个领域［4-6］。
本文以木蹄层孔菌为材料，研究不同碳源、氮源对
白腐真菌木蹄层孔菌产漆酶的影响，同时分析了粗酶
液的酶学性质，为进一步提高该菌漆酶产率、降低生产
成本和漆酶工业化生产与应用提供研究基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
木蹄层孔菌采自东北林业大学帽儿山实验林场，
保存于东北林业大学遗传学实验室。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:马铃薯 200g，葡
萄糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水定容到 1L，自然 pH。
液体培养基:以 Tien＆Kirk［7］培养基为基础培
养基。
1． 2 粗酶液的制备
将木蹄层孔菌接种到 PDA 培养基上，培养 7d，待
菌丝铺满培养皿，取 2 个直径为 6mm的菌饼，置于装有
15ml液体培养基的 250ml 三角瓶中，于 28℃避光静置
培养。振荡培养时，将菌种接入装有 45ml 液体培养基
的 250ml的锥形瓶中，每瓶接种 6mm直径的菌饼 6 个，
置于 28℃，转速 180r /min 的摇床中培养。分别取培养
液，10 000 r /min，4℃离心 5min，取上清液，即为粗酶液。
1． 3 漆酶活力的测定
林俊芳等［8］的研究表明，采用 ABTS法作为测定漆
酶酶活的方法较具合理性和科学性。漆酶酶活定义为
2013，33(11) 尚 洁 等:碳源和氮源对木蹄层孔菌产漆酶的影响及酶学性质研究
1min内催化氧化 1 μmol /L ABTS所需的酶量为 1 个酶
活力单位(IU)。测定方法:向 0． 7ml 去离子水中加入
1mmol /L的 ABTS 溶液 1． 5ml，100mmol /L 的柠檬酸缓
冲液(pH3)0． 3ml 和 0． 5ml 的粗酶液［9］。在 30℃条件
下，测定波长为 420nm 处 2min 内吸光光度值的变化
率。已知 420nm处 ABTS摩尔消光系数 ε420 = 3． 6 × 10
4
L /mol·cm。
1． 4 碳源和氮源正交试验
按 L20(42)进行正交表设计，选择单因子的最佳碳
源和氮源进行 2 因子 4 个水平的正交试验。
1． 5 酶反应的最适 pH和 pH稳定性
在 4℃下，将粗酶液分别置于 pH1，1． 5，2，2． 5，3，
4，5 缓冲液中，测定漆酶酶活，分析酶反应的最适 pH
值。同时，分别于 1h 和 24h，取各 pH 缓冲液中的粗酶
液，测定漆酶酶活，研究漆酶的 pH稳定性。
1． 6 酶反应的最适温度和热稳定性
取最适 pH 值，分别测定 20，30，40，50，60，70，80，
90，100℃条件下漆酶酶活，研究酶反应的最适温度。
同时，将粗酶液在 20，30，40℃下分别保温 1h 和 24h 测
定漆酶酶活，研究漆酶的热稳定性。
1． 7 金属离子和抑制剂对酶反应的影响
在粗酶液中分别添加 K +，Na +，Ca2 +，Mg2 +，Cu2 +，
Mn2 +，Ba2 +，Zn2 +，Fe2 +，Co2 +，使其终浓度为 1mmol /L、
10mmol /L，30℃保温 1h后在最适 pH下测定漆酶酶活，
设未添加金属离子的粗酶液的酶活为 100%。
在粗酶液中分别添加 DTT(二硫苏糖醇) ，EDTA，
NaN3，使 DTT终浓度为 0． 1mmol /L，1mmol /L，EDTA 和
NaN3 终浓度为 1mmol /L，10mmol /L。30℃保温 1h后在
最适 pH下测定漆酶酶活，设未添加抑制剂的粗酶液的
酶活为 100%。
1． 8 漆酶的动力学研究
在 30℃和最适 pH的条件下，测定不同 ABTS 浓度
(0． 01，0． 02，0． 05，0． 1，0． 15，0． 2，0． 25，0． 3 mmol /L)
下粗酶液中的漆酶酶活。
2 结果与分析
2． 1 振荡培养与静置培养两种发酵方式的比较
木蹄层孔菌在振荡培养和静置培养两种发酵方式
下，酶活随培养时间的变化见图 1。
从图 1 可知，木蹄层孔菌在静置培养和振荡培养
下，产漆酶能力显著不同，静置培养时的最大酶活为
165． 76U /L;振荡培养时的最大酶活为 48． 72U /L，且在
图 1 静置和振荡培养对木蹄层孔菌产漆酶的影响
Fig． 1 Laccase production in shake
and static culture of F． fomentarius
第 9d酶活都达到最高值，静置培养时产生最大酶活是
振荡培养的 3． 4 倍。木蹄层孔菌产漆酶静置培养优于
振荡培养。
2． 2 碳源和氮源的选择
在培养基中分别添加 20g /L 的不同碳源，研究对
木蹄层孔菌产漆酶的影响。结果表明(如图 2) ，以麦麸
为碳源，在第 16d 比白桦木屑作为碳源的漆酶活性高
出约 2 倍。可溶性淀粉和玉米明显不利于漆酶的分
泌，在 18d培养中酶活都较低。本研究使用两种木质
纤维素废弃物(麦麸和白桦木屑)替换培养基中的葡萄
糖进行漆酶的合成。Srinivasan 等［10］认为纤维素和木
质纤维素废弃物有利于刺激漆酶的合成。研究表明麦
麸是木蹄层孔菌产漆酶最适碳源，其次是白桦木屑。
图 2 不同碳源对木蹄层孔菌产漆酶活性的影响
Fig． 2 Effect of carbon source on laccase
activity of F． fomentarius
从图 3 可以看出，不同氮源对漆酶活性具有一定
影响。蛋白胨、酵母浸膏、酒石酸铵和牛肉膏四种氮源
在培养第 12d时，木蹄层孔菌产漆酶活性都达到最大，
漆酶活性分别为 730，478，614 和 562U /L，其中蛋白胨
为木蹄层孔菌产漆酶的最佳氮源。
33
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 33 No． 11 2013
图 3 不同氮源对木蹄层孔菌产漆酶活性的影响
Fig． 3 Effect of nitrogen source on laccase
activity of F． fomentarius
2． 3 碳源和氮源正交试验
碳源取麦麸，设 4 个浓度:20，23，26，29g /L;氮源取
蛋白胨，设 4 个浓度:1． 5，2，2． 5，3g /L。测定不同实验
组第 10d漆酶酶活(见表 1) ，结果表明，木蹄层孔菌产
漆酶最佳的碳氮源浓度为:麦麸 26 g /L，蛋白胨 2． 5 g /L。
应用该配方培养木蹄层孔菌，漆酶酶活力可达1 307U /L，
优化后漆酶产量增加了约 7． 88 倍。方差分析结果显示，
蛋白胨各浓度间的差异显著(F =9． 206，P ＜0． 05) ，表明
不同浓度的蛋白胨对木蹄层孔菌漆酶的产生具有显著影
响，麦麸各浓度间差异不显著。
2． 4 酶反应的最适 pH和 pH稳定性
利用 Tien＆Kirk培养基静置培养木蹄层孔菌，测得
表 1 正交试验设计和结果
Table 1 Experimental design and results of
orthogonal experimental
试验号 麦麸(g /L) 蛋白胨(g /L) 酶活(U /L)
1 20 1． 5 767
2 23 1． 5 1071
3 26 1． 5 760
4 29 1． 5 737
5 20 2 700
6 23 2 1066
7 26 2 985
8 29 2 743
9 20 2． 5 1151
10 23 2． 5 1060
11 26 2． 5 1307
12 29 2． 5 1220
13 20 3 1238
14 23 3 1037
15 26 3 924
16 29 3 989
第 10d粗酶液中漆酶酶活为 135． 40U /L，以此作为后续
实验粗酶液。以 ABTS 为底物时，在不同 pH 条件下测
定木蹄层孔菌漆酶的酶活，结果表明(图 4a) ，该漆酶在
pH2． 5 ～ 3 之间均具有较高酶活力(90%) ，其最适 pH
为 3，这与 Marasmius sp． ［11］和 Fusarium solani MAS2［12］
产生的漆酶性质相同。
图 4 pH值对木蹄层孔菌漆酶活性和稳定性的影响
Fig． 4 Effect of pH on activity (a)and stability (b)of the laccase of F． fomentsarius
取粗酶液在不同 pH的缓冲液中 4℃放置 1h 和 24h
后，测定残存酶活力。结果显示(图 4b) ，漆酶酶活在最
适 pH下的稳定性不是最高的，其 pH稳定范围在 pH3． 5
～4之间，粗酶液在此 pH范围内放置 24h 后，相对酶活
均能保持在 80%以上，说明该酶的 pH稳定性较好。
2． 5 酶反应的最适温度和热稳定性
以 ABTS为底物，在不同温度下测定了木蹄层孔菌
漆酶的酶活，结果如图 5a。随着反应温度的升高，酶活
逐渐增大，在 50℃时酶活达到最大值。之后，随着温度
的进一步升高，酶活逐渐下降。其中，在 30 ～ 60℃之
43
2013，33(11) 尚 洁 等:碳源和氮源对木蹄层孔菌产漆酶的影响及酶学性质研究
间，木蹄层孔菌漆酶酶活均可以保持在 60%以上，当温 度达到 70℃时，漆酶酶活仅为 23． 36%。
图 5 温度对木蹄层孔菌漆酶活性和稳定性的影响
Fig． 5 Effect of temperature on activity (a)and stability (b)of the laccase from F． fomentarius
取粗酶液在不同温度下分别保温 1h 和 24h，测定
残存酶活力。结果表明(图 5b) ，在测定的温度范围
内，随着温度的升高，酶活逐渐下降。在相同的温度条
件下，保温时间越长，酶活越低。其中，粗酶液在 20 和
30℃条件下温浴 1h 后，酶活均无显著变化。而在温浴
24h后，残存酶活分别下降为原来的 76%和 45． 91%。
在 50℃条件下温浴 1h 后，酶活基本丧失，仅为 5． 2%。
结果说明该酶热稳定性较差，不适宜在高温条件下贮
存。
2． 6 金属离子和抑制剂对酶反应的影响
分别用 10 种不同的金属离子处理酶液，测定漆酶
活性，结果见表 2。当金属离子浓度为 10mmol /L时，除
了 Mn2 +外，其它金属离子均表现出对酶活具有明显的
抑制作用。其中 Ba2 +，Ca2 +，Co2 +，Fe2 +和 Na +抑制作
用最明显。当离子浓度为 1mmol /L，对漆酶的抑制作用
均不显著。其中值得注意的是，1mmol /L 的 Fe2 +对酶
活甚至具有轻微的促进作用。由于以往对 Pleurotus
ostreatus漆酶的研究表明，Fe2 +对漆酶具有强烈的抑制
作用［13］。因此，高浓度的 Fe2 +对酶活具有抑制作用，
而低浓度的 Fe2 +对酶活却表现出轻微的促进作用，其
中的原因有待进一步研究。在反应液中 Mn2 +浓度达
到 1mmol /L和 10mmol /L 时，漆酶相对酶活分别为 94．
80%和 94． 07%，表明 Mn2 +对漆酶酶活几乎没有影响。
漆酶是一种含铜氧化酶，当铜离子浓度为 1mmol /L 时，
对漆酶活性无显著影响，但当 Cu2 + 浓度升高至 10
mmol /L时，导致约 65% 的酶活丧失。这与 Okamoto
等［13］认为过量的 Cu2 +可能会改变漆酶结构，以至于使
酶失活的研究结果相一致。
表 2 金属离子对漆酶活性的影响
Table2 Effect of metal ions on the laccase activity
金属离子 浓度 /mmol /L 相对酶活 /%
Ba2 +
1 70． 21%
10 5． 32%
Ca2 +
1 81． 62%
10 7． 40%
Co2 +
1 77． 22%
10 4． 80%
Cu2 +
1 92． 35%
10 35． 63%
Fe2 +
1 104． 04%
10 1． 31%
K +
1 86． 67%
10 20． 70%
Mg2 +
1 97． 65%
10 79． 63%
Mn2 +
1 94． 80%
10 94． 07%
Na +
1 89． 27%
10 14． 83%
Zn2 +
1 88． 32%
10 57． 25%
研究三种假设的漆酶抑制剂对酶活性的影响时发
现(表 3) ，DTT对该菌漆酶活性的抑制作用最为明显，
在 0． 1mmol /L时即可抑制 98%以上的漆酶活性。以往
的研究也发现，硫醇化合物对漆酶酶活具有抑制作
用［14-16］，这可能是因为巯基影响酶活性中心的铜离子
的结果［17］。1mmol /L的 NaN3 同样可以使 98%以上的
酶活丧失，这可能是叠氮化物和酶结构中的铜离子结
合，阻碍了电子的传递进而使酶丧失催化活性［18］。相
比之下，浓度为 1 mmol /L 和 10mmol /L 的 EDTA 对漆酶
酶活抑制作用不明显，相反，当浓度为1mmol /L时，EDTA
对酶活甚至具有轻微的促进作用，表明木蹄层孔菌漆酶
53
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 33 No． 11 2013
对金属螯合剂 EDTA具有良好的耐受性。
表 3 抑制剂对漆酶活性的影响
Table 3 Effect of typical laccase inhibitors
on the laccase activity
抑制剂 浓度(mmol /L) 相对酶活 /%
DTT
0． 1 1． 77%
1 0． 00%
EDTA
1 103． 43%
10 92． 20%
NaN3
1 1． 56%
10 0． 00%
2． 7 漆酶的酶动力学研究
以不同浓度的 ABTS 为底物，测定漆酶的 Km 值和
Vmax。采用 Lineweaver-Burk作图法得到公式 y = 0． 078x
+ 0． 387(见图 6) ，通过该直线方程推出木蹄层孔菌漆
酶对 ABTS底物的米氏常数 Km 值为 0． 20 mmol /L，Vmax
为 2． 58 mmol /L·min。Km 值可用于判断酶与底物的
亲和力大小，Km 愈小，酶和底物的亲合力愈大。由实
验可知，木蹄层孔菌漆酶和 ABTS亲和力较大。
图 6 漆酶的 Lineweaver-Burk图
Fig． 6 Lineweaver-Burk plot of laccase
3 结 论
(1)木蹄层孔菌液体发酵产漆酶应选静置培养方
式;最适碳源为麦麸，最适氮源为蛋白胨，碳氮源的最
佳组成为:麦麸 26g /L，蛋白胨 2． 5g /L。
(2)木蹄层孔菌产漆酶的最适反应温度为 50℃，该
酶的热稳定性较差，贮存温度不能超过 30℃。
(3)木蹄层孔菌产漆酶的最适 pH为 3，该酶的 pH
稳定范围为 pH3． 5 ～ 4，在此范围内保持 24h后，粗酶液
的相对酶活均能保持在 80%以上。
(4)当 10 种金属离子浓度为 1mmol /L 时，对漆酶
酶活无显著影响，其中 1mmol /L 的 Fe2 +对酶活甚至具
有轻微的促进作用。当金属离子浓度为 10mmol /L 时，
Ba2 +，Ca2 +，Co2 +，Fe2 +和 Na +可抑制 85%以上的漆酶
活性。
(5)0． 1mmol /L的 DTT和和 1mmol /L NaN3 均可以
抑制 98%以上的漆酶活性。漆酶对 EDTA 具有良好的
耐受性，当 EDTA 的浓度达到 10mmol /L 时，对酶活仍
然没有明显的抑制作用。
(6)以 ABTS为底物时，漆酶的 Km 值为 0． 20mmol /
L，Vmax为 2． 58 mmol /L·min，表明木蹄层孔菌漆酶和
ABTS亲和力较大。
参考文献
［1］ Needham J． Science and Civilisation in China． London:
Cambridge University Press，1976． 382．
［2］ Claus H． Laccases:structure，reactions，distribution． Micron，
2004，35(1) :93-96．
［3］刘欣，赵敏，王秋玉． 5 种木材腐朽菌的生物学特性及对白桦
木材腐朽能力的分析． 东北林业大学学报，2008，36(3) :41-
44．
Liu X，Zhao M，Wang Q Y． Biological Characters of five species
of wood rot fungi and decay capacity to Betula platyphylla． Journal
of Northeast Forestry University，2008，36(3) :41-44．
［4］Murugesan K， Yang I H， Kim Y M， et al． Enhanced
transformation of malachite green by laccase of Ganoderma
lucidum in the presence of natural phenolic compounds． Applied
Microbiology and Biotechnology，2009，82(2) :341-350．
［5］Singh S，Pakshirajan K，Daverey A． Enhanced decolourization of
Direct Ｒed-80 dye by the white rot fungus Phanerochaete
chrysosporium employing sequential design of experiments．
Biodegradation，2010，21(4) :501-511．
［6］黄茜，黄凤洪，江木兰，等． 木质素降解菌的筛选及混合菌发
酵降解秸秆的研究． 中国生物工程杂志，2008，8(2) :66-70．
Huang Q，Huang F H，Jiang M L，et al． The selection of lignin-
degrading fungus and the straw fermentation by mixed strains．
China Biotechnology，2008，8(2) :66-70．
［7］Tien M， Kirk T K． Lignin-degrading enzyme from the
hymenomycete Phanerochaete chrysosporium Burds． Science
(Washington) ，1983，221(4611) :661-662．
［8］林俊芳，刘志明，陈晓阳，等． 真菌漆酶的酶活测定方法评价．
生物加工过程，2009，7(4) :1-8．
Lin J F，Liu ZH M，Chen X Y，et al． Evaluation of assay
methods for determining fungal laccase activity． Chinese Journal
of Bioprocess Engineering，2009，7(4) :1-8．
［9］ Wolfenden B S，Willson Ｒ L． Ｒadical-cations as reference
chromogens in kinetic studies of ono-electron transfer reactions． J
Chem Soc Perkin Trans，1982，2:805-812．
［10］Srinivasan C，Dsouza T M，Boominathan K，et al． Demonstration
63
2013，33(11) 尚 洁 等:碳源和氮源对木蹄层孔菌产漆酶的影响及酶学性质研究
of Laccase in the White rot Basidiomycete Phanerochaete
chrysosporium BKM-F1767． Applied and Environmental
Microbiology，1995，61(12) :4274-4277．
［11］Schückel J，Matura A，Van Pee K H． One-copper laccase-related
enzyme from Marasmius sp．:Purification，characterization and
bleaching of textile dyes． Enzyme and Microbial Technology，
2011，48(3) :278-284．
［12］Wu Y Ｒ，Luo Z H，Kwok-Kei Chow Ｒ，et al． Purification and
characterization of an extracellular laccase from the anthracene-
degrading fungus Fusarium solani MAS2． Bioresource
Technology，2010，101(24) :9772-9777．
［13］ Okamoto K， Yanagi S O， Sakai T． Purification and
characterization of extracellular laccase from Pleurotus ostreatus．
Mycoscience，2000，41(1) :7-13．
［14］ Lu L， Zhao M， Zhang B B， et al． Purification and
characterization of laccase from Pycnoporus sanguineus and
decolorization of an anthraquinone dye by the enzyme． Applied
Microbiology and Biotechnology，2007，74(6) :1232-1239．
［15］Park K M，Park S S． Purification and characterization of laccase
from basidiomycete Fomitella fraxinea． Journal of Microbiology
and Biotechnology，2008，18(4) :670．
［16］ Baldrian P． Purification and characterization of laccase from the
white-rot fungus Daedalea quercina and decolorization of synthetic
dyes by the enzyme． Applied Microbiology and Biotechnology，
2004，63(5) :560-563．
［17］Wells A，Teria M，Eve T． Green oxidations with laccase-mediator
systems． Biochemical Society Transactions，2006，34(2) :304．
［18］ Solomon E I，Sundaram U M，Machonkin T E． Multicopper
oxidases and oxygenases． Chemical Ｒeviews，1996，96(7) :
2563-2606．
The Effect of Carbon and Nitrogen Sources on Laccase Production
and Properties from Fomes fomentarius
SHANG Jie1，2 WU Qiu-xia2 LIAN Xiao-long2 WANG Qiu-yu1
(1 Northeast Forestry University，College of Life Science，Harbin 150040，China)
(2 Beifang University of Nationalities，College of Biological Science and Engineering，Yinchuan 750021，China)
Abstract The production of laccase by Fomes fomentarius was studied． Cultures conditions involving
variations in carbon and nitrogen sources and different C∶ N ratios were examined at constant temperature and pH，
with the aim of increasing yield of laccase． And its enzymatic properties were determined． The best results were
obtained when using wheat bran and peptone as carbon and nitrogen sources respectively with a C∶ N ratio of 10．
4． Compared to the initial medium，the highest laccase yield observed is approximately increased by 7． 88 times
under the optimized conditions． The optimum pH and temperature for its activity is 3． 0 and 50℃ with the
corresponding Km and Vmax of 0． 20 mmol /L and 2． 58 mmol /L·min respectively． DTT(0． 1mmol /L)and NaN3
(10mmol /L)nearly inhibit all activity of the laccase，as well as the metal ions especially Ba2 +，Ca2 +，Co2 + and
Fe2 +(10mmol /L)． In summary，our results will provide basic information to the production of laccase by Fomes
fomentarius and the utilization of environmental engineering in the future．
Key words Fomes fomentarius Laccase Carbon and nitrogen sources Enzymatic properties
73