全 文 ：CARCINOGENES IS, TERATOGENESIS ＆ MUTAGENESIS
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5Ma
r.
Vol.17 No.2
癌变 畸变 突变
论 著
【摘要】背景与目的:研究木蹄层孔菌乙醇提取物(ethanol extract of Fomes fomentarius ,EEF)体内外对肿瘤细胞的抑制作用。 材料与
方法:噻唑蓝(3_[ 4 , 5_dimethylthiazol_2_yl]_2 , 5 diphenyltetrazolium broide ,MTT)法测定 EEF对体外培养的 HeLa细胞的生长的影响;流式细
胞仪检测其体外对 S180细胞凋亡率的影响;建立腹水型 S180肉瘤模型 ,测定 EEF对荷瘤鼠生命延长率的影响;通过试剂盒检测 EEF对
正常小鼠几个重要器官丙二醛(Malondialdehyde ,MDA)含量的影响 。 结果:EEF对体外生长的 HeLa细胞有明显的抑制作用;能显著提
高 S180细胞的凋亡率及荷瘤鼠的生存天数;能明显降低正常鼠肝脏 、肾脏MDA含量 。 结论:EEF对肿瘤细胞有很强的抑制作用 。
【关键词】木蹄层孔菌;抗肿瘤;抑制作用
中图分类号:R979.1 文献标识码:A 文章编号:1004-616X(2005)02-0104-03
【ABSTRACT】BACKGROUND＆ AIM:To study the inhibition of tumor cells by ethanol extract of Fomes fomentarius(EEF)
both in vivo and in vitro.MATERIAL AND METHODS:The influence of EEF on HeLa cells was assayed by MTT method.
The effect of EEF on the apoptosis of S180 cells was analysed by FCM.The effect of EEF on the extending rates of mice
carrying S180 tumor was investigated.MDA contents of several principle issues were observed , after the mice were dealed
with EEF.RESULTS: EEF had obvious inhibitory activity to HeLa cells in vitro in a dose_dependent manner;could
remarkably increase the apoptosis of S180 cells , the extending rates of mice carrying S180 tumor;MDA contents of liver ,
kindey were increased significantly , after the normal mice were treated by EEF.CONCLUSION:Ethanol extract of Fomes
fomentarius has obvious inhibition on tumor cells.
【KEY WORDS】Fomes fomentarius;anti_tumor;inhibi tory effect
收稿日期:2004-09-15;修改日期:2004-11-17
基金项目:江苏省药物植物生物技术重点实验室重点项目(No.ZXL0512), 重
要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室专项基金
作者简介:刘 量(1980- ), 女 ,安徽省人 ,硕士研究生 , 研究方向:药用植
物学。
＊Correspondence to:ZHOU Shou_biao E_mail:ZhouShoubiao@vip.163.com.
0 1 0 4
Inhibition of Tumor Cells by
Ethanol Extract of Fomes
Fomentarius
LIU Liang
1 ,2 , ZHOU Shou_biao1 , ＊, ZHENG Wei_fa2
(1.Provincial Key Laboratory of Conservation and
Exploitation of Biological Resources in Anhui , Institute of
Life Science , Anhui NormalUniversity , Wuhu Anhui 241000 ,
China;2.Provincial Key Laboratory of Biotechnology
on Medical Plants , Xuzhou J iangsu 221116 , China)
本室在以前的研究中发现木蹄层孔菌乙醇提取物
(ethanol extract of Fomes fomentarius)对 S180荷瘤鼠有很
强的抑瘤活性 ,我们在此基础上继续研究其对体外生长
的肿瘤细胞的细胞毒活性及对腹水型 S180荷瘤鼠的生
存天数的影响 。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药品和试剂
木蹄层孔菌(购自大连王力商行)碾碎用无水乙醇
煮沸浸提 2 ～ 3次 , 过 200目滤网 , 所得浸膏冷冻干燥 ,
得棕色粉末 。临用前将粉末先溶于少量乙醇 ,再加吐温
-80助溶 , 后用蒸馏水稀释到所需浓度;用于体外实验
药物用 1 % 二甲亚枫(Dimethyl Sulfoxide , DMSO)+完
全 RPMI1640培养基稀释。
RPMI1640干粉培养基 、 新生小牛血清购自美国
木蹄层孔菌
乙醇提取物对肿瘤
细胞的抑制作用
刘 量 1 ,2/周守标 1 , ＊/郑维发 2
(1.安徽师范大学重要生物资源保护与利用安徽省
重点实验室 , 安徽 芜湖 241000;
2.江苏省药用植物生物技术重点实验室 ,
江苏 徐州 221116)
O
53月
第 17卷 第 2期
CARCINOGENES IS, TERATOGENESIS ＆ MUTAGENESIS
癌变 畸变 突变
论 著
0 1 0 5
Hyclone公司 , 胰蛋白酶购自上海华美公司 , 噻唑蓝(3_
[ 4 , 5_dimethylthiazol_2_yl] _2 , 5 diphenyltetrazolium broide ,
MTT)、 DMSO 、DNase Ⅰ 、RNase 、刀豆蛋白 A(ConA)为
Sigma公司产品 , MDA试剂盒(南京建成)。
1.1.2 实验动物及肿瘤细胞株
普通级昆明鼠(徐州医学院实验动物中心提供),雌
雄各半 , 体重 18～ 22 g;S180腹水瘤种鼠(购自中国医学
科学院协和医科大学药物研究所), HeLa细胞株购自军
事医学科学院病毒研究所。
1.1.3 主要设备
CO 2培养箱(SHELBA)、酶联免疫检测仪(Bio_RAD
公司)、 离心机 (上海飞鸽离心机厂)、 分析天平
(Sartorius)、 722可见分光光度计(上海精密科学仪器有
限公司), FACS Calibur型流式细胞仪(Becton Dickinson)
1.2 实验方法
1.2.1 EEF对体外培养的 HeLa细胞的杀伤作用
将肿瘤细胞 HeLa , 以 5×104/ml细胞接种于 96孔
板中 , 并加入不同剂量药物 , 每孔总体积为 200 μL , 使
EEF的终浓度为 31.25、62.5、125、250和 500 μg/ml , 每
孔 4复孔 , 另设空白对照组 。在 37 ℃、5 %CO2饱和湿
度条件下培养 48 h后 ,每孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μL ,
继续培养 4 h , 离心弃去上清液 , 每孔加入 DMSO
150 μL ,振荡使沉淀完全溶解后于酶联免疫检测仪上测
定 570 nm处的吸光度 A值 。
抑制率=(1-A 给药组/A 空白组)×100 %
1.2.2 流式细胞仪检测 EEF对 S180细胞凋亡率
的影响
参照文献 [ 1 , 2] , 取与 100 μg/ml 、400 μg/ml EEF
共育 48 h的 S180细胞 ,离心 ,D_Hanks液洗涤 ,分别加入
DNase Ⅰ及胰蛋白酶 37 ℃分别处理 15、30 min ,以 5 ml
含 10 % FCS的 D_Hanks液终止反应 , D_Hanks液洗
涤 ,于 70 %冷乙醇固定 24 h ,离心 , D_Hanks液洗去乙
醇 ,再用 0.2 mol/L Na2HPO4 _0.1 mol/L柠檬酸缓冲液
(D_Hanks液 1:5稀释)室温处理 15 min ,离心后细胞重
悬 1 ml 碘化丙啶荧光染料(PI , 含 20 μg/ml PI、0.25
mg/ml RNaseA),室温染色 30 min ,流式细胞仪检测细胞
凋亡率。
1.2.3 EEF对 S180荷瘤鼠生存天数的影响
无菌抽取 7 ～ 8 d的 S180腹水 , 用灭菌生理盐水稀
释 , 调整其浓度为 107个/ml , 接种于健康昆明鼠腹部 ,
每只 0.2 ml , 24 h后随机分组 , 设对照组和给药组 , 每
组均为 8只 ,给药组分为 EEF高 、中 、低剂量组 ,剂量分
别为 500 、250 、100 mg/(kg ·d),每日于同一时间灌胃给
药。共 10 d ,纪录小鼠死亡时间 。
动物生命延长率= (试验组平均存活天数 -对照组平均天
数/对照组平均天数)×100 %[1 ] 。
1.2.4 MDA含量的测定
18 ～ 22 g健康昆明鼠 , 随机分成 EEF高 、中 、低剂
量组(剂量同 1.2.3)和生理盐水对照组 ,每组均为 8只 ,
连续灌胃八周后 ,取脾脏 ,肾脏 ,肝脏 ,以预冷的 0.86 %
的匀浆介质制成 10 %组织匀浆液 , 离心 , 取上清 , 用
MDA试剂盒检测组织匀浆中 MDA含量。
1.2.5 统计学方法
采用 SPSS10.0统计软件进行方差分析。
2 结 果
2.1 EEF对体外生长的 Hela细胞的作用
经与细胞共育 48 h后 , 5个剂量组均能不同程度抑
制 HeLa细胞生长 ,并呈剂量依赖关系 ,回归方程为 Y^=
0.17x+7.15 , (r 2=0.938 , F=28.46 , P<0.01)。其中
62.5 μg/ml剂量组的抑制率略低于 31.25 μg/ml组 ,它
们之间差异无显著性(P>0.05),可能是由于实验误差
所致。500 μg/ml抑制率高达 81.71 %,可见 EEF在
体外对肿瘤细胞有很强的细胞毒活性(图 1)。
2.2 EEF对 S180细胞凋亡率的影响
药物作用 48 h , S180细胞的凋亡率与对照相比有明
显的提高(P<0.01), 100 μg/ml 、400 μg/ml EEF作用
后的凋亡率分别是 24.760 %±3.507 %、 40.410 %±
4.172 %,而对照组的凋亡率为 2.730 %±0.495 %。
2.3 EEF对 S180荷瘤鼠生存天数的影响
3个 EEF剂量组均能明显延长荷瘤鼠的生存天数
(表 1)。荷瘤鼠生命延长率最多可达 81.3 %。
图 1 EEF 对体外生长的 HeLa细胞的抑制率
Figure 1 Effect of EEF on the inhibitory rate of the HeLa cel ls
Groups n
Dose
mg· kg-1
Suivival days
(x-±s)
Extending rates
(×10-2)
S1 80 mice
EEF
8
8
8
8
-
100
250
500
16.0±1.00
24.5±6.56＊
24.0±5.34＊
29.0±1.73＊＊
0
53.1
50.0
81.3
表 1 EEF对S1 80 荷瘤鼠生存天数的影响
Table 1 Effect of EEF on survival days of S18 0 bearing mice
Compared with S18 0 group , ＊P<0.05 , ＊ ＊P<0.01.
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癌变 畸变 突变
论 著
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《癌变·畸变·突变》参考文献格式
2.4 EEF对正常鼠几个重要器官 MDA含量影响
EEF对脾脏 MDA含量无明显影响 , 对肝脏 、肾脏 ,
小剂量无影响 , 中 、大剂量 EEF能降低 MDA含量 (表
2)。
3 讨 论
5个 EEF剂量组在体外能不同程度抑制 HeLa 生
长 , 并呈剂量依赖关系 , (31.25～ 500)μg/ml EEF与肿
瘤细胞共育 48 h , 抑制率最大可达 81.71 %, 说明 EEF
在体外对肿瘤细胞有很强的细胞毒活性 。肿瘤的发生机
制不仅涉及肿瘤细胞的失控性增殖 ,而且与细胞凋亡有
关 [ 3]。细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用 ,可以
遏制肿瘤迅速生长 [ 4]。我们通过流式细胞仪检测到 100
μg/ml 、400 μg/ml EEF能明显提高 S180细胞的凋亡率 。
提示 EEF 体外的强抗肿瘤活性可能与其提高肿瘤细胞
的凋亡率有关 。
3个 EEF 剂量组体内均能提高荷瘤鼠的生存天数 ,
生命延长率最大可达 80 %多 , 说明 EEF有很强的体内
抗肿瘤活性 。自由基反应与肿瘤的发生和发展过程密切
相关 , 在复杂的癌变过程中可能起重要作用 [ 5] , MDA是
脂质过氧化的主要分解产物 , MDA含量升高实际上是
氧自由基产生过多 , 脂质过氧化物增多的表现[ 6] , EEF
能显著降低肝脏 ,肾脏 MDA含量 ,说明 EEF 的抗肿瘤作
用可能与其能减轻体内脂质过氧化程度从而减轻细胞
损伤程度有关。
木蹄层孔菌乙醇提取物在抗肿瘤方面有很好的应
用前景 ,值得对其进行深入的研究。
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氧化酶活性的变化[ J] .动物学研究 , 2003 , 24(3):239.
Groups n
Dose
mg· kg -1
Liver MDA
content
nmol·mg -1
Spleen MDA
content
nmol·mg-1
Kidney MDA
content
nmol·mg-1
Control
EEF
8
8
8
8
0
100
250
500
3.369±0.557
2.911±0.894
2.551±0.307＊
2.077±0.332＊ ＊
3.769±0.62
4.058±0.786
3.093±0.759
3.103±0.249
4.034±0.551
3.722±0.717
2.921±0.213＊
2.757±0.703＊
表 2 EEF对小鼠重要器官MDA含量的影响
Table 2 Effect of EEF on MDA contents of principle tissues in normal
mice
Compared with control , ＊P<0.05 , ＊ ＊P<0.01.
参考文献是作者直接阅读过 、与文中内容相关的文献 。未正式发表的资料请勿列入。参考文献引用采用顺序编码制 ,正文中出现
的及文末的参考文献序号应一致 ,用带有方括号的阿拉伯数字表示 。置于右肩位 。参考文献格式如下:
期刊文章[序号] 主要责任者 ,文献题名[ J] ,刊名 ,年 ,卷(期):起页-止页 .
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专著 、论文集[序号]主要责任者 .文献题名[ M或 C] .版本 .出版地:出版者 ,出版年 .起页-止页 .
例:[ 3] 黄幸纾 ,陈星若 .环境化学物致突变致畸癌试验方法[ M] .第 1版 .杭州:浙江科学技术出版社 ,1985.20-30.
论文集中的析出文献[序号]析出文献主要责任者 ,析出文献题名[ A] .原文献主要责任者 .原文献题名[C] .出版地:出版年 .起
页-止页 .
例:[ 4] 许耀初 ,沈 靖 ,沈洪兵 , 等 .食管癌人群遗传易感性的流行病学研究[ A] .张荫昌 .中国癌症研究进展[ C] .北京:北京
医科大学中国协和医科大学联合出版社 , 1996.64-67.
国际 、国家标准[序号]标准编号 ,标准名称[ S] .
例:[ 5] GB5193-1994 ,食品安全性毒理学评价程序和方法[S] .
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