全 文 ：菌 物 系 统 19 (l) :8 1一 8 6, 20 0 0
再分e o sy s te m a
两类木蹄层孔菌在酶蛋 白水平上的遗传分化
程东升
(北京林业大学 北京 10 0 0 8 3 )
山口岳广 王志娟
(东北林 业大学
潘学仁
( 日本森林综合研究所北海道分所 札幌 ) 哈尔滨 1 50 0 4 0 )
摘 要 : 木蹄层孔菌 (oF me s _of m en at ir 哪 )在中国东北 和 日本存在子实体形态不 同 、 寄主范围
明显有别的两个类型 : 小型和大型 。 用多位点分析方法研究 了两者间的遗传分化状况 。 从两
类 41 个菌株的 4 种酶系统中检测出 9 个基 因位点 , 其中 8 个位点上的绝大多数酶谱型都不为
两者所共有 , 显示两个类型间的基因交流 已极 少发生 。 根据酶谱型频率得出两者间的遗传距
离 D = .0 965 , 属于典型的种间遗传分化 。 上述酶基因分化证据结合子实体形态的显著差异 ,
提示两类木蹄层孔菌是各 自独立的种 。 两个类型的群体在遗传多样性参数上无显著差异 , 可
能暗示两者在起源演化上的同步性 。 酉旨酶系统有 2 个位点上 的酶谱为不同类型所特有且稳定
而清晰 , 可作为分子标记用于两类木蹄层孔菌的无子实体鉴定 。
关键词 : 木蹄层孔菌 、 多位点酶 、 遗传分化
中图分类号 : W 9 3 9 月 6 文献标识码 : A 文童编号 : 10 0 7一3 5 1 5 ( 20 0 0 ) 0 1书 0 8 1一 0 8 6
木蹄层孔菌 ( oF m es fo m en at ir us L . ex . rF )是世界性分布的木腐性真菌 , 危害多种阔
叶树种 . 日本学者今关等 (今关六也 , 19 70 ; 19 8 8) 注意到本菌存在着子实体形态差异明显
的两种类型 : 小型和大型 。 小型菌 比较常见 , 其子实体较小 , 呈典型马蹄状 , 横径 、 纵径及
厚度通常只有 3 一 6厘米 。 大型菌 比较少见 ,其子实体明显较大 , 呈扁贝壳状 , 横径 、 纵径通
常为 2 0 一 50 厘米 , 厚度 10 一 2 0 厘米 。 木蹄层孔菌也广泛分布于 中国 ( Z h a o J一 D , 19 9 2 ) 。
根据对中国东北地区 木蹄层孔菌的描述 (刘正南 , 19 8 2) , 其子实体大小变化范围为横径
3 一 5 5厘米 , 厚度 2 一 16 厘米 , 覆盖了 日本学者所划分的两种类型 。 但关于 中国是否存在
小型和大型 的分化 , 未见报道 。 本文作者近年来在 中国东北小兴安岭及长白山地区多次
调查木材腐朽菌时发现 , 日本学者提 出的小型和大型划分 , 也适用于 中国的木蹄层孔菌 。
进而还注意到 , 两类木蹄层孔菌的寄主范围明显不 同 。 小型菌主要生在桦树 (eB ut al sp .
上 , 散见于杨 (八叨 ul us sP p . )或械 (A ce ; sP p . ) 。 而大型菌则从未在桦树上发现 , 而仅见于
锻 (万l i a s p p . ) 、 栋 ( Q u e r c u s s P . ) 、 木 曲柳 ( rF a圳 u s m a n ds h o r ie a R u p r . ) 、 或械等非桦树
种上 。 鉴于两类木蹄层孔菌子实体形态差异十分显著 , 今 关六也 ( 19 8 8) 曾提 出有必要对
两者 的关系进行探讨 。 决 定生物变异及 其系统 关系的本质 在于遗传基础 。 多位 点酶
(m ul ilt co us e nz y m e )遗传分析是研究生物种或种群遗传变异的有效方法之一 , 被广泛应
基金项 目 : 日本科学技术厅资助项 目
收稿日期 : 19 9 8一 11刁9
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 2000. 01. 017
菌 物 系 统 19卷
用于包括真菌在内的生物分类和鉴定 M ( u rpy h, R w , 1 9 9 0) 。 作者运用此法分析了两类
木蹄层孔菌之间的遗传分化状况 。
1 材料和方法
L l 菌株来源
于 19 9 5 年 9 月 一 199 7 年 9 月 , 在中国黑龙江省小兴安岭 (带岭 ) , 吉林省长白山以及 日本的北海道各
地共采集木蹄层孔菌菌株 (子实体 )引 个 , 其中小型 2 个 , 大型 19 个 (表 1 ) 。 在同一地点采集的不同菌株
间地理间隔至少 10 米 , 以保证它们都代表独立的个体 。 子实体带回实验室后 用 P D A 培养基进行组织分
离 , 获得纯化菌株后置 5℃保存 。 同时进行 PD A 平板培养 , 观察记录所有菌株的菌落形态 。
表 l 木蹄层孔菌大小型菌株的来源
T a b le 1 I s o late
o ir g一n s o f s m al l an d lagr
e
ty pe s o f oF me
s
of 用 e n at r i u s
菌株数
Is o la te n u r n be f
寄主
H O S t t r e e
采集地
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小型 Sm al ty pe
6 白桦 及 , 二 la p la仰抑 l la
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械 注 e e r s p .
杨 八少 u lu s s p ·
桦 及 ut la sP .
日本 白桦 丑 p la 今, 匆 l a v ar j口 P O月之f 口
黑龙江小兴安岭 为 a -o ix~ M
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吉林长白山 C h a n g iab M t
吉林长白山 C h a n g b al M t
吉林长白山 C h a n g b ia M t
吉林长白山 C h a n g b ia M t
日本北海道大雪山 I天 Ij s e st u M t J a p an
日本北海道各地 oH k ia d。 , aJ pa l l
大型 la r g e ty pe
l 榆 〔 7刀: u 、 s p .
水曲柳 rF a二 u s m a n ds h u r i e a
极 万 li a a m u r e n s ls
栋 Q u e r c u : l i a o tu n g e n s is
械 滩e e ,· s P .
阔叶树 b r o iad e a f t er e
日本白桦 丑 p la仰妙 la v ar . J aP 洲 i ca
黑龙江小兴安岭 为 a于ix n一 an M t
吉林长白山 C ha n g b ia M t
吉林长白山 C h an g b ia M t
吉林长白 LIJ C h a n g b ia M t
日本北海道各地 oH k 出 d。 , Jap an
日本北海道 H o k al d o , J a琳 n
日本北海道 H a k k al d。 , J ap an
L Z 酶液抽提
预备试验表明 , 木蹄层孔菌的菌体状态对电泳后的酶谱清晰度影响很大 。 用子实体组织时的效果远
不如用菌丝 (平板或液培 )时的效果 。 平板菌丝和液培菌丝得出的电泳谱带相同 。 由于平板培养时菌丝难
以同培养基分离 , 故本实验采用 液培菌丝作酶抽提材料 。 将平板菌落转接至装有 20 毫升 马铃薯葡萄糖
液体培养基 2 50 毫升三角瓶中 , 25 ℃ 下培养 2一 3 周 。 用滤纸滤出菌丝并用蒸馏水冲洗 , 用于燥滤纸吸去
多余水分后装人 1. 5耐 离心管内置 一 巧℃保存 , 1周内用于酶液提取 。 酶抽提缓冲液组成为 : o . lm ol / L
T ir s一 H C }, p即 . 5 : 1om o 一/ L l刀 T ; 1omnr o l / L抗坏血酸 (v e ) ; 2 00, 甘油
。 将冷冻的液培菌丝约 0 39和
6一 10滴样品抽提液及适量石英砂混合于 小型研钵内 , 于 冰浴状态下研磨约半分钟使成稀糊状 , 移人
1
.
5耐 离心管中离心 5 分钟 ( IOO0 0r /而n) , 所得上清液立即用于电泳 , 或置 一 巧℃保存 , 3 天内用于 电泳 .
L 3 电泳
采用不连续凝胶系统聚丙烯酞胺垂直平板法 (胡能书 , 19 8 5) 。 凝胶配方及电泳条件见文献 (程东升 ,
19 4)
。 电泳后对胶板进行了 巧 种酶系统的染色 , 其中能染出酶带且较清晰的有醋酶 (E S )T 、 苹果酸脱氢
程东升等 :两类木蹄层孔菌在酶蛋白水平上 的遗传分化
酶 ( MD H)、 过氧化物酶 (P E)R和过氧化物歧化酶 (OS D)。 本文分析基于这 4种酶系统 , 其染色配方分别
见文献 (胡能书 , 1 9 85 ; 程东升 , 199 4 ; B e auc h a m p , C , 1 97 1 ) . 电泳分析至少进行 3 次重复 。
1
.
4 酶谱的遗传学解释
首先判读酶的基因位点并计算小型和大型两类菌株群体在同源位点上的等位基因频率 。 在不同菌
株之间比较其酶带迁移率 , 可判断出各酶系统的
基因位点 。 位点以酶命名 , 一种酶有多个位点时 ,
按其在胶板上 的迁移率 ( fR )从小到大顺次编号 ,
例 如 醋 酶 的 3 个 位 点 依 次 为 E ST I 、 E S ZT 、
E S T 3 (图 1 ) 。 预备实验发现 , 木蹄层孔菌酶谱变化
比较复杂 , 不象文献 (M u rP h ) , R W , 1 99 0 )说明
的那样容易解释酶带与等位基因的关系 。 因此本
研究直接用酶谱型 ( l s o z y m e p h e n o ty详 )代表等位
基因进行了分析 。 根据文献 ( G a dr e s , M , 1 98 7 ) ,
在等位基因难以判断时这是 比较好的代替方法 。
酶谱型是指酶带在迁移率及数量上的表现 , 一个
位点上的酶带有几种表现 , 该位点就有几个酶谱
小型
5 t y P e
大型
L t y P e 髦:
迁
移 R f率
A— 二二二二 日. . . . . . . . . . . . . . 目 . .日 . . . . 口. . 一C O
P h e n o t y P e
醉谱型
E S T 嗯
E S T Z
E S T 3
日
1一l ·A工Mlj一
图 1 小型和大型木蹄层孔菌在 3个醋酶基 因
位点上的酶谱型
R g
.
l yZ m
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o f is o z y m e P h e n o ty pe s o n ES T l oc i
d e te c te d ofr m
s m ia l a n d ha 飞e t y pe s
o f OF .me
,
fo 删 n la r i u s
型 。 很显然 , 两个分类单元群体拥有的相同酶谱型越多 , 两者在遗传上就愈相似 。 另外 , 一个群体被分析
的基因位点上酶谱型越多 , 各酶谱型频率越均一 , 愈说明该群体的遗传多样性高 。 对同一位点上多种酶
谱型的命名 , 是在位点编号后追加 A 、 B 、 .C · · … , 如 E S T I A 、 E S T IB 等 。 当位点上无任何酶带显示时 , 也
作为一种酶谱型处理 , 称为沉默酶谱 (nu fl p hen ot y pe ) , 用 N 表示 。
根据两类木蹄层孔菌群体在各基因位点上的酶谱型频率 (表 2) , 用 Ne i ( 19 75) 的方法计算出两者间
的遗传相似度 I , 遗传距离 D 及平均酶谱多样度 H 等 。 I 的意义是两个群体的基因位点在随机抽样时相同
的概率 , 其值为 0一 1 。 D 的意义是 , 两个群体 自其共同祖先分歧出来后 , 平均每个位点上积累起来的基因
变异次数 , 其值为 0一 co 。 I和 D 从不 同角度反映不同群体之间的遗传分化程度 。 H 则反映一个群体的遗
传多样性 (Ne i , 197 5 ) , 理论上其值为 0一 l 。
2 结果
2
.
1 基因位点及酶谱型频率
酶基因位点判定及酶谱型频率的计算结果示于表 2 . 从两类木蹄层孔菌 41 个菌株的
4 种酶系统 (E S T 、 M D H 、 SO D 、 P E R ) 中共检测到 9 个基 因位点 。 不 同酶系统的位点数不
等 。 E S T 和 S O D 各有 3 个 ( E S T I一 3 , SO D I一 3 ) , P E R 有 2 个 ( P E R I一 2 ) , M D H 只有一个 。
各个位点上 的酶谱型数也不一样 。 最少的是 M D H 位点 , 只有 1 种酶谱型 A 。 最多 的是
E S T 3 位点 , 包括沉默谱 (N )在内有 5 种酶谱型 ( A 、 B 、 C 、 D 、 N) 。 3 个 E S T 位点上的酶谱型
示于图 1 。
在 9 个基 因位点中 , 只有 M D H 位点上的酶谱型频率在小型和大型之间不存在差异
(频率都是 1) 。 而其它 8个位点上均存在两个类型间的显著的酶谱型频率差异 (表 2) 。 例
如 , 在位点 E S T I 上 , 酶谱型 A 在小 型中的频率为 0 .犯 , 而在大型中根本不出现 (频率 二
0) ; 酶谱型 C 在小 型 中不 出现 , 在大 型 中频 率为 0 . 4 4 (表 2) 。 尤 其是在 E SZT 、 E S T 3 和
S O DZ 三个位点上 , 小型和大型之间完全没有共同的酶谱型 。 根据表 2 的酶谱型频率 , 计
算出两类木蹄层孔菌之间的遗传相似度 I为 0 . 3 81 , 遗传距离 D 为 0 . 9 65 。
菌 物 系 统 卷匕 4 1 9
表2 木蹄层孔菌大 、 小型菌株在 9个酶基因位点上的酶谱型频率
a Tbl
e2 Ph
ne ot y e pfr e q uen c i
e s no 9 i s zo y m e l oc i in s ml al n ad l
ar g e t y e ps ofF O
n. je
f o爬 n t ar i u s
酶谱型频率 Ph n e ot y e p阮 q uen c y
酶谱型
P h ne ot y e p
no e朗h l戊 us
E S TI A
B
C
E S T ZA
B
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E S T3 A
B
C
D
N
MD H A
DS O I A
N
S OD A Z
N
S OD 3 A
N
P R E I A
小型菌株 ( n =2 2 )
5 t y e pis ol at e s
( n =2 2 )
大型菌株 ( n = 19)
Lt y e pis ol at e s
(
n = 19 )
0
.
2 3
0
.
68
0
0
0
1
.
0 0
20 3
0石 9
0
.
0 4
0 4 1
0
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0 0
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0 9
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0 0
0
0
1 0 0
0
.
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0
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0
.
2 3
0
.
6 4
0
.
13
0
0
.
5 6
0
.
44
0
.
2 2
0
.
7 8
0
0
0
0
0
1
.
0 0
1
.
0 0
1
.
0 0
0
0
NB
P E R Z A
1
.
0 0
0名9
0
.
1 1
0 4 5
0
.
33
0
.
2 2
0 3 3
0
0
.
6 7
BN
a “ N
”表示不显示谱带的沉默酶谱型 。 “ N ” er 四 s e n st n u l l p he n o yt 详
表3
T a b le 3 (兔n e it e
基于酶谱型频率的小型和大型木蹄层孔菌的遗传多样性参数
di v e sr iyt p
a
amr
e et sr o f s m al l an d l
a gr e yt 详 5 oF me s fo me n at r i u s b as e d o n i s oz y m e
P h e n o yt ep 阮q u e cn i e s
菌株类型 个体数 多态位点 . 比率
oP ly m
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loc ia / al l
IOC i
平均每位点酶谱型数
M e a n n u m be r o f
P h e n o yt ep s ep r
l oc u s
平均酶谱多样性“
M
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n o yt ep
山v e sr i妙(H) 七
T y ep Sam Pl
e s l z e
小型 ( s m al l )
大型 ( l哪 e )
4 / 9
4 / 9
一5 9 ( 0 3 5 1) `
1
.
6 7 ( 0 2 3 6)
`
0
.
199 (o刀8 1)`
0 2 3 5 (o刀5 4 )c
气乙q,一1
a 具一个以上酶谱型的位点 。 了h e loc i iw ht 山 a n o en i soz y m e Ph e n o yt ep s
b 全部被检测位点的平均 。 A ve agr ed vo er al as s ay ed loc i
c 括号内为标准误 。 N u m be sr m p aer nhet s es aer s atn da 川
1期 程东升等 :两类木蹄层孔菌在酶蛋白水平上的遗传分化 8 5
两个群体的遗传多样性参数示于表 3。 两者的多态位点 (具一个以上酶谱型的位点 )
比率相同 , 都是 4/ 9 (4 .4 4% ) ; 平均每个位点的酶谱数分别为 1 . 89 和 1 . 67 ; 平均酶谱多样性
H 分别为 0 . 19 和 0 . 2 3 5 。 统计检验表 明 , 两类木蹄层孔菌之间在这些遗传多样性参数上
没有显著差异 。
.2 2 平板培养的菌落形态
对两类木蹄层孔菌 41 个菌株的平板培养进行观察 , 发现小型和大型在菌落形态上不
能区分 。 都表现为初期白色或黄白色 , 渐变为桔黄或褐黄色 , 质地为致密绒状 、 粉粒状 、 或
膜状 , 后期加厚成深色壳状 。 这些性状同已发表的描述 (潘学仁 , 19 9 8) 基本相符 。 但本研
究注意到了不同菌株在菌落颜色及质地上有很多变化 , 而这些变化与小 、 大型的分化没有
规律性对应关系 。
3 讨论
在 9 个基因位点中 , 仅有一个位点 (M D H ) 由两类木蹄层孔菌的所有菌株所完全共有 ,
而其它位点都不完全共有 , 表现为十分显著的酶谱型频率差异 。 这意味着与不 同酶谱型
相联系的等位基 因 , 已被或正在被分别固定在小型和大型群体之 中 。 等位基因的固定暗
示基因流动已发生隔离 , 而基因流动的隔离则是物种形成的重要机制 ( sl a t k i n M . 19 8 7) 。
进而 , 根据包括真菌在 内的许多生物的群体遗传学资料 ( A y al a F J , 1 9 7;4 o ort s i n a w J,
19 9 2: S e lan d
e r, R K, 19 5 0: s l a ikt
n M
.
19 87 )
. 亚种间 I值为 0 . 8 2一 0 9 8 , o 值为 0 . 0 2一
0
.
2 ; 种间 I值为 0 . 14 一 0 . 9 0 , D 值为 0 . 1 0一 2 . 0 ; 属间 I值 ( 0 . 3 7 , D 值 ) 1 . 0 。 很显然 , 两类木蹄
层孔菌间的 I值 ( 0 . 3 8 1) 和 D 值 (0 . 9 3 6) 属于种间水平的遗传分化 。
另外 ,从寄主范围看 , 两类木蹄层孔菌之间存在明显的生境隔离现象 (表 1 ) 。 小型菌
绝大多数情况下仅在桦类 ( eB ut al s p . )上出现 , 大型菌则只在非桦类树种上出现 (仅有一
个日本菌株例外 , 寄生于 日本白桦上 ) 。 由于生境隔离的存在 , 可以推测两者通过单核菌
丝融合进行基因交流已不大可能 。
上述遗传分析数据和生境隔离现象 , 与显著的子实体形态分化一起 , 强烈地提示两类
木蹄层孔菌是各 自独立 的种 。 山 口等最近通过单抱子菌落配对培养证明 , 小型木蹄层孔
菌菌株和大型菌株之间不能交配 (待发表 ) 。 o ort s ian 等 ( 19 9 2) 通过多位酶分析 , 得出两个
互不交配的多年生异担扎菌 ( eH et r o b a s i d i o n a n n o s u m )群体间 D 值为 0 . 9 2 6 , 同本研究 得
出的两类木蹄层孔菌之 间 D 值 (0 . 9 6 5 )相近 。
一般来说 , 演化历史长的群体比历史短的群体能积累更多的遗传变异 。 但两类木蹄
层孔菌群体在遗传多样性 (H )上无显著差异 , 这可能暗示着两者起源的同步性 。 在菌株的
酶谱型与菌株的地理来源之间未发现规律性对应关系 . 即便是地理隔离非常明显的中国
和 日本菌株之间 , 也未发现特有酶谱型的存在 。 这可能意 味着地理环境对本研究分析过
的基因位点没有选择作用 。
在分析过的 4 种酶系统中 , E S T 活性最强 , 酶谱最稳定 , 其中 E S T Z 和 E S T 3 位点上的
酶带分别为大型和小型木蹄层孔菌所特有 (图 1 ) , 因而 可作为鉴定它们的辅助性分子标
记 。 虽然两个类型的子实体容易区分 , 但其培养菌落难以辨别 。 因此 , 在子实体不存在的
情况下 , 譬如鉴定分离 自木材基质的菌株时 , E S T 标记将十分有用 。
8 6 菌 物 系 统 19卷
【参 考 文 献 }
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yt 详 5 . iN ne p u at it v e l s o z y m e loc 一 w e er de et c et d for m 4 e nz y m e s y s et m s a n d o n
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ht e i r us e fu l n e s s fo r e ul t瞬 id e n it if e a it o n w h e n l ,ru l it n g b o d le s are u n va ia la b le .
K E Y W O R D S
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