全 文 ：邻联甲苯胺法测定刺芹侧耳漆酶活力的影响因
素
李艳丽1 , 金周雨1 , 李　玉2
1.吉林农业大学生命科学学院 ,长春 130118;2.食药用菌教育部工程研究中心 ,长春 130118
摘　要:系统地研究了邻联甲苯胺法测定刺芹侧耳漆酶活力的影响因素。结果表明:波长 620 nm 、反应温度
30 ℃、pH 4.2 、邻联甲苯胺浓度 5 mmol/ L、反应时间 3 min时 , 刺芹侧耳漆酶活力测定的灵敏度最高 , 酶活力最
大 ,为 3 033 U/(min·mL), 是筛选前测定酶活力的 1.98 倍。
关键词:漆酶;酶活力;邻联甲苯胺法;刺芹侧耳
中图分类号:R284.2;Q949.329　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2011)06-0620-04
DOI:CNKI:22-1100/ S.20110928.1505.003
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/ detail/ 22.1100.S.20110928.1505.003.html
引文格式:李艳丽 , 金周雨 ,李玉.邻联甲苯胺法测定刺芹侧耳漆酶活力的影响因素[ J] .吉林农业大学学报 ,
2011 , 33(6):620-623.
Influential Factors of Laccase Activity from Pleurotus eryngii Determined
by Ortho-tolidine Spectrometry
LI Yan-li1 , JIN Zhou-yu1 , LI Yu2
1.College of Life Science , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China;2.Engineering
Research Center of Edible and Medicinal Fungi , Ministry of Education , Changchun 130118 , China
Abstract:Influential factors of Laccase activity from Pleurotus eryngii determined by ortho-tolidine spec-
trometry were investigated systematically.The results showed that the optimum conditions were that wave-
length was at 620 nm , temperature was at 30 ℃, pH was at 4.2 , ortho-tolidine concentration was at
5 mmol/L and reaction time was for 3 minutes when both sensitivity rate of determination and the laccase
activity were the highest and laccase activity was up to 3 033U/(min·mL).It was 1.98 times of before.
Key words:laccase;enzyme activity;ortho-tolidine spectrometry;Pleurotus eryngii
　　漆酶(EC 1.10.3.2)是一种木质素降解酶 ,具
有生物除污[ 1] 、高分子聚合[ 2] 、木质素改性[ 3] 、饮
料澄清[ 4-5]等作用 ,具有极大的研发价值 。刺芹侧
耳[ Pleurotus eryngii (DC.:Fr.)Quèl.]是真菌门侧
耳属的一种珍稀食药用菌[ 6] ,目前国内对其漆酶
研究开发较少。邻联甲苯胺法是漆酶活力的测定
方法之一 ,与其他方法相比 ,具有操作简便 、对设
备要求低 、灵敏度较高 、价格低廉等优点 ,已被众
多研究者相继采用[ 7-10] 。邻联甲苯胺法测定刺芹
侧耳漆酶活力影响因素的研究尚未见报道 ,因此 ,
确定其影响因素及最适测定条件可为刺芹侧耳漆
酶的深入研究和开发利用提供理论依据 。

通讯作者
基金项目:吉林农业大学科研启动基金项目(201030)
作者简介:李艳丽 ,女 ,在读博士 ,讲师 ,研究方向:食药用菌生物化学与分子生物学。
收稿日期:2011-06-26 　　网络出版时间:2011-09-28 15:05
吉林农业大学学报　2011 ,33(6):620 ～ 623 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　菌株　刺芹侧耳 HB-3 菌株 ,由吉林省食
用菌高新技术园区提供。
1.1.2　培养基　PDA固体培养基:马铃薯 200 g ,
葡萄糖20 g ,琼脂 20 g ,蒸馏水1 000 mL ,pH自然。
PDP固体培养基:马铃薯 200 g ,葡萄糖 20 g ,蛋白
胨2.0 g ,硫酸镁1.5 g ,磷酸二氢钾 3.0 g ,维生素
B1 10 mg ,琼脂20 g ,蒸馏水1 000 mL ,pH自然。
PDP 液体培养基:未添加琼脂的 PDP固体培
养基 。
1.2　方法
1.2.1　漆酶的提取　将 PDA斜面培养基保存的
母种转接至 PDP 固体培养基平板中 , 25 ℃避光培
养5 ～ 6 d后 ,用直径 1 cm打孔器取 2个活化菌
块 ,转接入装有 50 mL PDP 液体培养基的锥形瓶
(250 mL)中 ,25 ℃,160 r/min摇床上避光培养5 ～
6 d。将培养物减压抽滤 ,滤液即为含有漆酶的酶
液 ,适当稀释备用。
1.2.2　漆酶活力测定　采用王宜磊[ 11] 的方法 ,
略有改动。4 mL 反应混合液中含 pH 4.0 的
0.01 mol/L 醋酸盐缓冲液 3.4 mL ,加入一定浓度
的邻联甲苯胺溶液 0.5 mL ,酶液 0.1 mL ,25 ℃条
件下 ,反应 5 min ,于紫外—可见分光光度计上测
定波长为 600 nm 处的吸光值 A。以单位时间内
每毫升反应体系光吸收值增加 0.001为 1个酶活
力单位[ U/(min·mL)] 。试验 3 次重复 ,取平均
值。
1.2.3　刺芹侧耳漆酶酶促反应速率曲线的绘
制　邻联甲苯胺加入到反应混合液时开始准确计
时 ,从反应 1 min时开始 ,每隔 30 s测定 1次吸光
值 ,以吸光值(A)为纵坐标 ,时间(t)为横坐标 ,绘
制酶促反应速率曲线 。
1.2.4　统计分析　采用软件 DPS2000对数据进
行最小显著差异(LSD)分析。
2　结果与分析
2.1　波长对刺芹侧耳漆酶活力的影响
在不同波长(560 ～ 670 nm)下对刺芹侧耳漆
酶活力进行测定 ,结果见表1。在620 nm时 ,漆酶
活力最大 ,灵敏度最高 。LSD统计分析结果显示 ,
在620 ,630 nm 处的漆酶活力与其他波长处理比
较差异显著(P <0.05)。因此 ,邻联甲苯胺法测
定漆酶活力应采用的波长为 620 ～ 630 nm ,最适波
长为 620 nm。
表 1　不同波长下刺芹侧耳漆酶活力
Table 1.Laccase activity of Pleurotus eryngii in the condi-
tion of different wavelengths
波长/ nm
Wavelength
酶活/(U·min-1·mL-1)
Activity
560 790fF
580 1 100eE
600 1 530cC
610 1 700bB
620 1 830aA
630 1 780aAB
640 1 690bB
650 1 460cC
660 1 220dD
670 1 040eE
　　注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 不同大写字母
表示差异极显著(P<0.01)
Note:Different normal letters indicate significant difference at 0.01
and 0.05 levels
2.2　温度对刺芹侧耳漆酶活力的影响
在波长620 nm处 ,不同温度(25 ～ 40 ℃)条件
下对刺芹侧耳漆酶进行酶活力测定 ,结果见图 1。
在 30 ℃时 ,测定的刺芹侧耳漆酶活力最高 ,灵敏
度最高 ,在其两侧漆酶活力均下降。LSD统计分
析结果显示:反应温度为 28 , 30 ,32 ℃时 ,刺芹侧
耳漆酶活力分别为 1 830 , 1 890 , 1 840 U/(min·
mL),与其他处理比较 ,差异极显著(P <0.01)。
因此 ,28 ～ 32 ℃均适用于刺芹侧耳漆酶活力的测
定 ,最适测定温度为 30 ℃。
2.3　pH对刺芹侧耳漆酶活力的影响
在波长620 nm 、温度30 ℃时 ,不同pH(3.8 ～
4.8)条件下对刺芹侧耳漆酶活力进行测定 ,结果
见图 2。pH 4.2 时漆酶活力最高[ 1 900 U/(min·
mL)] ,灵敏度最高 ,在其两侧漆酶活力均下降。
LSD分析结果显示:pH为 4.0 ,4.2 ,4.4时 ,刺芹侧
耳漆酶活力与其他处理比较差异极显著(P <
0.01)。因此 pH 4.0 ～ 4.4均适用于刺芹侧耳漆
酶活力的测定 ,最适 pH为 4.2。
621李艳丽等:邻联甲苯胺法测定刺芹侧耳漆酶活力的影响因素
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
图 1　温度对刺芹侧耳漆酶活力的影响
Fig.1.The effect of temperature on laccase activity of
Pleurotus eryngii
图 2　pH对刺芹侧耳漆酶活力的影响
Fig.2.The effect of pH of buffer solution on laccase
activity of Pleurotus eryngii
2.4　邻联甲苯胺浓度对刺芹侧耳漆酶活力的影
响
在波长 620 nm、温度 30 ℃、pH 4.2 时 ,考察
1 ～ 8 mmol/L 的邻联甲苯胺浓度对刺芹侧耳漆酶
活力测定的影响 ,结果见图 3。邻联甲苯胺浓度
为1 ～ 3 mmol/L 时 ,随浓度增加 ,漆酶活力基本呈
正比例增加 ,表现为一级反应;3 ～ 5mmol/L时 ,漆
酶活力增加趋势减慢 ,呈混合级反应;此后再增加
邻联甲苯胺浓度 ,漆酶活力几乎不再增加 ,表现为
零级反应。综合考虑 ,测定漆酶活力的邻联甲苯
胺的最适浓度为 5 mmol/L ,此时灵敏度最高。
2.5　刺芹侧耳漆酶酶促反应速率曲线
按上述最适条件进行刺芹侧耳漆酶活力测
定 ,考察不同反应时间(1 ～ 15 min)对漆酶活力测
定的影响 ,绘制了酶促反应速率曲线 ,结果见图
4。反应开始至 3 min 时 ,产物的吸光值随时间增
大呈正比 例上升 (线性 回归 方程 为 Y =
0.028 7 X +0.000 4 ,R 2=0.999 1),即为反应初速
度所在时间范围 。反应进行至 3.0 min以后 ,速
率上升趋势减慢 ,不再呈正比例直线 。根据酶学
原理 ,酶活力测定应在酶促反应初速度时最准确 ,
此时所受的干扰最小[ 12] ,理论上 3 min 以内均可
以进行漆酶活力测定 , 但考虑操作方便 , 选取
3 min为最佳反应时间 , 此时测得的酶活力为
3 033 U/(min·mL)。
图 3　邻联甲苯胺浓度对刺芹侧耳漆酶活力的影响
Fig.3.The effect of ortho-tolidine concentration on
laccase activity of Pleurotus eryngii
图 4　酶促反应速率曲线
Fig.4.The curve of the reaction velocity to reaction
time
3　讨　论
通过试验发现 ,波长 、温度 、pH 、邻联甲苯胺
浓度 、时间等因素对刺芹侧耳漆酶活力测定均有
较大影响 。本试验确定了测定漆酶活力的最适波
长为 620 nm ,与报道中采用的波长 600 nm[ 8-9 ,11]和
630 nm[ 7 , 10]不相同 ,这可能与漆酶来源不同有关。
对于测定最适时间的报道差异较大 ,王宜磊[ 11] 、
朱淘等[ 13]采用反应 5 min时测定 ,杨启青等[ 14]则
采用反应 30 min时测定 ,本试验根据酶学原理 ,
确定了最佳反应时间为 3 min ,减少了漆酶活力测
定过程中的干扰 ,提高了漆酶活力测定的灵敏度。
试验还发现 ,在最佳测定条件确定后测得的
622　　　吉林农业大学学报　2011年 12月
Journal of J ilin Agricultural University 2011 , December
刺芹侧耳漆酶活力达到 3 033 U/(min·mL),是未
经筛选前酶活力值[ 1 530 U/(min·mL)] 的 1.98
倍。由此可见 ,最适条件的筛选是必要的 ,它使酶
活力测定的灵敏度得到了较大幅度的提高。刺芹
侧耳漆酶可应用于众多领域 ,开发刺芹侧耳漆酶
具有广阔前景 ,本试验为刺芹侧耳漆酶的进一步
的研究和应用提供了基础理论依据 。
参考文献:
[ 1] 　Alfred M Mayer , Richard C Staples.Laccase:new functions for an
old enzyme[ J] .Phytochemistry , 2002 , 60:551-565.
[ 2] 　周攀登 ,付时雨.漆酶催化对苯基苯酚的聚合[ J] .高分子学
报 , 2004(4):614-616.
[ 3] 　邱卫华 ,陈洪章.红外光谱分析木质素在漆酶酶法改性中
的反应性[ J] .光谱学与光谱分析 , 2008 ,28(7):1501-1505.
[ 4] 　张晓昱 ,黄慧艳.漆酶在食品工业中的研究与应用进展[ J] .
食品科技 , 2003 ,(4):4-7.
[ 5] 　丁原涛 , 吴晖.漆酶及其在食品工业中的应用[ J] .食品工
业 , 2004,(3):26-27.
[ 6] 　郭美英.珍稀食用菌杏鲍菇生物学特性的研究[ J] .福建农
业学报 , 1998 , 13(3):44-49.
[ 7] 　Miller R, Kuglin J , Gallagher S , et al.Spectrophotomet ric assay
for laccase using o-tolidine[ J] .Journal of Food Biochemistry ,
1997, 21(1):445-459.
[ 8] 　Fioretto A , Papa S , Curcio E , et al.Enzyme dynamics on decom-
posing leaf litter of Cistus incanus and Myrtus communis in a
Mediterranean ecosystem[ J] .Soil Biology &Biochemistry , 2000 ,
32:1847-1855.
[ 9] 　Di Nardo C , Cinquegrana A , Papa S , et al.Laccase and peroxi-
dase isoenzymes during leaf litter decomposition of Quercus ilex in a
Mediterranean ecosystem[ J] .Soil Biology &Biochemistry , 2004 ,
36 , 1539-1544.
[ 10] 　Zsanett Laufer , Richard P Beckett , Farida V Minibayeva , et al.
Occurrence of laccases in lichenized ascomycetes of the Peltiger-
ineae[ J] .Mycological Research , 2006, 110:846-853.
[ 11] 　王宜磊.不同真菌漆酶的性质研究[ J] .生物技术 , 2003 , 13
(2):9-10.
[ 12] 　王镜岩,朱圣庚 ,徐长进 ,等.生物化学 [M] .3版.北京:高
等教育出版社 , 2002.
[ 13] 　朱淘 ,赵永芳.粗毛栓菌漆酶的分离纯化及部分性质研究
[ J] .武汉大学学报:自然科学版 , 2002 , 48(2):209-212.
[ 14] 　杨启青 ,曹支敏 ,胡景江.几种木腐菌漆酶活性的研究[ J] .
西北林学院学报 , 2003 ,18(2):58-60.
(上接第 619页)
另外 ,GAFP处理后的 SW1116细胞核中呈现出凋
亡早 、晚期的染色质变化 ,细胞周期阻滞于 G2/M
期 ,提示GAFP可能通过影响 DNA 合成及阻滞细
胞周期抑制 SW1116细胞的生长 ,但其相关作用
机制及GAFP是否具有抗肿瘤作用仍需要通过其
他试验体系 ,包括动物体内肿瘤模型和人群干预
试验予以进一步证实阐明 。
参考文献:
[ 1] 　周忠波 ,马红霞 ,图力古尔 ,等.树舌化学成分及药理学研究
进展[ J] .菌物研究, 2005 , 3(1):35-42.
[ 2] 　黄勇 ,张金亭 ,李金花 , 等.树舌菌丝体多糖 GPI 的分离 、纯
化及成分分析[ J] .中国食用菌 , 2009 ,28(3):38-39.
[ 3] 　李正鹏 ,吴萍.药用真菌树舌菌丝体多糖提取工艺研究[ J] .
安徽科技学院学报 ,2009 , 23(6):19-22.
[ 4] 　章静波.细胞生物学实验技术[M] .北京:化学工业出版社 ,
2006:57-63.
[ 5] 　张春 ,赵学梅 ,周丽 , 等.MTT 法测定低分子姬松茸多糖体
外抗肿瘤活性[ J] .齐齐哈尔医学院学报 , 2009 , 30(21):142-
145.
[ 6] 　吕金超 ,宋慧 ,苏玲 ,等.四种真菌粗多糖体外抗肿瘤作用的
初探[ J] .安徽农业科学 , 2010 , 13(5):315-318.
[ 7] 　Hatem A , Abdel-Aziz , Heba S A , et al.Microwave-assisted syn-
thesis and in-vi tro anti-tumor activity of 1 , 3 , 4-triaryl-5-N-arylpy
Razole-carboxamides[ J] .European Journal of Medicinal Chemistry ,
2010, 45(361):2427-2432.
[ 8] 　尹向前.香菇多糖的抗肿瘤活性研究[ J] .数理医药学杂杂
志 , 2009(3):337-338.
[ 9] 　Lee C L , Yang X T , Wan J M F.The culture duration affects the
immunomodulatory and ant i-cancer effect of polysaccharopeptide de-
rived f rom Coriolus versicolor [ J] .Enzyme MicrobTechnol , 2006, 38
(122):14-21.
[ 10] 　杨江苏 ,秦旭平 ,张娜 , 等.茯苓多糖对 HL-60细胞酪酸蛋
白磷酸化作用的影响[ J] .中国药学杂志 ,2000 , 35(5):303.
623李艳丽等:邻联甲苯胺法测定刺芹侧耳漆酶活力的影响因素
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University