全 文 ：doi: 10.7541/2016.73
大漂提取物抑制铜绿微囊藻的试验研究
吴 湘1 吴 昊2 钟 斌1 叶金云1
(1. 湖州师范学院生命科学学院, 浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室, 湖州 313000; 2. 湖州市环境保护监测
中心站, 湖州 313000)
摘要: 为了确定高效脱氮除磷的水生漂浮植物大漂的主要化感活性物质, 本文通过乙醇超声波提取获得大漂
的化感粗提物, 利用溶剂萃取法从粗提物中分离得到4种能抑制铜绿微囊藻(FACHB-911)生长的化感萃取物,
当其浓度均为0.1 g/L时共培养5d后抑藻率分别为40%、69%、40%、35%。将抑藻率最高的化感萃取物通过
酸性氧化铝柱层析法进一步分离纯化, 分离得到4组抑藻作用较弱的(5d后抑藻率分别为12%、11%、33%、
41%)和1组抑藻作用较强的化感层析流分(5d后抑藻率高达80%)。将抑藻作用最强的化感层析流分通过气相
色谱-质谱联用(GC-MS)方法进行成分检测, 发现大漂提取物中含有对甲苯磺酸甲酯、硬脂酸酰胺两种具有
化感潜力的化合物。
关键词: 大漂; 提取分离; 化感作用; 铜绿微囊藻; 生长抑制
中图分类号: X 52; Q 946 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2016)03-0547-05
近年来, 水生植物化感作用已广泛应用于富营
养化水体藻类控制领域, 相关研究受到国内外专家
的普遍关注[1—3]。抑藻水生植物普遍存在于水体
中, 容易获得、栽种或移植, 且数量丰富。它们一
方面能吸收水体中的营养物质, 为水中营养物质提
供输出的渠道; 另一方面它们能够分泌抑制藻类生
长的化感物质, 起到修复、净化富营养化水体的作
用[4, 5]。化感物质是水生植物生长过程中产生的次
生代谢物质, 一般能在自然条件下降解, 不会在生
态系统中长期积累, 生态安全性好[6, 7]。因此通过
研究开发高效专一的化感物质除藻剂, 可为湖泊富
营养化的生态治理探索切实可行的方法。
目前利用水生植物化感作用控制藻类, 主要集
中于沉水植物[8—10], 挺水植物[11, 12], 而对漂浮植物
的研究多集中于凤眼莲[13]、浮萍[14]等较常见的种
类。因此本实验拟选用的研究对象是具有高效脱
氮除磷的漂浮栽培植物大漂 [15](Pistia stratiotes
Linn.), 大漂系天南星科大漂属植物, 又名大藻、浮
萍、水浮莲。水浮莲味淡微辛, 性平, 无毒(根有微
毒), 既可以作为一种美化园林景观的植物, 也可以
作为家畜家禽的优选饲料。而铜绿微囊藻
(Microcystis aeruginosa)作为蓝藻水华最常见的优
势种, 对其进行有效抑藻物质的开发和研究非常有
必要。因此, 利用大漂化感物质控制铜绿微囊藻生
长并加以妥善处理和资源化利用, 既可达到有效防
控蓝藻水华污染的目的, 又能产生一定的经济效益,
从而实现水污染治理的良性循环。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大漂: 采自本地乡村河道, 挑选生长健康、大
小均一的植株进行预培养。
铜绿微囊藻(FACHB-911): 购自中国科学院水
生生物研究所。实验前采用BG-11培养基预培养铜
第 4 0 卷 第 3 期 水 生 生 物 学 报 Vol. 4 0, N o. 3
2 0 1 6 年 5 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA M a y, 2 0 1 6


收稿日期: 2015-05-11; 修订日期: 2015-11-03
基金项目: 国家自然科学基金青年科学基金项目(21207036); 湖州市生态文明先行示范区科技专项重点项目(2014ZD2019); 浙江省自然
科学基金青年科学基金项目(LQ12B07001); 浙江省重大科技专项重大农业项目(2014C02011)资助 [Supported by National
Natural Science Foundation of China (21207036); Key Project of Science and Technology Special Projects on Demonstration Area
of Ecological Civilization of Huzhou City (2014ZD2019); Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LQ12B07001);
Significant Agricultural Projects of Major Science and Technology Projects of Zhejiang Province (2014C02011)]
通信作者: 吴湘(1981—), 女, 浙江东阳人; 博士, 副教授; 主要从事利用植物化感作用控制藻类研究。E-mail: wwxx1981@126.com
绿微囊藻, 使之处于对数增长期。
1.2 试验设置与方法
大漂化感粗提物的制备 称取50 g大漂(洗
净后60℃, 干燥48h, 粉碎至50目), 放置于烧杯中,
加入100 mL无水乙醇进行超声波提取。提取结束
后, 用0.22 μm有机系滤膜过滤杂质, 后通过旋转蒸
发(100 r/min, 85℃)除去溶剂, 得到浸膏。
大漂化感粗提物的萃取分离 提取得到的浸
膏依次用乙酸乙酯、正己烷、石油醚(30—60℃)萃
取, 每种溶剂各萃取3次, 合并萃取液, 分别得到乙
酸乙酯相(Ethyl acetate phase, 简写EAP)、正己烷
相(n-hexane phase, 简写NHP)、石油醚相(Mineral
ether phase, 简写MEP)、水相(Water phase, 简写
W P ) , 然后将各有机相和水相旋转浓缩 , 再用
0.22 μm微孔滤膜进行过滤, 去除固体颗粒物, 得到
纯净浓缩液。各浓缩液用二甲基亚砜(DMSO)定容
(DMSO浓度小于1%对铜绿微囊藻生长无影响[16]),
在无菌条件下, 通过0.22 μm有机系滤膜除去微生
物于4℃冰箱保存备用。
大漂最佳抑藻化感萃取相的选择 叶绿素
a检测法:在无菌条件下, 培养皿中倒入含2%琼脂的
BG-11培养基, 冷却后切割成31 mm的小圆, 放入一
张30 mm的滤纸, 于滤纸中央滴加200 μL处于对数
生长期的藻液, 加入一定量的已定容好的有机相和
水相, 浓度为0.10 g/L密封。在温度为25℃, 光照强
度为40—60 μmol/(m2·s), 光暗比为14h∶10h的人工
气候室中培养, 3d后测定滤纸片上叶绿素a[17]的含
量, 每个提取物做3个平行; 培养液检测法: 采用培
养液法, 培养液混合体积为100 mL。其中包括一定
体积的处于对数生长期的藻液及一定体积的有机
相和水相, 每个萃取物设定3个平行, 在温度为25℃,
相对湿度为75%, 光照强度为40—60 μmol/(m2·s),
光暗比为14h∶10h的人工气候室中培养, 每隔两天
计数1次。采用显微镜计数法测定培养液的藻细胞
密度变化。
大漂最佳抑藻化感萃取相的分离提纯 将大
漂最佳抑藻化感萃取物进行柱层析法分离: 采用
Φ=26 mm, h=300 mm 层析柱, 以40 g 酸性氧化铝
(100—200目) 干法装柱, 加入待分离液1 mL (含有
100 mg样品), 进行阶段洗脱。每种洗脱剂体积都
为40 mL, 洗脱剂种类分为:W1 (石油醚∶乙酸乙酯=
100∶0, 体积比, 以下均如此)、W2 (石油醚∶乙酸
乙酯=70∶30)、W3 (石油醚∶乙酸乙酯=50∶
50)、W4 (石油醚∶乙酸乙酯=30∶70)、W5 (石油
醚∶乙酸乙酯=0∶100)。每种洗脱剂加入层析柱
后可以收集到一组洗脱流分, 每组流分都进行蒸
干、称重, 用一定量的DMSO定容, 将每组流分的
DMSO溶液进行编号(W1、W2、W3、W4、W5)。
大漂最佳抑藻化感层析流分的确定 将各层
析流分(W1、W2、W3、W4、W5)分别以一定的
浓度投放到100 mL的铜绿微囊藻培养液中, 每个流
分和对照组均设3个平行。将上述培养混合液置于
温度25℃, 相对湿度75%, 光照强度40—60 μmol/
(m2·s), 光暗时间比为14h∶10h的人工气候箱中培
养, 每隔两天计数一次, 以确定其抑藻活性。W0为
空白组, 不添加任何层析流分。根据藻密度的变化,
确定对铜绿微囊藻生长抑制作用最好的大漂化感层
析流分。同时利用含摄像装置的倒置显微镜(Motic)
观察铜绿微囊藻在最佳抑藻化感层析流分影响下
细胞形态的变化。
大漂最佳抑藻化感层析流分组成的初步鉴定
利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法对大漂最
佳抑藻化感层析流分进行主要组成的初步检测鉴
定, 从而明确大漂提取物中的有效抑藻成分。
1.3 数据统计与分析
根据藻密度计算大漂化感萃取相和层析流分
对铜绿微囊藻的相对抑制率, 计算公式为:
IR (%) = (1 – N/N0) × 100%
式中IR 为相对抑制率, N 为处理组的藻密度(个/
mL), N0 为空白对照组藻密度(个/mL)。所有样品
平行测定3次, 结果取其均值。数据采用Excel2007
软件进行统计、分析和制图。
2 结果与讨论
2.1 大漂最佳抑藻化感萃取相的选择
图 1表明大漂4种化感萃取相对铜绿微囊藻叶
绿素a含量的影响, 图 2为加入各萃取相后铜绿微囊
藻的藻密度及其相对抑制率的变化。由图 1可知,
共培养3d后各组大漂化感萃取相处理组中, 藻细胞
叶绿素a含量均出现不同程度的下降, 其中乙酸乙
图 1 大漂化感萃取相对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响
Fig. 1 Influence of each allelopathic extract from P. stratiotes on
the Chl-a contents in M. aeruginosa
548 水 生 生 物 学 报 40 卷
酯相处理组的叶绿素a含量下降最多 , 第3天比
第0天下降了66%。正己烷相处理组的叶绿素a含
量下降最少, 但也达到了38%, 可见各种大漂抑藻
化感萃取相对铜绿微囊藻叶绿素a含量都有较好的
削减作用, 而叶绿素a含量主要受光合作用的影响,
说明大漂抑藻化感萃取相可以通过影响藻细胞的
光合作用, 从而抑制藻细胞的正常生长。
根据图 2可知, 大漂的4种化感萃取相对铜绿微
囊藻的细胞增殖均有一定的抑制作用, 藻密度虽有
增加但是明显低于空白对照组 , 第3天各组的
IR%达到37%—44%, 且各组间差异不显著。而在
第5天各萃取相的IR%相差较为明显, 其中乙酸乙
酯相对藻细胞生长的抑制作用最强, IR%达到70%,
而其余3组的IR%相差不大, 介于35%—40%。综合
图 1和图 2可以发现, 大漂提取物的乙酸乙酯萃取
相对铜绿微囊藻叶绿素a和藻密度的抑制效果均为
最佳, 表现出较好的抑藻活性, 但是其中的有效抑
藻化感成分仍需进一步分离纯化。
2.2 大漂最佳抑藻化感层析流分的选择
大漂化感粗提物中抑藻作用最强的乙酸乙酯
萃取相经酸性氧化铝柱层析可以得到5个流分, 各
流分均以一定的浓度用于抑藻活性检测。图 3为投
加各层析流分后铜绿微囊藻的生长及抑制率曲
线。由图 3可知, 流分W2对藻细胞生长基本无影
响, 流分W1、W3、W4和W5均具有抑藻活性。流
分W1在第2至第4天内表现出一定的抑藻作用, 但
是第5天藻细胞即开始恢复正常生长, 其原因可能
是流分W1中的有效抑藻物质随着时间逐渐被降解,
失去了抑藻活性。而流分W4和W5的抑藻效果在
实验期间表现较好, 第5天的IR%分别可达45%和
81%, 尤其是流分W5, 因此可确定其为大漂最佳抑
藻化感层析流分, 但是W5的具体组成仍有待进一
步的分析和鉴定, 以明确大漂提取物中的有效抑藻
化感成分。
2.3 大漂最佳抑藻化感层析流分对藻细胞形态的
影响
洪喻等[16]研究发现, 铜绿微囊藻在投加芦竹化
感物质后启动了多种拮抗途径应对化感物质的胁
迫, 譬如藻细胞空洞化、色素减褪、细胞聚团、体
积减小等。而根据本实验的研究结果(图 4A)同样
发现, 在大漂最佳抑藻化感层析流分的胁迫下, 铜
绿微囊藻的藻细胞开始抱团缩小体积, 推测这是由
于藻细胞受到刺激, 自发的一种自我保护机制。铜
绿微囊藻细胞通常在人工培养条件下主要是以单
细胞形式存在;而在自然条件下则主要是以群体形
式存在[18]。野外采集到的微囊藻细胞经过纯化后
由群体型转变为单细胞[19]。当微囊藻以单细胞存
在时, 在外界的环境的胁迫作用下导致藻细胞活性
降低或死亡, 而群体藻细胞则能抵御抑制作用, 保
持活力。因此, 当化感物质作用于微囊藻细胞时,
个体细胞聚集成群来抵御化感物质的抑制作用。
而从图4B中还能看出, 在大漂最佳抑藻化感层析流
分的作用下, 铜绿微囊藻的藻细胞出现破碎现象,
其破碎原因还有待进一步研究。
图 2 大漂化感萃取相对铜绿微囊藻生长(藻密度)及抑制率的影响
Fig. 2 Influence of each allelopathic extract from P. stratiotes on the growth (algal density) and inhibition rate of M. aeruginosa
图 3 大漂抑藻化感层析流分对铜绿微囊藻生长(藻密度)及抑制率的影响
Fig. 3 Influence of each antialgal allelopathic fraction from P. stratiotes on the growth (algal density) and inhibition rate of M. aeruginosa
3 期 吴 湘等: 大漂提取物抑制铜绿微囊藻的试验研究 549
2.4 大漂最佳抑藻化感层析流分组成的初步鉴定
根据图 5分析, 抑藻效果最佳的W5层析流分通
过GC-MS方法分析鉴定, 检测出其中含有多种化合
物。但是由于样品纯度不够高, 导致结果仅能鉴定
出两种主要的化合物, 即22.9min时检测出的对甲
苯磺酸甲酯和32.105min时检测出的硬脂酸酰胺。
已有研究表明酯类酰胺类为常见植物化感物质类
型[20], 故推测大漂层析流分中检出的对甲苯磺酸甲
酯和硬脂酸酰胺可能具有植物化感作用, 而其余成
分还需进一步地对样品进行分离纯化和检测分析
以获得确认。
3 结论
(1) 利用不同有机溶剂对大漂粗提物依次进行
萃取, 结果表明, 乙酸乙酯萃取相对铜绿微囊藻的
生长抑制作用最明显, 5d后其抑藻率高达69%, 由
此可确定其为大漂最佳抑藻化感萃取相。
(2) 将乙酸乙酯萃取相经酸性氧化铝柱层析法
分离得到5个层析流分, 其中W5流分对铜绿微囊藻
的生长抑制作用最强, 5d后其抑藻率高达80%, 由
此可确定其为大漂最佳抑藻化感层析流分。
(3) 大漂最佳抑藻化感层析流分中含有强极性
的抑藻物质, 通过GC-MS法检测发现, 大漂提取物
中含有对甲苯磺酸甲酯和硬脂酸酰胺两种具有抑
藻化感潜力的组分, 其余成分有待进一步分离纯化
和分析鉴定。
参 考 文 献:
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图 4 大漂最佳抑藻化感层析流分对铜绿微囊藻藻细胞形态的影响(A. 抱团; B. 破壁)
Fig. 4 Influence of the strongest antialgal allelopathic fraction from P. stratiotes on the morphological change of M. aeruginosa (A.
agglomeration; B. broken)
图 5 GC-MS法检测大漂最佳抑藻化感层析流分图谱
Fig. 5 The illustrative picture of the strongest antialgal
allelopathic fraction from P. stratiotes detected by using GC-MS
method
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(1. Zhejiang Province Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development, College of Life Sciences, Huzhou
University, Huzhou 313000, China; 2. Huzhou Environmental Protection Monitoring Centre Station, Huzhou 313000, China)
Abstract: The current study obtained four different allelopathic crude extracts from Pistia stratiotes Linn, a aquatic
floating plant with higher efficiency on nitrogen and phosphorus removal, using ethanol ultrasonic extraction. These
four, allelopathic extracts (0.1 g/L) inhibited the growth of Microcystis aeruginosa (FACHB-911) for 40%, 69%, 40%
and 35% after 5 days treatment, respectively. Extracts were further purified through the method of acidic alumina
column chromatography separation, which had inhibition rates 12%, 11%, 33 and 41% after 5 days treatment, respec-
tively. Interestingly, one group of allelopathic fraction had 80% inhibition rate after 5 days treatment. The results of gas
chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis revealed that the extracts from P. stratiotes mainly contained
two antialgal compounds including P-toluene sulfonic acid methyl ester and stearic acid amide.
Key words: Pistia stratiotes Linn.; Extraction and separation; Allelopathy; Microcystis aeruginosa; Growth inhibition
3 期 吴 湘等: 大漂提取物抑制铜绿微囊藻的试验研究 551