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猴头菌中三种脂肪酸含量HPLC-ELSD测定方法的建立



全 文 :食用菌学报2015.22(4):65~69
收稿日期:2015-05-25原稿;2015-07-13修改稿
基金项目:广东省科技计划项目(2012A020100010)、国家科技支撑计划(2013BAD16B00)、广东省微生物研究所南
粤微生物优秀人才计划、农业科技成果转化资金项目(2013GB2E000360)资助
作者简介:郑超群(1991-),男,硕士,主要从事中药炮制现代化与中药饮片质量标准化方面研究。
*本文通讯作者 E-mail:xieyizhen@126.com
DOI:10.16488/j.cnki.1005-9873.2015.04.013
猴头菌中三种脂肪酸含量HPLC-ELSD测定方法的建立
郑超群1,2,陈地灵2,3,柯志意2,4,陈 康1,谢意珍2,3*,胡惠萍2,3
(1广州中医药大学中药学院,广东广州510006;2省部共建华南应用微生物重点实验室,广东广州510007;
3广东省微生物研究所,广东广州510007;4华南师范大学药物研究院,广东广州510631)
摘 要:建立猴头菌(Hericium erinaceus)子实体中棕榈油酸(palmitoleic acid)、异油酸(vaccenic acid)、软脂
酸(palmitic acid)的高效液相色谱-蒸发光散射检测(high performance liquid chromatography-evaporative
light-scattering detector,HPLC-ELSD)方法。采用Grace Prevail Organic Acid 5μm(250mm×4.6mm)色
谱柱[流动相为乙腈-甲醇(80∶20),柱温30℃,流速1.0mL/min]和ESA Chromachem蒸发光散射检测器
[雾化温度(TNeb)35℃,蒸发温度(TEvap)50℃,衰减值(Attenuation)为3,载气为N2,操作气压为21psi],获得
棕榈油酸、异油酸、软脂酸标准品的线性回归方程分别为Y=0.4982 X +10.1120(r=0.9998)、Y=0.8270 X
+9.7457(r=0.9998)、Y=1.1316 X +10.3790(r=0.9997);平均回收率分别为99.89%、100.68%和
101.00%,RSD分别为1.26%、2.04%和1.72%。该方法可同时测定猴头菌中棕榈油酸、异油酸、软脂酸3种
脂肪酸类化合物,且结果准确、重现性好、操作简便。
关键词:HPLC-ELSD;猴头菌;脂肪酸
  猴头菌(Hericium erinaceus)又名猴头菇、猴头
蘑、刺猬菌等,含有丰富的营养成分[1],其中棕榈油
酸、异油酸和软脂酸等多种脂肪酸总量占干品约
3%[2]。脂肪酸类成分一直是近年来营养生化研究
的热点,不饱和脂肪酸类成分在细胞膜功能调
节[3-4],抗心血管疾病[5-6]和生长发育的调节[7-8]等
方面起着重要作用;而饱和脂肪酸类成分也是心血
管疾病产生[9]和细胞凋亡[10]的重要诱因。然而现
阶段对猴头菌研究主要还是集中在其多糖和甾醇
类成分上,对其脂肪酸的研究较少。
脂肪酸类成分是一类不含生色团且紫外吸
收不大的物质,传统的检测方法是将脂肪酸衍生
为易挥发的脂化物,采用气相(GC)或气质联用
(GC-MS)法进行检测,然而衍生过程中存在的副
反应和反应不完全的问题常常影响脂肪酸的检
测;采用 HPLC配合紫外检测器、示差检测器和
电化学检测器可直接检测脂肪酸及其衍生物,但
无法采用梯度洗脱,从而一定程度上影响了上述
方法的灵敏度和分离效果[11-13]。高效液相色谱-
蒸 发 光 散 射 检 测 (high performance liquid
chromatography-evaporative  light-scattering
detector,HPLC-ELSD)是近年来兴起的一种检
测技术,它适用于多种物质的检测,包括类脂、糖
类、氨基酸、表面活性剂、高聚物等[14]。采用高效
液相色谱-蒸发光散射检测器检测脂肪酸类化合
物时,脂肪酸不需要衍生的过程,并且洗脱条件
可采用梯度洗脱。与其他方法相比,蒸发光检测
物质时基线能够保持平稳且灵敏度高,具有分析
时间短和方法简单的特点[15-16]。
笔者进行研究,旨在建立猴头菌中棕榈油酸、
异油酸、软脂酸等脂肪酸含量HPLC-ELSD测定方
法,为食用菌中相关脂肪酸的检测提供参考。
1 材料与方法
1.1主要试剂与仪器
    棕 榈 油 酸 (palmitoleic acid)、异 油 酸
(vaccenic acid)、软脂酸(palmitic acid)对照品批
号分别为 U-40A-A2-Y、U-48A-N13-X、N-16A-
MA14-W,均来自NU-CHEKPREP公司(美国);
石油醚(批号:20131201-2)为广州试剂厂产品;
食 用 菌 学 报 第22卷
HPLC级乙腈(批号:1742630426)及 HPLC级甲
醇(批号:1744707429)均为德国默克股份两合公
司产品。
高效 液 相 色 谱 仪 (Agilent 1200series,
Agilent公司,美国)、检测器(Chromachem蒸
发光散射检测器,ESA 公司,意大利)和 N3000
色谱数据工作站。
1.2试验材料
  猴头菌(H.erinaceus)菌株 AC-E141436、
AC-M140178、AC-W140461为广东省微生物研
究所食用菌中心保存菌株。试验子实体为供试
菌株按文献[17]方法栽培获得。
1.3检测方法
1.3.1色谱条件
  色谱柱:Grace Prevail Organic Acid 5μm(250
mm×4.6 mm)色谱柱,流动相为乙腈-甲醇(80∶
20),柱温30℃,流速为1.0mL/min。检测器:
ESA Chromachem蒸发光散射检测器,雾化
温度(TNeb)35℃,蒸发温度(TEvap)50℃,衰减值
(Attenuation)为 3,载 气 为 N2,操 作 气 压 为
21 psi。
1.3.2样品溶液制备
  猴头菌子实体干品用粉碎机粉碎,过40目
筛,精密称取1.0g,加入150mL石油醚,索式提
取6h(85℃)。提取液置于通风厨内自然挥干,
残留物加流动相溶解,并定容至5mL量瓶中,摇
匀,过0.22μm滤膜,即得供试品溶液。
1.3.3混合对照品溶液制备
  100 mL量瓶加入对照品棕榈油酸、异油酸、
软脂酸和流动相乙腈-甲醇(80∶20),得棕榈油酸、
异油 酸 和 软 脂 酸 浓 度 分 别 为 0.5、0.3 和
0.2 mg/mL的混合溶液,即得所需混合对照品溶
液。混合对照品及猴头菌供试品(AC-W140461)
HPLC-ELSD检测图谱如图1。
图1 混合对照品(A)和猴头菌样品AC-W140461(B)的HPLC-ELSD图
Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed reference compounds(A)and sample AC-W140461(B)
1.4方法学考察
1.4.1线性关系考察
  分别精密移取混合标准品溶液5.0、4.0、
3.0、2.0、1.0和0.5mL于10mL量瓶中,用流
动相稀释至刻度,摇匀,过0.22μm滤膜,进样
20μL,每个浓度进样3次,记录色谱图数据。
以进样量(μg)为 X 轴,3次进样峰面积积分值
平均数的对数值为 Y 轴,分别进行线性回归
分析。
1.4.2精密度试验
  取1.3.3制作的混合对照品溶液,每次进样
20μL,重复进样6次。分别记录棕榈油酸、异油
酸和软脂酸的峰面积,并计算RSD值。
1.4.3重复性试验
  取1.3.2制备的同一供试品溶液6份,进样
20μL,记录样品中棕榈油酸、异油酸和软脂酸的
峰面积,计算RSD值。
1.4.4稳定性试验
  取1.3.2制备的样品溶液,室温放置0、2、4、
8、12、24 h后,分别进样20μL分析,记录棕榈油
酸、异油酸和软脂酸的峰面积,并计算RSD值。
1.4.5加样回收率试验
  取已知含量的样品平均分成6等份,按
“1.3.2”方法制备供试品溶液,精密加入分别与
样品中棕榈油酸、异油酸和软脂酸含量相等的对
照品,再按“1.3.1”项下色谱条件测定,进样量为
20μL,测 定 峰 面 积,分 别 计 算 平 均 回 收 率
和RSD。
1.5样品含量测定
  取猴头菌子实体样品,按1.3.2法制备供试
品溶液,按上述色谱条件进样,分别测得棕榈酸、
异油酸、软脂酸峰面积,通过标准曲线计算得3
66
第4期 郑超群,等:猴头菌中三种脂肪酸含量 HPLC-ELSD测定方法的建立
个样品中棕榈酸、异油酸、软脂酸的含量。
2 结果与分析
2.1线性关系考察
  高效液相色谱-蒸发光散射检测棕榈油酸、软
脂酸及异油酸的回归方程及线性范围结果见表
1。在试验质量浓度范围内,浓度与峰面积呈良
好的线性关系。
表1 HPLC-ELSD法检测棕榈酸、异油酸和软脂酸线性关系
Table 1 Linear concentration ranges for palmitoleic,vaccenic and palmitic acids determined using HPLC-ELSD
成分
Compound
线性范围
Linear concentration range(μg/mL)
回归方程
Regression equation

棕榈油酸
Palmitoleic acid
0.05~0.50  Y=0.4982 X+10.1120  0.9998
异油酸
Vaccenic acid
0.03~0.30  Y=0.8270 X+9.7457  0.9998
软脂酸
Palmitic acid
0.02~0.20  Y=1.1316 X+10.3790  0.9997
2.2精密度、重复性和稳定性
  混合对照品溶液重复进样6次,棕榈油酸、
异油酸和软脂酸峰面积的RSD分别为1.41%、
0.90%和1.46%,表明在此试验条件下精密度良
好。6份同一供试品溶液测得的棕榈油酸、异油
酸和软脂酸峰面积的 RSD 分别为 1.33%、
1.26%和1.36%,表明该方法重复性良好。6个
不同放置时间的样品,测得的棕榈油酸、异油酸、
软脂酸峰面积的RSD分别为1.10%、1.97%和
1.79%,表明供试品溶液中棕榈油酸、异油酸和
软脂酸在24h内比较稳定。
2.3加样回收率试验
  棕榈油酸、异油酸和软脂酸平均回收率为
99.89%、100.68% 和 101.00%,RSD 分别为
1.26%、2.04%和1.72%(见表2)。表明该方法
准确、可靠,可用于猴头菌中棕榈油酸、异油酸和
软脂酸含量测定。
2.4样品脂肪酸含量测定结果
  3个供试样品中脂肪酸含量测定结果见表3,
不同菌株间脂肪酸含量差异较大,菌株 AC-
W140461中3 种脂肪酸含量皆最高,而 AC-
M140178样品中异油酸的含量比其他两个样品低
很多(P<0.01);ACW140461软脂酸含量与其他
两个样品相比具有显著性差异(P<0.01)。提示
不同菌株猴头菌的各种脂肪酸含量有较大差异。
表2 加样回收率试验结果
Table 2 HPLC-ELSD recovery rates for palmitoleic,
vaccenic and palmitic acids
成分
Compound
平均回收率
Average recovery
rate(%)
RSD
(%)
棕榈酸
Palmitoleic acid
99.89  1.26
异油酸
Vaccenic acid
100.68  2.04
软脂酸
Palmitic acid
101.00  1.72
数据为6个重复的平均值
Values are the means of six determinations
表3 猴头菌子实体样品中脂肪酸含量测定结果
Table 3 Palmitoleic,vaccenic and palmitic levels in H.erinaceus fruit body samples
样品
Sample
棕榈油酸
Palmitoleic acid(mg/g)
异油酸
Vaccenic acid(mg/g)
软脂酸
Palmitic acid(mg/g)
AC-E141436  1.20±0.039  0.68±0.023** 0.12±0.002
AC-M140178  1.29±0.043  0.20±0.007  0.12±0.003
AC-W140461  1.38±0.041  0.73±0.028** 0.30±0.010**
**0.01水平差异显著
**represent a significant difference at P0.01
76
食 用 菌 学 报 第22卷
3 讨论
  流动相的选择中,曾尝试采用乙腈(A)-甲醇
(B)线性梯度洗脱(0~30min,B%:20~40)和恒
定比例流动相的乙腈∶甲醇(80∶20,70∶30,
60∶40)等度洗脱,发现乙腈-甲醇比例为80∶20
时,供试品各峰的分离度较大,信噪比低,并且与
梯度洗脱效果相当,综合考虑选定乙腈-甲醇
(80∶20)作为流动相等度洗脱;由于流动相都为
有机溶剂(无水),且沸点<80℃,参照检测器最
优设定推荐并结合实际效果进行调整,发现雾化
温度(TNeb)为35℃,蒸发温度为(TEvap)50℃时
信噪比较好,基线平稳;操作气压对检测器的灵
敏度和重复性至关重要,在操作气压21psi时基
线平稳、灵敏度较优;衰减值(Attenuation)为3
时,杂峰较少,并且峰型较好。
脂肪酸在食用菌中所占的比例较小,但与
其他食品相比,其总脂肪酸中不饱和脂肪酸所
占比例较高[18]。脂肪酸常用的定量检测方法主
要为 气 相 法 和 高 效 液 相 色 谱-示 差 检 测 器
(HPLC-RID)检测法[19]。气相法要求检测物质
要有挥发性,所以待检测脂肪酸必须要经过衍
生化转变成挥发性物质,该法误差较大[20]。
HPLC-RID检测法条件较苛刻,且灵敏度也相
对较低[21]。HPLC-ELSD定量检测法的流动相
采用等梯度洗脱,样品可直接检测,稳定、灵敏,
且均能在15min内完全出峰,并能同时测定猴
头菌中棕榈油酸、异油酸和软脂酸3种脂肪酸
类化合物。
本实验建立的猴头菌中3种脂肪酸含量
HPLC-ELSD测定方法可用于猴头菌中棕榈油
酸、异油酸、软脂酸含量的测定,具有结果准确、
重现性好、操作简便、快速等优点,可为食用菌脂
肪酸的研究提供一定的参考和借鉴。
参考文献
[1]张鹏,图力古尔,包海鹰.猴头菌属真菌化学成分及
药理活性研究概述[J].菌物研究,2011,9(1):
54-62.
[2]洁莉.猴头菌药效成分研究和猴头菌属的分子生物
学鉴定[D].南京:南京师范大学,2002.
[3]岳崟,叶诚,郑冬冬,等.多不饱和脂肪酸对大鼠大
脑细胞膜脂肪酸组成的影响[J].中国酿造,2014,
33(1):36-39.
[4]LENNEN  RM, PFLEGER  BF. Modulating
membrane composition alters free fatty acid tolerance
in Escherichia coli [J]. PLoS One,2013,8
(1):e54031.
[5]李忠东,尹荣,朱家全,等.n-3多不饱和脂肪酸对
心脏移植物血管病变的影响[J].中国组织工程研究
与临床康复,2010,14(5):833-837.
[6]田国祥.血糖代谢障碍患者补充n-3脂肪酸对心血
管转归的影响[J].中国循证心血管医学杂志,2012,
4(4):339-340.
[7]许友卿,庄丽,丁兆坤.多不饱和脂肪酸对海水仔稚
鱼生长发育的影响及机理[J].饲料工业,2010,31
(14):13-18.
[8]CARNIELLI VP,SIMONATO M,VERLATO G,
et al.Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty
acids in preterm newborns fed formula with long-
chain polyunsaturated fatty acids[J].Am J Clin
Nutr,2007,86(5):1323-1330.
[9]钟伟,廖雪梅.脂联素与动脉粥样硬化及其危险因
素的相关研究进展[J].疑难病杂志,2013,12(6):
480-483.
[10]曹洁.饱和脂肪酸诱导内质网应激对肝细胞脂毒性
凋亡的作用和机制探讨[D].重庆:重庆医科大
学,2013.
[11]KOBAYASHI N,NOEL EA,BARNES A,et al.
Rapid detection and quantification of triacylglycerol
by HPLC-ELSD in Chlamydomonas reinhardtii and
Chlorella strains[J].Lipids,2013,48(10):
1035-1049.
[12]杨必成,刘海,杨义芳,等.HPLC-ELSD测定油菜
花粉抗前列腺增生活性部位中4种脂肪酸类化合物
[J].中草药,2012,43(10):1967-1970.
[13]刘涛,尹春华,谭天伟.高效液相色谱-蒸发光散射
检测器测定脂肪酸和甘油酯的含量[J].中国油脂,
2005,30(9):50-53.
[14]魏泱,丁明玉.蒸发光散射检测技术[J].色谱,
2000,18(5):398-401.
[15]钱生勇,顾湘.HPLC-ELSD法测定不同产地小茴
香中亚油酸含量[J].药学与临床研究,2014,18
(5):422-423.
[16]王新雨,郑晓媚,谭晓梅.HPLC-ELSD法同时测
定九香虫中的亚油酸、油酸及软脂酸[J].中成药,
2015,(7):1522-1525.
[17]吴清山.猴头菇高效栽培关键技术[J].北方园艺,
2014,38(18):161-163.
[18]张碧波,冉烈.食用菌脂肪酸成分研究[J].西南农
业大学学报(自然科学版),2005,27(2):277-279.
[19]朱业晋,张旻杰.HPLC-ELSD在药物分析中的应
86
第4期 郑超群,等:猴头菌中三种脂肪酸含量 HPLC-ELSD测定方法的建立
用进展[J].赣南师范学院学报,2003,24(6):
39-41.
[20]韩瑞丽,马健,张佳程,等.HPLC-ELSD与 GC-
MS法测定牛乳甘油三酯sn-2位脂肪酸组成[J].
分析测试技术与仪器,2009,15(1):30-34.
[21]余晓芬,刘英丽,程珊影,等.麦糟水解液中单糖
及脂肪酸的 HPLC分析[J].华侨大学学报(自然科
学版),2007,28(4):403-405.
Determination of Palmitoleic,Vaccenic and
Palmitic Acid Levels in Petroleum Ether Extracts of
Hericium erinaceus Fruit Bodies UsingHigh Performance
Liquid Chromatography-Evaporative Light-ScateringDetector
ZHENG Chaoqun1,2,CHEN Diling2,3,KE Zhiyi 2,4,CHEN Kang1,
XIE Yizhen2,3*,HU Huiping2,3
(1 Colege of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou,
Guangdong 510006,China;2State Key Laboratory of Applied Microbiology,South China,Guangzhou,Guangdong
510070,China;3 Guangdong Institute of Microbiology,Guangzhou,Guangdong 510070,China;4Southern
Institute of Pharmaceutical Research,South China Normal University,Guangzhou,Guangdong 510631,China)
Abstract:A High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light-Scattering Detector (HPLC-
ELSD)system that was simple,accurate and exhibited good reproducibility,was used to determine
palmitoleic,vaccenic and palmitic acid levels in petroleum ether extracts of Hericium erinaceus fruit bodies.
The system employed a Grace Prevail Organic Acid 5μm analytical column(250mm×4.6mm,column
temperature 30 ℃)and acetonitrile∶methanol(80∶20,flow rate 1.0 mL/min)as the mobile phase.
Operating conditions for the ESA Chromachem ELSD system were as folows:nebulization temperature
(TNeb)35 ℃,evaporation temperature(TEvap)50 ℃,attenuation 3,carrier gas N2,carrier gas pressure
21psi.Linear concentration ranges and average recovery rates for palmitoleic,vaccenic and palmitic acids
were 0.05~0.50μg/mL (r=0.9998),0.03~0.30μg/mL (r=0.9998)and 0.02~0.20μg/mL (r=
0.9997)respectively,and 99.89% (RSD=1.26%),100.68% (RSD=2.04%)and 101.00% (RSD=
1.72%),respectively.
Key words:HPLC-ELSD;Hericium erinaceus;fatty acid determination
[本文编辑] 于荣利
96